专利名称：：抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药基因mecR1/mecA和blaR1/blaZ的反义核酸序列及其制备含有该反义核酸序列的药物及其用途。
背景技术：
：目前细菌耐药问题在全球范围内己经愈演愈烈，许多曾经可以治愈的细菌感染性疾病正在成为难以治愈的疾病。MRSA是医院内感染和社区感染的重要致病菌，自1961年首次发现MRSA以来，特别是80年代后，MRSA感染率在大部分地区均呈明显上升趋势，如在美国MRSA的感染率从1974年的2%增至2003年的接近60%，30年来几乎增加了30倍；意大利从1981年的6%上升到1996的26%。随着MRSA感染率的不断提升，其致死率也迅速上升，英国统计资料显示，1993年至2002年间MRSA致死率提高了15倍，一旦全身感染其致死率高达50%以上。MRSA具有多药耐药性，它不仅对几乎所有P-内酰胺类抗生素耐药，而且对头孢菌素类、氨基糖甙类、四环素类、大环内酯类、氟喹喏酮类、磺胺类等多种抗生素耐药，因此使很多临床上有效的抗生素失效，大大限制了医生们的用药，除了糖肽类的万古霉素和考拉替宁外几乎无药可用。但1996年日本报道了第一例对万古霉素敏感性下降的MRSA(MIC=8ug/ml)，当时就有专家预言VRSA的出现只是一个时间上的问题，不出所料2002年6月美国公布了第一例VRSA(万古霉素MIC=128pg/ml)。尽管现在VRSA的检出率仍不高，但它的出现必将为MRSA的治疗带来更大的困难，应受到高度重视，以防有朝一日使MRSA的治疗面临无药可用的境地。因此，寻找有效对抗MRSA耐药性的药物作用新耙点及药物成为研究者们关注的焦点之一。金黄色葡萄球菌产生耐药性的机制主要有以下两种1.生成P-内酰胺酶，使卩-内酰胺环裂开导致p-内酰胺类抗生素水解失活，P-内酰胺酶由基因blaZ编码；2.生成新的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，细菌的细胞壁上存在着粘肽合成酶即青霉素结合蛋白(PBPs)，PBPs是P-内酰胺类抗生素的作用靶点。MSSA有5禾中PBPs，分另ij为PBP1(87KDa)，PBP2(80Kda)，PBP3(75Kda)，PBP3'(70Kda)及PBP4(41Kda)，而MRSA比MSSA多产生了一禾中78KDa的PBP2a，PBP2a的功能相当于MSSA全部主要PBPs的功能，并且与P-内酰胺类抗生素亲和力极低，在此类抗生素存在的情况下仍能完成细菌细胞壁的合成，而失去对P-内酰胺类抗生素的敏感性。表达PBP2a的结构基因是mecA。调控MRSA耐药基因表达的信号通路已被揭示，其中两类基因(BlaZ和mceA)及其表达产物参与了金黄色葡萄球菌耐药性的产生。blaZ和mceA的表达受到感受器/传感器蛋白BlaR1、MecR1及与其相耦联的抑制蛋白Blal、Mecl的调控。BlaR1和MecR1具有同源性，均为跨膜蛋白，它们胞外部分为感受器结构域，含有青霉素结合模序。细胞内为传感器结构域，该序列具有裂解Blal及Mecl的功能。当诱导剂P-内酰胺类抗生素结合到BlaR1的感受器结构域，BlaR1被激活，其转换器结构域内的锌金属蛋白酶序列裂解Blal，使Blal从BlaZ的启动子区域解离，去除对BlaZ的阻遏作用，导致了BlaZ开始表达。mceA基因的表达由相似的感受器/转换器蛋白和阻遏系统调控。调控基因blaR1和mecR1在耐药基因BlaZ和mceA的表达中发挥着至关重要的作用。以基因为耙点的药物中，最有应用前景的可能是反义核酸药物，因为与传统药物比较反义核酸药物具有高特异性、高选择性的特点。反义寡聚核苷酸可干扰遗传过程的多个阶段①抑制转录，反义寡聚核苷酸同靶双链DNA依据碱基配对原则，形成T-A-T、C-G-C三联体(Triplex)。反义寡聚核苷酸可能结合于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，通过定点切割或位阻效应阻止基因的转录；②抑制转录后加工，反义寡聚核苷酸可通过空间阻遏作用影响mRNA前体在核内加工过程，包括加帽、切除内含子、剪接、加尾、碱基修饰等，也阻止了mRNA向胞浆的转运；③抑制翻译，与mRNA翻译起始部位和核糖体结合位点发生特异结合，形成RNA/DNA双链，由于空间位阻效应而阻止核糖体与起始因子结合或者激活核糖核酸酶RNaseH，RNaseH能特异性切割并水解RNA-DNA异源双链分子中的mRNA而使其失活，mRNA被水解后，其翻译不能起动。10-23型脱氧核酶除了与底物特异性结合而抑制底物外，还能直接剪切RNA。一个脱氧核酶分子可反复利用，即可剪切多个RNA分子。另外脱氧核酶合成容易，有更多可供选择的剪切靶位，在体内更加稳定。脱氧核酶不仅可以像核酶那样直接杀伤靶RNA，而且还有可能像反义寡核苷酸那样引发RNaseH对靶RNA的水解。第一个反义核酸药物Fomivirsen上市后，人们对反义疗法更为重视。反义核酸药物在防治肿瘤、病毒性感染、心血管疾病和自身免疫性疾病等方面均有重要意义。如今，反义寡聚核苷酸和脱氧核酶作为新型的基因治疗药物己经被广泛应用于病毒、肿瘤、遗传性疾病中。现在国外已经有多种反义药物进入I、II期临床试验阶段，可望在不久的将来正式用于临床。并非mRNA上所有的位点都可以作为反义核酸的作用靶点，主要因为RNA在体内不是以单链形式存在，而是具有一定的二级结构，因此RNA的二级结构、RNA结合蛋白或杂交的RNA都会对反义核酸、核酶和脱氧核酶造成影响。为了避免二级结构对反义核酸的影响，本发明需要预测RNA的二级结构，避免内部稳定的结构和空间位置相距较远的碱基，挑选一些不稳定的部位，如发夹、内部环、膨胀环、多分支环等。目前反义核酸的设计仍没有国际统一的标准，通常人们利用一些计算机软件分析靶基因结构进行辅助设计。RNAstructure软件就是其中应用较多的一种，它可按照自由能最低原理，理论上预测目的基因RNA的二级结构，计算反义寡核苷酸与各耙点结合时的能量变化。