专利名称：新型长效胸腺肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用基因工程技术合成的一种新型的长效胸腺肽蛋白的制备及其应用，包括含有该基因的重组载体，用该载体转化的宿主。
背景技术：
胸腺是体内重要的免疫器官，在淋巴系统发育和维持免疫系统的正常功能中起重要作用，尤其在抗感染、抗肿瘤、移植和自身免疫性疾病等作用中具有特殊的意义。随着机体年龄老化，胸腺会逐渐萎缩退化，从而导致机体对肿瘤、感染、免疫缺陷等疾病的耐受降低。1961年，在Miller等发现了胸腺与抗体的免疫功能及淋巴细胞的发育有密切的依赖关系以后，掀开了人类利用胸腺肽的研究。1966年Goldstein[1]首先从小牛胸腺组织中提取出该活性物质，命名为胸腺肽(Thymosin)，美国1974年开始把小牛胸腺肽应用于临床，主要是治疗原发性细胞免疫缺陷病和某些肿瘤。
胸腺肽是由胸腺上皮细胞所分泌的一类多肽类激素混合物，其水平与机体的免疫功能关系密切。其中胸腺肽的混合物中第5组分(thymosin fraction 5，TF-5)最为重要。该组分TF-5根据等电点(isoelectricpoint，pI)可分成分为三个区域pI小于5.0的组分的为胸腺肽α，介于5.0～7.0的之间的组分为胸腺肽β，而大于7.0以上的组分，但含量很少，为胸腺肽γ[1][2]。
β族胸腺素由几种分子量小，高度保守的酸性蛋白质组成，在免疫、细胞移动、血管生成、神经再生、肿瘤侵润、创伤愈合和炎症反应等许多方面具有重要的生物学功能[3][4]。其中与人类密切相关且研究较多的是胸腺素β4，β10和β15。。Low T[3]，研究证实胸腺肽β4能诱导末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的活性，在T细胞成熟的早期阶段发挥作用。胸腺肽β4广泛分布在哺乳动物和其他脊椎动物，尤其在脾和腹膜巨噬细胞中含量最高。胸腺肽的活性部位主要集中在α区，而在胸腺肽α中最主要的活性组分是胸腺肽α1(thymosin α1，Tα1)。
胸腺肽α1是一种具有热稳定性的酸性多肽，由28个氨基酸组成，等电点为4.2，相对分子量3108，且不含有甲硫氨酸、半胱氨酸及芳香族氨基酸。1977年Dardenne等从猪血清中分离提取出一种9肽分子，命名为血清胸腺因子(factor thymique serique，serum thymicfactor，FTS)，即胸腺九肽，其与锌结合后方具有生物活性，主要参与机体免疫功能[4]。1984年，Haritos等从大鼠胸腺分离出一种含有111个氨基酸残基的多肽，其N端含已发现的所有胸腺肽α家族成员的序列，因此命名为胸腺肽α原，认为是Tα1的前体分子。Goodall等学者的研究表明，Tα1是ProTα的降解产物，也有研究表明Tα1和ProTα在完整的胸腺组织中同时存在。ProTα具有与Tα1相似的生物学活性，它不仅能调节免疫功能，而且对细胞的增殖等也具有调节作用[5，6]。此后，美国G.Goldstein又发现了一个胸腺五肽，称为(thymopentin，TP-5)，是胸腺素的活性中心，由5个氨基酸构成，具有与胸腺肽α1相似的生物活性[7]。
胸腺肽是一种免疫调节剂，能诱导前T淋巴细胞转化为有细胞免疫功能的T淋巴细胞。还可以使胸腺和脾脏等免疫器官增大、巨噬细胞吞噬功能增强、活性增加。可以用于防治电离辐射造成的损伤，并使免疫功能低下的机体胸腺淋巴细胞cAMP和cGMP含量升高，而对正常机体无明显作用，是治疗原发性和继发性免疫缺陷病、急慢性病毒性肝炎、难治性肺结核、银屑病、支气管哮喘、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮、以及辅助治疗白血病和恶性肿瘤等的有效生化药物，还用于抗衰老[8]。
Tα1在体外可以促进致敏细胞生成淋巴因子，增加细胞因子高亲合力受体的表达；能够增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原激活后产生IFNα、IL-2和IL-3等淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平；Tα1还能影响NK前体细胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后变得更有细胞毒性，调控骨髓前体细胞和脾细胞的末端脱氧核酸转移酶(TdT)活性；增强骨髓前体细胞Thy1和Lyt1，2，3的表达；拮抗胸腺细胞成熟过程中的凋亡。Tα1在体内能增加ConA激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌IL-2，并增加IL-3受体的表达，配伍其它细胞因子具有抗肿瘤作用，体内应用结果也表明其在T细胞发育和功能重建中具有重要意义，可以促进淋巴细胞分泌IL-2和IL-3受体的表达；增强宿主的抗感染能力促进病毒的清除；增强免疫功能有抗氧化、抑制癌细胞生长等重要作用[8]。Tα1临床用途广泛，已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症、及免疫缺陷等疾病的治疗中，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂，并可以作为疫苗辅助剂使用，是目前临床使用疗效确切的一类药物[9-11]。
目前临床用胸腺肽类药物主要有两大类一类是从动物胸腺中提取的天然多肽的混合物，含有40-50种多肽成分。国内生产的大部分胸腺肽主要是该类药物[12]，但是该胸腺肽制剂含有的活性成分Tα1尚不足1％，不仅该药物生产受到原料来源的限制，而且主要成分未经纯化，部分具有动物抗原性，加之生产厂家不同而产品质量参差不齐，临床使用副作用较多，疗效不是很理想，市场急需换代。另一类胸腺肽类药物是胸腺中分离的单一组分，主要以化学合成的为主。目前国外化学合成的胸腺肽α1(Thymosinal)已进入我国市场，商品名为“日达仙”；该药属于化学合成多肽，纯化难度大，因此生产成本高，高昂的价格使得大多数患者无法负担，治疗质量因此下降。此外，国内还有一种化学合成的胸腺五肽(thymopentin，TP-5)。相对于胸腺肽Tα1 2小时的半衰期，胸腺五肽的半衰期仅为30秒，虽然较胸腺肽α1有相对较低的生产成本，但是其较短的半衰期，极大地限制了该药在临床中的应用。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量约为66.5KD，是血浆的主要成分，也是许多内源因子和外源药物的载体。由于正常情况下不易透过肾小球，在血浆中的半衰期较长，可达14-20天，而且体内分布极广，没有酶学和免疫学活性，因而是一种理想的生物活性蛋白载体[14-16]。
胸腺肽疗效确切，属临床常用急需药物，目前上市产品都存在无法避免的缺憾，一定程度上降低了该药物的治疗质量。利用现代蛋白质工程技术将血清白蛋白与胸腺肽在酵母中表达为融合蛋白，该蛋白不仅保持原有胸腺肽的生物活性，具有较长的半衰期，而且在酵母中表达生产成本较低、效率高，因此，利用基因工程技术进行此类药物的研究与生产具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的长效胸腺肽蛋白。目的是解决传统胸腺肽在治疗上的不足。总之，与常规的胸腺肽相比，本发明的新型重组胸腺肽蛋白具有下列优点1)能够在酵母中实现高表达，表达后无需复性，便于纯化。2)新型重组胸腺肽蛋白在体内的半衰期延长；3)能调节并促进机体的免疫应答；能起到最大的治疗作用以及减少传统胸腺肽潜在的副作用或毒性；4)重组表达生产成本较低、效率高。
本发明的新型的长效胸腺肽蛋白，是指将血清白蛋白分子，或其变体或片段或结构域与胸腺肽分子或其变体或片段融合所形成。
本发明的新型的长效胸腺肽蛋白，包括与序列表SEQ ID No1中血清白蛋白或者与血清白蛋白至少85％序列同源的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽或者与胸腺肽至少85％序列同源的第二区，和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽或者与胸腺肽至少85％序列同源的第三区，所述的蛋白可以由上述的第一区，第二区和第三区同时连接构成，也可以由第一区和第三区或者第一区和第二区直接连接构成。
其中优选的是包括与序列表中SEQ ID No1血清白蛋白至少95％序列同源的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5人胸腺肽至少95％序列同源的第二区，和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5人胸腺肽至少95％序列同源的第三区。最优选的是包括与序列表中SEQ ID No1人血清白蛋白序列相同的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5人胸腺肽序列相同的第二区，和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5人胸腺肽序列相同的第三区，或上述三区的功能等同物。
所述的功能等同物是指在不改变本发明所述的新型的长效胸腺肽蛋白特性的前提下，对融合蛋白中个别氨基酸残基的取代、缺失或插入得到的蛋白。但这些改变不能明显改变白蛋白的一个或多个有用的配体结合和非免疫原的特性，或在胸腺肽中则是非免疫原性及可结合并激活胸腺肽受体的能力。特别的，将人血清白蛋白和人血清白蛋白片断中天然发生的多态性变体包括在内，融合蛋白中的白蛋白和胸腺肽可来自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，如牛、羊猪、鸡或鲑鱼。融合蛋白中的白蛋白和胸腺肽可以来自不同的动物。
可以通过对本发明的新型的长效胸腺肽蛋白中个别氨基酸残基进行取代、缺失或插入，得到与正常血清白蛋白或胸腺肽具有至少85％的序列同源性的变体(优选地是至少具有，90％，95％，或99％的同源性)。相对于正常的血清白蛋白，血清白蛋白变体应至少包含或是由血清白蛋白的一个完整的结构域组成，如结构域1(1-194)，2(195-387)，3(388-585)，或者是三个结构域的不同组合。此外，每个结构域本身由两个同源亚结构组成，这些亚结构域称为1-105，120-194，195-291，316-387，388-492，512-585。优选融合蛋白的血清白蛋白部分至少包含一个血清白蛋白的亚结构域，或结构域。相对于正常的胸腺肽，胸腺肽变体应能结合并激活胸腺肽受体，具有胸腺肽活性，一般至少具有5个氨基酸，优选的至少含有9，28，110个氨基酸。