反义药物的设计是否合理，不仅取决于序列自身的自由能，而且取决于靶位的自由能，两者之间的自由能。通常他们的负值越低，越稳定，不是良好的耙位点。因而根据反义核酸与靶序列结合的净能量(OverallAG)、反义核酸与直链靶序列结合所需要的能量(DuplexAG或BindingAG)、反义核酸-靶序列结合后碱基从耙序列断裂需要的能量(BreaktargAG)、反义核酸内结合所需要的能量(oligo-selfAG)、反义核酸间结合所需要的能量(oligo-oligoAG)和核酸-靶序列解链的温度(Tm)等项参数，把反义靶点选在二级结构的不稳定区域，从而使反义核酸与靶位点牢固结合。根据MatveevaOV.(MatveevaOV.等人.NucleicAcidsRes.31，4989-4994，2003)禾口CairnsM丄(CafrnsM丄等人.NatBiotechnol.17,480-486,1999)等文献,以上参数最佳范围为OverallAG<-10kcal/mol，DuplexAG<-25kcal/mol，oligo國selfAG》-1.1kcal/mol，oligo-oligoAG》-8kcal/mol，Tm^5(TC。
发明内容本发明的目的是提供抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸，该序列为一段人工合成的核苷酸序列，它与MRSA耐药基因mecR1/mecA或blaR1/blaZ的特定位点序列是互补的。因此，将一定剂量本发明所述的反义硫代寡聚脱氧核苷酸或硫代脱氧核酶转递至MRSA菌体内，该类反义核酸能够与靶基因的特定位点结合，从而抑制耐药基因的表达，使MRSA恢复对内酰胺类抗生素的敏感性，从而达到有效对抗MRSA耐药性的目的。'本发明的目的是这样实现的，设计一种抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸，它包括反义硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs)和硫代脱氧核酶(PS-DRz)，其特征在于可特异性与MRSA耐药基因mecR1/mecA、blaR1/blaZ的不同区域结合，阻断这些耐药基因的表达，其反义核酸的碱基序列如下反义核酸筛选出的作用耙位点最佳核酸序列(5'—3')PS-ODNs01基因mecR1的35~124位ATCACTCTTACGAGATATPS-ODNs02基因mecR1的137-155位GAGCAGAGGTGCAATTAAPS-ODNs03基因mecR1的216~299位ACATAGACTGTGCTGAAGPS-ODNs04基因mecR1的379~605位CGTCAAGATGTTTTTCGTPS-ODNs05基因mecR1的717-755位CTACCTGTTACTGACACTPS-ODNs06基因mecR1的834~915位GTATTTATTACACCGTCGPS-ODNs07基因mecR1的985~1136位TTACTTGCCCTCGTTCGAPS-ODNs08基因mecR1的1207~1301位TGTTGTTACCCTATTTGTPS-ODNs09基因mecR1的1326-1434位ATTCTGTTCTACTCCAATPS-ODNs10基因mecR1的1550~1701位ACCTTGTCCTTAGCACTTPS-ODNs11基因blaR1的13~141位TCCTGCAAGAAGAGTTPS-ODNs12基因blaR1的185~297位GTGGGCGCTTGATTATPS-ODNs13基因blaR1的357417位AGTGACTGIIICTTTAPS-ODNs14基因blaR1的557~632位GTCIIIIGTCAATTACPS-ODNs15基因blaR1的958~1051位CGTTGTGTAAGGGCTTPS-ODNs16基因blaR1的1122~1304位TCTTGTTCCTTATTCC6PS-ODNs17基因blaR1的1349~1377位TGAGTTGAGTCGCAGTPS-ODNs18基因blaR1的1471~1491位ATGGTTATTTTGTTCCPS-ODNs19基因blaR1的1562~1627位TGTACCTGTTTTCCCAPS-ODNs20基因blaR1的1679~1732位ATTCAGCATTTTTCCCPS-DRz21基因mecR1的1683~1702位CATTCGCAGGCTAGCTACMCGATGTCTTCGCCTPS-DRz22基因mecR1的217~236位CTAACCGAAGAAGGGCTAGCTACAACGACGTGTCPS-DRz23基因mecR1的1681~1698位CGCATTGGGCTAGCTACAACGAC丌CGCCTTTPS-DRz24基因mecR1的1683~1700位TTCGCA丌GGGCTAGCTACAACGAC丌CGCCTPS-DRz25基因mecR1的1681~1700位丌CGCA丌GGGCTAGCTACAACGACTTCGCCTTTPS-DRz26基因mecR1的1683~1703位CCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTC丌CGCCTPS-DRz27基因mecR1的1683~1704位GCCA丌CGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCCTPS-DRz28基因mecR1的1685~1705位CGCCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTC丌CGCPS-DRz29基因mecR1的1687~1706位TCGCCATTCGGGCTAGCTACAACGAA丌GTCTTCPS-DRz30基因mecR1的1685~1706位TCGCCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTC丌CGCPS-DRz31基因blaR1的1359~1378位GCTTGAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTAPS-DRz32基因blaR1的201--219位CTTACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz33基因blaR1的201--220位AC丌ACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz34基因blaR1的201--221位GACTTACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS陽DRz35基因blaR1的201--222位TGAC丌ACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz36基因blaR1的732~750位AAGGACAAAGGCTAGCTACAACGACTATCGGCTPS陽DRz37基因blaR1的732~751位TAAGGACAAAGGCTAGCTACAACGACTATCGGCTPS-DRz38基因blaR1的1361-1378位GCTTGAGGGCTAGCTACAACGATGAGTCGCAGPS-DRz39基因blaR1的1360~1378位GC丌GAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTPS-DRz40基因blaR1的1358~1378位GCTTGAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTAT所述的硫代寡聚脱氧核苷酸为16~20个碱基，经全硫代修饰；硫代脱氧核酶除催化中心(保守序列的15个碱基)序列外，其两端的碱基臂(如权利要求1表中的划线部分)为17~21个碱基，均进行全硫代修饰。所述的PS-ODNs01~PS-ODNs10禾口PS-DRz21~PS-DRz30是革巴向mecR1基因的反义核酸，PS-ODNs1卜PS-ODNs20禾口PS-DRz31~PS-DRz40是耙向blaR1基因的反义核酸。所述的反义核酸用于抑制MRSA的耐药基因表达、使MRSA恢复对p-内酰胺类抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治疗。所述的抑制mecR1和blaR1基因功能的反义核酸或抑制mecA和blaZ基因功能的反义核酸联合应用，可以产生协同抑制MRSA耐药性的作用。所述的反义核酸序列用于制备抗MRSA耐药性药物的用途。本发明的特点是以MRSA耐药基因mecR1/mecA或blaR1/blaZ的全序列为耙点，该一系列的反义核酸序列，包括反义硫代寡聚脱氧核苷酸和硫代脱氧核酶，可特异性的与基因mecR1/mecA或blaR1/blaZ上的互补区域结合。硫代寡聚脱氧核苷酸为16~20个碱基，经全硫代修饰；硫代脱氧核酶除催化中心(为保守序列，15个碱基)序列外，其两端的碱基臂为17~21个碱基，均进行全硫代修饰。通过药效学实验证明，本发明所述的互补于基因mecR1/mecA或blaR1/blaZ序列的反义核酸均具有抑制MRSA耐药性的特性，在抗MRSA耐药性治疗方面显示出广阔的应用前景。图1是菌落计数后的成像图2是平板克隆形成实验结果的统计图3是15|jg/mlPS-ODNs11对不同循环数的blaR1mRNA表达的影响图示；图4是不同剂量的PS-ODNs11对blaR1mRNA表达变化的影响图示；图5是15|jg/mlPS-ODNs11对不同循环数的blaZmRNA表达的影响图示；图6是不同剂量的PS-ODNs11对blaZmRNA表达变化的影响图示；图7是菌落计数后的成像图8是平板克隆形成实验结果的统计图。具体实施例方式细菌耐药性的产生使得临床上许多曾经有效的抗生素失效，因此本发明的研究目的是寻找新的逆转MRSA耐药性的药物。为此，本发明根据MRSA的分子生物学信息，以MRSA的耐药基因表达信号通路中的调控基因mecR1及blaR1为靶基因，利用电穿孔的方法将反义核酸药物导入耐药菌体内，用功能学实验来评估反义药物能否抑制或阻断mecR1及blaR1的表达，从而逆转MRSA的耐药性；反义药物(包括反义硫代寡聚脱氧核苷酸和硫代脱氧核酶)能否作为逆转MRSA耐药性的新药物。本发明的研究结果提示，以MRSA耐药基因mecR1及blaR1为靶点设计的反义核酸可以有效的抑制靶基因的转录、表达，部分的逆转MRSA的耐药性，恢复其对苯唑西林的敏感性。分别以mecR1和blaR1为耙点的反义核酸联合应用，具有协同对抗MRSA耐药性的作用。上述的反义核酸具有开发为抗MRSA耐药性药物的前景以下将以实施例具体描述本发明。实施例1抗mecR1或blaR1mRNA的反义硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs)及硫代脱氧核酶(PS-DRz)的设计在GENBANK中检索到MRSA的耐药基因mecR1/mecA的序列(基因编号gi:2791983)，该序列全长9047bP，编码8个开放读框，包括3个mec区和5个ORF区。该序列的化15bp至3372bp间的是mecR1基因序列，3472bp至5478bp之间的是mecA基因序歹U。mecR1全长1758bp，是mecA的上游基因，可编码MecR1蛋白，调控mecA的表达；mecA全长2007bp，编码青霉素结合蛋白PBP2a。利用同样的方法检索到blaR1/blaZ的基因组序列(基因编号gi:33390917)，该序列全长3080bp，编码3个开放读框，艮卩blaZ、blaR1和blal3个区。该序列的953bp至2710bp之间的是blaR1基因序列，1bp至846bp之间的是blaZ基因序列。blaR1全长为1758bp,编码BlaR1蛋白，调控基因blaZ的表达；blaZ全长为846bp，编码P-内酰胺酶。根据碱基互补原则，从DNA序列得到mecR1/mecA、blaR1/blaZ的mRNA，应用RNAstructure4.3计算机软件进行辅助设计，筛选出一系列反义核酸作用耙位点，根据这些靶位点设计出相应的反义核酸，再根据自由能最低原理、反义寡聚核苷酸与靶序列结合的净能量、反义寡聚核苷酸与直链靶序列结合所需要的能量、反义寡聚核苷酸-靶序列结合后碱基从靶序列断裂需要的能量、反义寡聚核苷酸分子内结合所需要的能量、反义寡聚核苷酸分子间结合所需要的能量、核酸-靶序列解链的温度等参数，挑选出一些条件较优的反义核酸，同时设计了随机对照的反义核酸(PS-ODNs41、PS-ODNs42、PS陽DRz51、PS-DRz61)。经BLAST软件验证实验所用的反义核酸均具有高度特异性，并为增加其稳定性进行了硫代修饰，由上海生物工程技术服务有限公司合成，这种合成技术及设备是本行业公知的。所述的硫代寡聚脱氧核苷酸为16~20个碱基，经全硫代修饰；硫代脱氧核酶除催化中心(保守序列的15个碱基)序列外，其两端的碱基臂(如下表中的划线部分)为17~21个碱基，均进行全硫代修饰。所述的PS-ODNs01~PS-ODNs10禾QPS-DRz21~PS-DRz30是耙向mecR1基因的反义核酸，PS-ODNs11~PS-ODNs20禾口PS-DRz31~PS-DRz40是靶向blaR1基因的反义核酸。所述的反义核酸用于抑制MRSA的耐药基因表达、使MRSA恢复对p-内酰胺类抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治疗。所述的抑制mecR1和blaR1基因功能的反义核酸或抑制mecA和blaZ基因功能的反义核酸联合应用，可以产生协同抑制MRSA耐药性的作用。所述的反义核酸序列用于制备抗MRSA耐药性药物的用途。序列见表1。表1设计的反义硫代寡聚脱氧核苷酸和硫代脱氧核酶<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PS-ODNs10基因mecR1的1550~1701位ACCTTGTCCTTAGCACTTPS-ODNs"基因blaR1的13~141位TCCTGCAAGAAGAGTTPS-ODNs12基因blaR1的185~297位GTGGGCGCTTGATTATPS-ODNs13基因blaR1的357~417位AGTGACTGTTTCTTTAPS-ODNs14基因blaR1的557~632位GTCTTTTGTCAATTACPS-ODNs15基因blaR1的958~1051位CGTTGTGTAAGGGCTTPS-ODNs16基因blaR1的1122-1304位TCTTGTTCCTTATTCCPS-ODNs17基因blaR1的1349~1377位TGAGTTGAGTCGCAGTPS-ODNs18基因blaR1的1471~1491位ATGGTTAIIIIGTTCCPS-ODNs19基因blaR1的1562~1627位TGTACCTGIMICCCAPS陽ODNs20基因blaR1的1679~1732位ATTCAGCATTTTTCCCPS-DRz21基因mecR1的1683-1702位CATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCCTPS-DRz22基因mecR1的217~236位CTAACCGAAGAAGGGCTAGCTACAACGACGTGTCPS-DRz23基因mecR1的168卜1698位CGCA丌GGGCTAGCTACMCGACTTCGCCTTTPS-DRz24基因mecR1的1683~1700位丌CGCATTGGGCTAGCTACAACGAC丌CGCCTPS-DRz25基因mecR1的1681~1700位丌CGCATTGGGCTAGCTACAACGACTTCGCCTTTPS-DRz26基因mecR1的1683-1703位CCA丌CGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCCTPS-DRz27基因mecR1的1683~1704位GCCA丌CGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCCTPS-DRz28基因mecR1的1685~1705位CGCCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTC丌CGCPS-DRz29基因mecR1的1687~1706位TCGCCATTCGGGCTAGCTACAACGAATTGTC丌CPS-DRz30基因mecR1的1685~1706位TCGCCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCPS-DRz31基因blaR1的1359~1378位GC丌GAG丌GAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTAPS-DRz32基因WaR1的201~219位C丌ACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz33基因blaR1的201~220位AC丌ACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz34基因blaR1的201~221位GACTTACTTTCMGGCTAGCTACMCGATGTGGGCPS-DRz35基因blaR1的201222位TGACTTACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz36基因blaR1的732~750位AAGGACAAAGGCTAGCTACAACGACTATCGGCTPS-DRz37基因blaR1的732~751位TAAGGACAAAGGCTAGCTACAACGACTATCGGCTPS國DRz38基因blaR1的1361-1378位GC丌GAGGGCTAGCTACAACGATGAGTCGCAGPS-DRz39基因blaR1的1360-1378位GCTTGAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTPS-DRz40基因blaR1的1358-1378位GC丌GAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTAT实施例2PCR引物的设计与合成:依据GeneBank中报道的MRSA的mecR1、mecA、blaR1、blaZ及16srRNA的基因序列，用软件PrimerPremier5.0设计了mecR1、mecA、blaR1、blaZ及16srRNA的五对特异性扩增引物。