组成本发明的长效胸腺肽蛋白核苷酸序列，与其相似的核苷酸序列具有至少85％的序列同源性的核苷酸，其包括即使有多达15％的核苷酸个体可以被替换、删减或插入等，均与本发明所指的核苷酸序列相同。无论是在5’或3’端，或在两端之间的任何位点发生的突变，还是以单体或多体发生的突变。
当应用本领域公认的软件或其他任何具有类似的DNA序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有85％以上的序列同源性，均认为与本发明长效胸腺肽蛋白所述的序列相同源。
本发明的新型的长效胸腺肽蛋白，所述连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ IDNo2-5胸腺肽氨基酸序列相同的第二区和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ IDNo2-5胸腺肽氨基酸序列相同的第三区，可以是相同的序列，也可以是不同的序列。所述连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二区和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5第三区同时连接在血清白蛋白的C-末端及N-末端，所述与血清白蛋白同源的第一区位于胸腺肽蛋白的中间。也可以是与血清白蛋白同源的第一区与连接在血清白蛋白的C-末端的与序列表中SEQ ID No2-4胸腺肽同源的第二区连接，而不与连接在血清白蛋白的N-末端的与序列表中SEQ ID No2-4胸腺肽同源的第三区连接形成融合蛋白。也可以是与血清白蛋白同源的第一区可以与连接在血清白蛋白的N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三区连接，而不与连接在血清白蛋白的C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二区连接形成融合蛋白。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白中，可以是所述与血清白蛋白同源的第一区与胸腺肽同源的第二区、血清白蛋白同源的第一区与胸腺肽同源的第三区直接连接，不设连接肽。即可以是胸腺肽—血清白蛋白—胸腺肽，或胸腺肽—血清白蛋白，也可以是血清白蛋白—胸腺肽。
本发明的新型的长效胸腺肽蛋白，可以是所述与血清白蛋白同源的第一区与胸腺肽同源的第二区，血清白蛋白同源的第一区与胸腺肽同源的第三区之间设有连接肽，即可以是胸腺肽—连接肽—血清白蛋白—连接肽—胸腺肽，胸腺肽—血清白蛋白—连接肽—胸腺肽，胸腺肽—连接肽—血清白蛋白—胸腺肽，也可以是血清白蛋白—连接肽—胸腺肽，胸腺肽—连接肽—血清白蛋白。
为了使胸腺肽最大地保持其生物活性，连接肽的较优选的长度为2-100个氨基酸，更优选的连接肽的长度为5-50个氨基酸，最优选的是14-30个氨基酸。优选的连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，其中n为1-10的整数，优选的n为1-5的整数。连接肽长度可短至白蛋白大分子对胸腺肽形成的位阻保持最小，连接肽的加入有利于胸腺肽与其受体结合。但是连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性，最优选的是没有连接肽，即胸腺肽—血清白蛋白—胸腺肽，或胸腺肽—血清白蛋白，也可以是血清白蛋白—胸腺肽。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白可以是分泌型的蛋白，可与胸腺肽的特异性抗体相结合，也可与人的特异性血清白蛋白抗体相结合，优选的，是与胸腺肽的特异性抗体相结合。
本发明重点描述的是胸腺肽α1-血清白蛋白—胸腺肽α1的制备，其他种类的胸腺肽家族成员能用同样的方法制备新的胸腺肽类似物。其中的胸腺肽家族成员可以是胸腺肽α1，胸腺肽α原，胸腺五肽，胸腺九肽等有相似生物活性的多肽。
本发明还包括所有在体内、体外具有胸腺肽生物功能的蛋白。特别是包括，但不局限于胸腺肽α1，胸腺肽α原，胸腺五肽，胸腺九肽以及其他的胸腺肽。
本发明目的是提供本发明长效胸腺肽蛋白的蛋白质序列和基因序列。包括与序列表中SEQID No1血清白蛋白序列至少85％同源的第一区，连接在血清白蛋白的C-末端与序列表中SEQID No2-5胸腺肽序列至少85％同源的第二区，和连接在血清白蛋白的N-末端与序列表中SEQID No2-5胸腺肽序列至少85％同源的第三区的融合蛋白的蛋白质序列和基因序列。
本发明的另一个目的是提供携带编码本发明融合蛋白基因序列的重组表达载体，包括pPIC9K/HSA-Tα1、pPIC9K/Tα1-HSA-Tα1、pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)n-Tα1、pPIC9 K/Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1、pPIC9K/TP5-HSA-Tα1等。