引物均经BLAST软件验证具有高度特异性，并由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列见表2。表2设计合成的扩增引物引物引物序列产物长度mecR1弓l物5'-TGGTATTTGGTTTAGTGAA-3'5'-GATTAGGIIlAGGCATTGA隱3'414bpmecR1弓l物5'-ACACGACTTCTTCGGTTAG-3'5'-GTACAAIIIGGGATTTCACT-3'336bpmecA引物5'-CCACATTGTTTCGGTCTA-3'5'陽AGTTGTAGTTGTCGGGTT-3'446bpmecA引物5'-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3'5'-AATGGGACCAACATAACCTA-3'225bpblaR1引物5'-ACAATGAAGTAGAAGCCGATAGAT-3'5'-GTCGGTCAAGTCCAAACA-3'489bpblaZ引物5'陽AGAGATTTGCCTATGCTTCA-3'5'-AGTATCTCCGCTTTTATTATTT-3'464bp16srRNA引物5'-GTTATTAGGGAAGAACATATGTG-3'5'-CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC-3'750bp实施例3电感受态冊0-2的制备:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株冊0-2由中国细菌耐药性监测中心提供。lml新鲜过夜培养的冊0-2转种于100ml营养肉汤培养基中，37°C、210rpm培养至对数生长中期，测其0D6。。=0.550.6。菌液冰浴20min后分装(40ml/离心管)，6000rpm离心10min，弃去上清，细菌沉淀用40ml冰浴过的去离子水混匀重悬，6000rpm离心10min，弃去上清，重复2次。之后细菌沉淀用20ml冰浴过的10%的甘油混匀重悬，6000rpm离心10min,弃去上清。细菌沉淀用1ml冰浴过的10%的甘油混匀重悬，6000rpm离心10min，弃去上清，重复2次。1ml10%的甘油悬浮细菌沉淀，50lU分装，-80。C冻存。以下实施例中是申请人选取实验结果最好的硫代寡聚脱氧核苷酸和硫代脱氧核酶为例，其他的硫代寡聚脱氧核苷酸或硫代脱氧核酶同样按照以下方法进行实验。实施例4电穿孔法导入PS-ODNs或PS-DRz:50ii1融化的电感受态WH0-2与PS-ODNs或PS-DRz(无菌三蒸水溶解)混匀，注入预冷的0.1誦电转杯中。调节电穿孔仪，使电脉冲为25pf，电压900V，电阻200Q进行电击。电击后迅速加入37。C预热的S0C培养基1ml，37°C、150rmp复苏1h。PS-0DNs各分三个剂量组，分别为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml，同时设空白对照组(加相同体积的去离子水)、随机对照组浓度为15ixg/ml。PS-DRz各分三个剂量组，分别为5yg/ml、10ug/ml、15ug/ml，同时设空白对照组(加相同体积的去离子水)、随机对照组的浓度为15ug/ml。.实施例5平板克隆形成实验将复苏的菌液稀释106倍，吸取50ta稀释菌液均匀涂布于含苯唑西林(6ug/ml)的M-H琼脂培养基表面，35。C恒温孵育48h，肉眼计数M-H琼脂培养基平板上冊0-2的菌落数(CFU)。结果显示实验组(PS-ODNsll)的CFU均明显低于空白对照组，具有统计学差异，PS-ODNsll的5、10、15ug/ml三个剂量组的抑制率分别是17%(代O.05)、24%(代0.05)、34%(代0.05)，并均随着浓度的增加而抑制效应增强。而随机对照组的CFU与空白对照组相比无显著性减少。由此可见，PS-ODNs能减少WH0-2的菌落数。(见图1、图2)图1、图2是不同浓度的PS-ODNsll对WH0-2在含苯唑西林(6wg/ml)的M-H琼脂培养基表面生长(CFU)的影响图示。图1是菌落计数后的成像图，图中a是空白对照组，b是PS-0DNs42组(15Ug/ml)，c是5ug/ralPS-0DNsl1组，d是10ug/mlPS-0DNsl1组，e是15ug/mlPS-ODNsll组。图2是平板克隆形成实验结果的统计图，图中C是空白对照组，M是随机链PS-0DNs42对照组(15ug/ml)，5、10、15分别是5、10、15yg/ml的PS-0DNsl1组。*》0.05kscontrol;林代O.05kscontrol(5±s，n=ll)。图1、图2显示了PS-ODNsll能显著性减少冊0-2的菌落数。实验组(PS-DRz21、PS-DRz31)的CFU均明显低于空白对照组，具有统计学差异，PS-DRz21的5、10、15yg/ml三个剂量组的抑制率分别是13.2%(代O.Ol)、30.5%(代O.Ol)、50.3%(代O.01);PS-DRz31的5、10、15ug/ml三个剂量组的抑制率分别是21.8%(代O.01)、43.3%(代O.Ol)、62.2%(代O.01)，并均随着浓度的增加而抑制效应增强。而随机对照组的CFU与空白对照组相比无显著性减少。由此可见，PS-DRz能减少WH0-2的菌落数。