本发明的再一个目的是提供表达本发明长效胸腺肽蛋白编码基因的宿主。本发明的宿主可以是被重组表达载体或重组表达载体的一部分转化，含有本发明的新型的长效胸腺肽蛋白编码基因的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞以及含有本发明融合蛋白基因序列的转基因动、植物；其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是GS115。
本发明提供的长效胸腺肽蛋白适用于毕赤酵母中表达，构建的载体整合至毕赤酵母的基因组中，十分稳定，不易丢失。毕赤酵母具有许多高等真菌细胞表达系统所具有的优点，能进行蛋白质的加工和折叠，转录后的修饰，而且易于大规模培养，实现高密度发酵。与其他的表达系统如哺乳动物细胞培养相比具有更简洁、快速表达和产量更高的优点。毕赤酵母能以甲醇为单一碳源进行代谢，含有是可调控的醇氧化酶强启动子，重组蛋白表达高。此外，毕赤酵母表达的重组蛋白高效分泌到细胞外的培养液中，避免了由酵母细胞抽提物中分离纯化蛋白的难题，不但提高表达蛋白的活性，而且非常有利于重组蛋白的纯化，纯化步骤简洁高效，同时酵母分泌的蛋白仅占全部酵母蛋白的很小部分，终产品无毒性，利于临床使用[17-18]。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白，编码血清白蛋白和胸腺肽的DNA序列可以用PCR，RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库等本领域周知的方法获得[20，21]。其中上述方法所采用的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织(细胞)和文库等。对多聚核苷酸进行的突变、缺失、插入以及其他多聚核苷酸链接，可用本领域公知的方法。可以用PCR等方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，进行编码白蛋白和编码胸腺肽多聚核苷酸的融合，通过酶切产生粘性末端用DNA连接酶连接后从而获得编码融合蛋白的基因。
本发明的长效胸腺肽蛋白的表达载体和其对应的宿主可以是，如酵母表达载体pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5K，pAO815，pPICZα，pHIL-S1，pGAPZ，pPICZ等，动物细胞表达载体pSVK3，pMSG等，这些质粒及对应的宿主菌等可以从商业公司购得。其中优选的质粒为带有His4选择性标记的酵母整合型质粒，如pPIC9，pPIC9K等，通过将编码本发明的新型的长效胸腺肽蛋白或多肽的核酸克隆到这些酵母表达载体中。优选的启动子为醇氧化酶AOX1。
本发明长效胸腺肽蛋白的表达宿主可以是细菌、酵母、动物细胞或植物细胞以及含有本发明融合蛋白基因序列的转基因动、植物等。融合蛋白或多肽的表达可以是胞内，也可以分泌至表达宿主胞外的培养液中。优选的表达方式是分泌至培养液中，形成可溶性的蛋白。
本发明的长效胸腺肽蛋白可以经白蛋白天然信号肽分泌到酵母菌的培养液中。含有血清白蛋白胸腺肽融合蛋白可以由信号肽主导并通过分泌途经而得到加工。分泌所用的信号肽，优选的是天然的人血清白蛋白的信号肽，或酿酒酵母配对因子α因子，或这两种信号肽的类似物。更优选的用天然的人血清白蛋白的信号肽，这些信号肽在成熟的白蛋白释放到周围介质中即被酵母切割。融合蛋白也可以不用信号肽，而在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。
宿主细胞可以利用周知的方法经遗传工程(转导或转化或转染)将携带由本发明融合蛋白核苷酸序列的质粒载体以侵入方式、病毒感染、噬菌体等形式转入到宿主中表达。其中转化融合蛋白核苷酸序列至宿主细胞中可用周知的方法，如电穿孔，制备感受态的原生质体，化学转化等。成功转化并含有本发明融合蛋白核苷酸序列构建体的细胞，可通过常用的方法进行鉴定，如提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者收集细胞破碎液或胞外培养液中的蛋白，用抗白蛋白抗体或抗胸腺肽抗体进行ELISA检测鉴定。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白的生产，可以通过培养含有本发明核苷酸序列构建体的宿主菌体如，重组酵母，细菌，动、植物细胞，转基因动植物等获得。宿主菌体(或细胞)的培养可以是人们熟知的方法，如用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。适合菌体(或细胞)生长和产物表达的培养基，应通过实验获得，应能提供菌体(或细胞)生长表达产物所需的氮源、碳源、pH缓冲成分，无机盐，微量元素等。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白的纯化处理，其中包括如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。
通过本发明获得的新型长效胸腺肽蛋白。能够使其在不丧失激活受体和刺激机体增强免疫功能的情况下，血浆中的半衰期将会得到显著的延长。这样就会降低了给药频率和剂量，却发挥出与胸腺肽相似的药效作用。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。所用修饰剂可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白及其衍生物可以单独以纯品使用，也可以与一个或多个药学上可以接受的载体一起组成药物制剂的形式使用，其中优选的是组成药物制剂，并可通过任何本领域已知的方法制备。常用的药物载体一般为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸。药物制剂可以单位剂量的形式存在，优选的药物制剂包含含水的液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，糖类等，使药物的渗透性与受体血液中的渗透性相等或相似。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白及其衍生物或其药物组合物可以用于哺乳动物，优选的是人类，可以通过任何已知的方法，包括但不局限于口服、注射、皮下或经非肠胃，腹腔膜内、静脉内、动脉内、静脉输注、舌下、吸入、肌肉、肠内、唾液腺、鼻内、脂质法，通过吸入、注射、阴道、眼内等方法给药。优选的方法为静脉输注或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。
本发明的新型长效胸腺肽蛋白及其衍生物或其药物组合物，作为免疫调节剂药物可用于治疗机体免疫功能低下如复发性口疮、麻风、重症感染、慢性肾炎等，病毒性肝炎(乙肝、丙型肝炎等)及其它的病毒感染性疾病、肿瘤、类风湿等各种适应性疾病的治疗。
采用基因工程方法表达胸腺肽是一种简洁有效的途径。生物工程技术的成熟使得胸腺肽在不同工程菌中的表达不存在技术障碍，这一点从国内外文献[11，12，21]中关于其在不同工程菌中的成功表达的报道中不难发现，但是作为小分子蛋白其表达后往往纯化困难，难以实现产业化，这也是目前该药的临床应用主要来源于动物组织的提取及固相人工合成的主要原因。尽管也有文献报道了将胸腺肽与硫氧环蛋白进行的融合表达[22]。但是这种方法表达的融合蛋白还要经过一次酶切后才能获得最终的重组胸腺肽，这样就要经过两次纯化，不仅会因此影响胸腺肽的活性而且不利于大规模的工业化生产。白蛋白是机体正常存在的大分子蛋白，不具有酶学和免疫学特性，也是很多药物的载体，本发明采用将胸腺肽与白蛋白融合表达，无需酶切即得到大分子的具有生物活性的重组蛋白，易于纯化，而且胸腺肽的半衰期得到延长。这一结论业已得到我们的实验支持，而且我们还惊喜的发现，胸腺肽与白蛋白的融合在不同的连接方式即白蛋白C-和N-同时连接胸腺肽，与白蛋白C-或者N-连接胸腺肽，会产生不同的效果。我们的实验研究发现，重组的Tα1-HSA-Tα1要比HSA-Tα1，HSA-TP5，具有高更的生物活性和半衰期。这一点将在我们下面的例证加以说明。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
SEQ ID NO1为人血清白蛋白的基因和蛋白质序列
SEQ ID NO2为胸腺肽α1的基因和蛋白质序列SEQ ID NO3为胸腺肽九肽的基因和蛋白质序列SEQ ID NO4为胸腺肽α原的基因和蛋白质序列SEQ ID NO5为胸腺肽五肽的基因和蛋白质序列图1为质粒pPIC9K/HSA-Tα1的构建过程图2为质粒pPIC9K/Tα1-HSA-Tα1的构建过程图3为质粒pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)n-Tα1的构建过程图4为质粒Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1融合蛋白的构建过程图5为质粒pPIC9K/HSA-TP5的构建过程图6为重组胸腺肽蛋白的分离纯化结果其中1为标准蛋白，2为超滤浓缩液，3为DEAE纯化样品，4为亲和层析bule-sepharose纯化样品，5为疏水纯化样品图7为重组胸腺肽蛋白的活性分析图8为重组胸腺肽蛋白大鼠单剂量静注给予后的药时曲线
具体实施例方式实施例1HSA cDNA的克隆构建提取的人肝脏组织mRNA，将100mg人肝脏组织直接放入研钵中，加入少许液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，加TRIzol试剂1ml，转入离心管，室温放置5min。4℃(12000g)离心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，盖紧离心管盖，手摇剧烈震荡15s，然后冰浴放置15min，于4℃(12000g)离心15min，RNA存于上层水相中。转移水相至另一个干净的离心管中，加异丙醇0.5ml，混匀，室温放置10min以沉淀RNA，然后于4℃(12000g)离心10min。移去上清液，加75％乙醇1ml洗涤沉淀，经漩涡振荡，然后于4℃(7500g)离心5min，回收RNA沉淀。移去上清液，将离心管置空气中干燥，挥去乙醇，沉淀用50ul无核糖核酸酶(RNase)的水(焦碳酸二乙酯处理)溶解，65℃放置15min使变性，立即置冰上备用或冻于-70℃冰箱中保存。肝组织总RNA2μl，水4μl，随机引物4μl，总体积20μl振荡混匀，在反转录酶的作用下合成相应的cDNA。