(见图7、图8)图7、图8是不同浓度的PS-DRz21和PS-DRz31对冊0-2在含苯唑西林(6ug/ml)的M-H琼脂培养基表面生长(CFU)的影响图示。图7是菌落计数后的成像图，图8是平板克隆形成实验结果的统计图。图中A是空白对照组，B是10pg/mlDRz51+10叫/mlDRz61组；C是10叫/mlDRz21组；D是10pg/mlDRz21+10叫/mlDRz61组；E是10吗/mlDRz31组；F是10吗/mlDRz31+10吗/mlDRz51组；G是5吗/mlDRz21+5pg/mlDRz31组。*P>0.05，***P〈0.01vscontrol;##P<0.05vsC;and※※P<0.05vsE;(i±s，n=8)。实施例6RT-PCR法检测耐药基因迈ecA7及其下游基因iT/ed的mRNA的表达变化1、提取细菌总RNA:(1)冰浴5min后的菌液5000rpm离心10min，弃去上清，收集细菌沉淀；(2)细菌沉淀中加入100y1裂解液，37。C孵育30min，每隔10min振荡1次，以充分裂解细菌；(3)加入1mlTrizolreagent,室温放置5min后加氯仿0.2ml/mlTrizolreagent,盖紧离心管，用手轻柔混匀离心管；(4)吸取水相上清转移至一新的离心管中，加入异丙醇0.5ml/mlTrizolreagent,盖紧离心管，用手轻柔混匀，室温放置20min，13000rpm、4。C离心20min;(5)弃去上清，加入75%乙醇1ml/mlTrizolreagent,用手剧烈摇荡使RNA充分溶解，8000rpm、4。C离心10min;(6)弃去上清，然后置于清洁环境挥干乙醇10min，但不要干燥过分，以免降低RNA的溶解度。将RNA溶于DEPC处理过的水中作为RT模板(必要时可在5560。C孵育助溶)，或于-2(TC冻存。2、RT:用DU800核酸蛋白分析仪测总RNA的浓度及纯度。反应体系50ul:5XRTbuffer10u1(含Mg2+)，2.5,1/1.28mldNTP5n1，随机引物1yl，模板RNA1wg，RNaseinhibitor1y1，10U/ul反转录酶AMV1y1，用DEPC处理过的水补足50ixl。反应条件30°C8min，42°C1h，99°C5min，冰浴后进行PCR或-20。C保存cDNA。3、PCR:反应体系50ul:lOXPCRbuffer51(不含Mg20，2.5mraol/LMgCl25iU，2.5咖ol/1.28mldNTP4n1，0.1umol/L引物各0.75u1，模板cDNA3ul，5U/y1TaqDNA聚合酶1W1，用DEPC处理过的水补足50u1。反应条件95°C变性lmin，51'C退火1min，72。C延伸1min，循环数取1430循环不等，最后一个循环的延伸条件为72°C8min。4、PCR产物分析取5PiPCR反应产物与2ul的loadingbuffer上样液充分混匀，加入含0.5Pg/ml溴化乙啶的l.(m的琼脂糖凝胶的点样孔中，5V/cm进行电泳。电泳结束后用凝胶成像仪进行观察照相并进行光密度扫描，测条带密度值(Integraldensityvalue,IDV)。因为16srRNA在细菌中稳定表达，所以本发明以16srRNA作为内参照，计算相关基因的相对表达强度，公式如下被测基因相对表达强度IDV。/F被测基因IDV值/16srRNAIDV值X1000/。。冊0-2的mecRl、mecA、blaRl、blaZ和16s/V朋的RT-PCR的扩增产物的电泳结果显示，各组分别在414bp、446bp、489bp、464bp及750bp处出现特异性扩增条带。条带密度值(Integraldensityvalue,IDV)比值分析结果表明，大剂量(15ug/ml)PS-ODNsll组在不同循环时blaRl及其下游基因blaZmRNA的表达与空白对照组及随机对照PS-0DNs42U5ug/ml)组相比明显下降，且随着PS-ODNsll浓度的增加，blaRl和blaZ的mRNA表达量越低，(见图3、图4、图5、图6)图3、图4是PS-ODNsll导入WHO-2后blaRlmRNA表达的半定量分析结果。图3是15ug/mlPS-ODNsll对不同循环数的blaRlmRNA表达的影响。14、16、18、20和22表示PCR检测时blaRl所取的循环数，16S表示取28cycles的16srRNA。PS-ODNsll和PS-0DNs42的浓度均是15Pg/ml。图4是不同剂量的PS-ODNsll对blaRlmRNA表达变化的影响。C是空白对照组(control),M是PS-0DNs42组(15yg/ml)，5、10、15分别表示5、10、15ug/ml的PS-ODNsll组。IDV%=blaRlIDV值/16srRNAIDV值X100。/。。*，05kscontrol;伞氺iKO.05kscontrol;氺*氺/^0.01kscontrol(i±s，n=4)。图3、图4显示了PS-ODNsll能显著性的抑制blaRlmRNA的表达。图5、图6是PS-ODNsll导入WHO-2后blaZmRNA表达的半定量分析结果。图5是15ug/mlPS-ODNsll对不同循环数的blaZmRNA表达的影响。14、16、18、20和22表示PCR检测时blaZ所取的循环数，16S表示取28cycles的16srRNA。PS-ODNsll和PS-ODNs42的浓度均是15yg/ml。图6是不同剂量的PS-ODNsll对blaZmRNA表达变化的影响。C是空白对照组(control),M是PS-0DNs42组(15Pg/ml)，5、10、15分别表示5、10、15ug/ml的PS-ODNsll组。IDV%=blaZIDV值/16srRNAIDV值X100%。*，.05control;水氺/<0.05control(3f士s，n二4)。图5、图6显示了PS-ODNsll能显著性的抑制blaRl的下游基因balZmRNA的表达。实施例7Real-timeRT-PCR法检测目的基因鹏cW、/zec/I、Wa/7、Z;7aZ的mRNA与内标基因755r必M的mRNA的相对表达变化1、提取细菌总RNA(方法如上)2、RT:用DU800核酸蛋白分析仪测总RNA的浓度及纯度。