按照GENBANK中的人血清白蛋白成熟肽序列合成引物，上下游引物分别引入EcoRI和BspTI的酶切位点和保护碱基。
上游引物序列5’-ATGCGAATTCGATGCACAAGAGTGAGGTT-3’下游引物序列5’-ATGCCTTAAGTAAGCCTAAGGCAGCTTGACT-3’引物委托上海英骏生物公司合成。PCR方法为100μl反应体系中加入1.5μl的肝组织cDNA，20μmol/L的上下游引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反应缓冲液10μl，TaqDNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、Taq DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)。用Bio-Rad公司的PCR仪扩增DNA，PCR条件为94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，54℃退火45秒，72℃延伸3分钟，循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约1.8kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。取纯化的HSA cDNA3μl，加入1μlpGEM-T载体，5μl 2×反应缓冲液，1μlT4 DNA连接酶催化连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α后，辅于x-gal、IPTG和氨苄青霉素(100μg/μL)的LB琼脂平板，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，所得阳性克隆委托上海英骏生物公司测序，测序结果与已公布的序列一致。
实施例2Tα1基因的合成根据已知的胸腺肽α1基因序列，合成两条寡核苷酸引物，利用两条引物互相作为模板进行PCR扩增Tα1基因。并在Tα1基因的两端分别引入BspTI和NotI的酶切位点。
上游引物序列5’-ATGCCTTAAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGTAGTGAAATTACTACTAAGGATTTGAAG-3’下游引物序列5’-ATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCCTTCTTTTCCTTCAAATCCT-3’引物委托上海英骏生物公司合成。100μl反应体系中加入20μmol/L的上下游引物各3μl，2mmol/L的dNTP 10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)。用Bio-Rad公司的PCR仪扩增DNA，PCR条件为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环25次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约0.1kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收，4℃保存。
实施例3HSA-Tα1融合蛋白的构建[23]为使表达的融合蛋白能分泌到酵母胞外，选择pPIC9K质粒作为载体，在该载体的MCS的EcoRI和NotI位点插入融合蛋白的基因。将实施例1、实施例2得到的产物及pPIC9K质粒分别用EcoRI/BspTI，BspTI/NotI和EcoRI/NotI酶切。将酶切后纯化的HSA cDNA片段、Tα1基因片段和线性化的pPIC9K质粒按照合适的摩尔比用T4DNA连接酶催化连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α后，辅于含氨苄青霉素(100μg/μL)的LB琼脂平板，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，所得阳性克隆委托上海英骏生物公司测序，因此获得阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/HSA-Tα1，简称pPIC9K/H-T)，质粒的构建过程如图1所示(实验中的内切酶、连接酶、试剂盒等购自天为时代公司)。
实施例4Tα1-HSA-Tα1融合蛋白的构建以pPIC9K/HSA-Tα1为模板，依SOE-PCR(splicing by overlap extension，简称SOE)原理，构建出融合蛋白Tα1-HSA-Tα1。其引物可用T15’-ATGCGAATTCAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGTAGTGAAATTACTACTAAGGATTTGA-3’T25’-ATGCGAATTCAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGTAGTGAAATTACTACTAAGGATTTGA-3’T35’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTC-3’引物委托上海英骏生物公司合成。PCR方法为在100μl反应体系中加入2μl的pPIC9K/H-T重组质粒，20μmol/L的T2、T3引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)。PCR条件为94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸3分钟，循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约2kb)的条带，PCR产物T2HT3用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收，4℃保存。另在100μl反应体系中加入2μl的PCR产物T2HT3，20μmol/L的T1、T3引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)。PCR条件为94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸3分钟，循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约2kb)的条带，PCR产物T1HT3用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收，4℃保存。pPIC9K载体用EcoRI/NotI酶切，回收线性化的载体；另将上述PCR产物T1HT3用EcoRI/NotI切，用凝胶回收试剂盒直接回收。将线性化的载体及回收的PCR产物T1HT3用T4 DNA连接酶催化连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α后，辅于含氨苄青霉素(100μg/μL)的LB琼脂平板，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，所得阳性克隆委托上海英骏生物公司测序，因此获得阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/Tα1-HSA-Tα1)。质粒的构建过程如图2所示(实验中的内切酶、连接酶、试剂盒等购自天为时代公司)。
实施例5HSA-(Gly4Ser)n-Tα1融合蛋白的构建[24，25]以实施例3中构建的质粒pPIC9K/HSA-Tα1为模板，在HSA基因的XbaI位点处设计引物，在HSA和Tα1间可以加入多种柔性接头，如[Gly Gly Gly Gly Ser]n，n可以是1-10。
如用[Gly Gly Gly Gly Ser]2作为接头时，可合成寡聚核苷酸H2a5’-CCACTCTAGAGAAGTGCTGTGC-3’H2b5’-ACCTCCGGATCCACCGCCCCCTAA-3’T2a5’-GCGGTGGATCCGGAGGTGGGGGCTCTAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGT-3’T2b5’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTC-3’如用[Gly Gly Gly Gly Ser]3作为接头时，可合成寡聚核苷酸H3a5’-CCACTCTAGAGAAGTGCTGTGC-3’H3b5’-CTCCGGATCCACCGCCCCCAGACCCACCTCCACCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCA-3’T3a5’-GCGGTGGATCCGGAGGTGGGGGCTCTAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGT-3’T3b5’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTC-3’引物委托上海英骏生物公司合成。PCR方法为100μl反应体系中加入2μl的pPIC9K/H-T重组质粒，20μmol/L的H2a、H2b(或H3a、H3b)引物各3μl，2mmol/L的dNTP 10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)。用Bio-Rad公司的PCR仪扩增DNA，PCR条件为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约0.75kb)的条带，PCR产物H2(或H3)用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收，4℃保存。