随机引物1iU，模板RNA1ug，2.5咖o1/1dNTP4u1，用DEPC处理过的水补足14u1，65°C5min，置于冰上lmin。然后加入5XRTbuffer4u1，0.1mo1/1DTT1w1，RNaseinhibitor0.5P1，SuperScriptIIIreversetranscriptase0.5pl，反应体系共20u1，25°C5min，50°C45min，70°C15min，冰浴后进行PCR或-2(TC保存cDNA。3、分别构建鹏c/厶W^/、WaZ及/必ry厕的标准曲线取对照组RNA反转录后的cDNA，10倍梯度稀释(见表3)。4、分别应用，c^、历ec力、/Wa)W、WaZ及7必W朋的特异性引物进行实时定量PCR反应。反应体系SYBRPremixExTaq12.5w1，R0XReferenceDye(50X)0.5iU，PCRPrimermixture(10uM)0.75yl，模板1或3y1，加灭菌双蒸水补足至25Pl。反应条件首先95。C5rain;然后50个循环，95。C10s，退火温度20s,(见表4),72。C20s,readplate;最后绘制融链曲线(60。C90。C)。表3鹏cA7、鹏cAWW7、力7aZ及7必r必W的标准品配制<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>Standard31003Standard41001Standard510003Standard610001Standard7100003Standard8_10000_|_表4基因的退火温度_基因_退火温度(°C)/77eo/厶,c力5856力7處7盼細55样品的实时荧光定量反应各样品组RNA100倍稀释后反转录，取相同体积生成的cDNA分别应用blaRl、blaZ及16SrRNA的特异性引物进行实时定量PCR反应。结果见下表表5wec/7相对于76SWA^的mRNA表达水平groupCt.mecRiCt.驗RNA△Ct△ACtA31.60士0.0622.13±0.069.47±0.080±0.081.00(0.97-1.04)B32.93±0.0523.48±0.079.45±0.09-0.02±0.091.01(0.95-1.08)C28.61±0.0418.57±0.0910.04±0.100.57±0.100.67(0.63-0.72)D36.32±0.0326.33±0.029.99±0.040.52±0.040.70(0.68-0.72)E30.27±0.0420.83±0.069.44±0.07-0.03±0.071.02(0.97-1.07)F32.59±0.0723.11±0.049.48±0.080.01±0.080.99(0.94-1.05)G35.05±0.0324.66±0.0710.39±0.080,92±0.080.53(0.50-0.56)ct:临界循环数，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。△△Ct气Ct.mecRi-Cw6s)trea加ent陽(Ct,ecR广Ct.i6s)咖加iA:空白对照组；B:10Hg/mlDRz51+10pg/mlDRz61;C:10吗/mlDRz21;D:10吗/mlDRz21+10)ag/mlDRz61;E:10(ag/mlDRz31;F:10ng/mlDRz31+10ng/mlDRz51;G:5pg/mlDRz21+5吗/mlDRz31。(3f土s，n=3)。表6med相对于/6&iA^的mRNA表达水平_groupCt△CtAACt2復tA29.31±0.0422.13±0.067.18±0.070±0.071.00(0.95-1.05)B30.70±0.1023.48±0.077.22±0.120.04±0.120.97(0.卯隱l.06)C26.29±0.0618.57±0.097.72±0.110.54±0.110.69(0.64-0.74)D34.02±0.1426.33±0.027.69±0.140.5U0.140.70(0.64-0.77)E30.27±0.0420.83±0.069.44±0.07-0.03±0.071.02(0.97-1.07)F30.23±0.0223.11±0.047.12±0.04-0.06±0.041.04(1.01-1.07)G32.70±0.1824.66±0.078.04±0.140.86±0.140.55(0.50-0.61)Ct:临界循环数，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。△△Ct=(Ct.mecA-Ct.16s)treatment-(Ct.mecA-Ct.i6S)c。ntr。iA:空白对照组；B:10ng/mlDRz51+10Hg/mlDRz61;C:10吗/mlDRz21;D:10|ig/mlDRz21+10jag/mlDRz61;E:10ng/mlDRz31;F:10|ig/mlDRz31+10|ag/mlDRz51;G:5jxg/mlDRz21+5pg/mlDRz31。(3f土51，n=3)。表7Wai7相对于/6&7A^的mRNA表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>ct:临界循环数，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。△△C产(Ct.WaR广Ct.^)t腦tment-(Ct.b隨-Cw6s)co咖,A:空白对照组；B:10吗/mlDRz51+10pg/mlDRz61;C:10jag/mlDRz21;D:10吗/mlDRz21+10吗/mlDRz61;E:10pg/mlDRz31;F:10吗/mlDRz31+10ng/mlDRz51;G:5吗/mlDRz21+5吗/mlDRz31。(i土s，n=3)。表8WaZ相对于/65WA^的mRNA表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>Ct:临界循环数，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,WaZ國Ct.l6s)trea加ent-(Ct.blaZ-Ct.16s)c。ntrolA:空白对照组；B:10pg/mlDRz51+10Hg/mlDRz61;C:10吗/mlDRz21;D:10|tig/mlDRz21+10pg/mlDRz61;E:10jag/mlDRz31;F:10|ag/mlDRz31+10|ag/mlDRz51;G:5ng/mlDRz21+5pg/mlDRz31。(i士s，n=3)。WH0隱2的mecR1、mecA、blaR1、blaZ和16srRAM的Real-timeRT國PCR的扩增产物的电泳结果显示，各组分别在336bp;225bp、489bp、461bp及750bp处均出现特异性扩增条带。分析结果表明，合用阻断mecR1/mecA和blaR1/blaZ双通路的反义分子，阻断MRSA的双耐药基因表达信号通路能显著减少MRSA的菌落数，抑制MRSA的生长，与阻断单条耐药基因表达信号通路相比对MRSA的抑制作用更加明显，见表5—表8。本实验的研究结果表明，以基因mecR1和blaR1为特异性靶点的反以核酸能够选择性的抑制MRSA菌株WHO-2菌体内mecR1和blaR1基因的表达，继而抑制受其调控的下游基因mecA和blaZ的表达，从而部分恢复了WHO-2对苯哇西林的敏感性，降低了其耐药性。说明上述的以mecR1和blaR1为靶点的反义核酸具有抗MRSA耐药性的作用，通过核酸序列长度、修饰等优化和筛选具有开发为抗MRSA耐药性药物的前景，与抗生素联合应用用于MRSA感染性疾病的治疗。权利要求1、抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸，包括反义硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs)和硫代脱氧核酶(PS-DRz)，其特征在于可特异性与MRSA耐药基因mecR1/mecA、blaR1/blaZ的不同区域结合，阻断这些耐药基因的表达，其反义核酸的碱基序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001">id="icf0001"file="A2007100178260002C1.gif"wi="163"he="198"top="56"left="22"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables><tablesid="tabl0002"num="0002">id="icf0002"file="A2007100178260003C1.gif"wi="163"he="101"top="28"left="24"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables>2、根据权利要求1所述的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸，其特征在于硫代寡聚脱氧核苷酸为16~20个碱基，经全硫代修饰；硫代脱氧核酶除催化中心(保守序列的15个碱基)序列外，其两端的碱基臂(如权利要求1表中的划线部分)为17~21个碱基，均进行全硫代修饰。3、根据权利要求1所述的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸，其特征在于PS-ODNs0卜PS-ODNs10禾口PS-DRz21~PS-DRz30是耙向mecR1基因的反义核酸，PS-ODNs11~PS-ODNs20和PS-DRz3卜PS-DRz40是靶向blaR1基因的反义核酸。4、根据权利要求书1所述的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义t亥酸，其特征在于所述的反义核酸用于抑制MRSA的耐药基因表达、使MRSA恢复对p-内酰胺类抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治疗。5、根据权利要求书3所述的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸，其特征在于抑制mecR1和blaR1基因功能的反义核酸或抑制mecA和blaZ基因功能的反义核酸联合应用，可以产生协同抑制MRSA耐药性的作用。6、根据权利要求书1所述的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸，其特征在于所述的反义核酸序列用于制备抗MRSA耐药性药物的用途。全文摘要本发明涉及一类针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药基因mecR1/mecA和blaR1/blaZ的反义核酸序列及其制备含有该反义核酸序列的药物及其用途，它包括反义硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs)和硫代脱氧核酶(PS-DRz)，其特征在于可特异性与MRSA耐药基因mecR1/mecA、blaR1/blaZ的不同区域结合，阻断这些耐药基因的表达，其反义核酸的碱基序列为PS-ODNs01-40，该类反义核酸能够与靶基因的特定位点结合，从而抑制耐药基因的表达，使MRSA恢复对内酰胺类抗生素的敏感性，从而达到有效对抗MRSA耐药性的目的。文档编号C07H21/04GK101200483SQ20071001782公开日2008年6月18日申请日期2007年5月11日优先权日2007年5月11日发明者征侯,孟静茹,扈本荃,慧王,罗晓星,敏贾申请人:中国人民解放军第四军医大学