另在100μl反应体系中加入2μl的pPIC9K/H-T重组质粒，20μmol/L的T2a、T2b(或T3a、T3b)引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U。PCR条件为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约0.1kb)的条带，PCR产物T2(或T3)用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收，4℃保存。将前述的PCR产物H2(或H3)、T2(或T3)，分别用限制性内切酶BamHI酶切后，产物用T4DNA连接酶催化连接，得产物HT。首先pPIC9K/H-T质粒用EcoRI/XbaI酶切成三段，回收大小约1kb的H小片段；pPIC9K载体用EcoRI/NotI切，回收线性化的载体；另将上述连接产物HT用XbaI/NotI酶切，用凝胶回收试剂盒直接回收。将大小约1kb的H小片段、线性化的载体及回收的HT的酶切产物用T4DNA连接酶催化连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α后，辅于含氨苄青霉素(100μg/μL)的LB琼脂平板，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，所得阳性克隆委托上海英骏生物公司测序，因此获得阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)2-Tα1)、阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)3-Tα1)。这些质粒的构建过程如图3所示(实验中的内切酶、连接酶、试剂盒等购自天为时代公司)。
实施例6Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1融合蛋白的构建以实施例5中构建的质粒pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)n-Tα1为模板，依SOE-PCR(splicingby overlap extension，简称SOE)原理，构建出融合蛋白Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1。
如用[Gly Gly Gly Gly Ser]3作为接头时，可用合成寡聚核苷酸T15’-ATGCGAATTCAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGTAGTGAAATTACTACTAAGGATTTGAAGGAAAAGAAGGAAGTTGTTGAAGAAGC-3’T25’-AAAAGAAGGAAGTTGTTGAAGAAGCTGAAAACGGGGGCGGTGGATCGGGAGGTGGGGGCTCTGGTGGAGGTGGGTCTGATGCACACA-3’T35’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTC-3’
引物委托上海英骏生物公司合成。PCR方法为在100μl反应体系中加入2μl的pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)3-Tα1重组质粒，20μmol/L的T2、T3引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)。PCR条件为94℃变性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸3分钟，循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约2kb)的条带，PCR产物T2HT3用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收，4℃保存。另在100μl反应体系中加入2μl的PCR产物T2HT3，20μmol/L的T1、T3引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)。PCR条件为94℃变性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸3分钟，循环30次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约2kb)的条带，PCR产物T1HT3用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收，4℃保存。pPIC9K载体用EcoRI/NotI切，回收线性化的载体；另将上述PCR产物T1HT3用EcoRI/NotI切，用凝胶回收试剂盒直接回收。将线性化的载体及回收的PCR产物T1HT3用T4 DNA连接酶催化连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α后，辅于含氨苄青霉素(100μg/μL)的LB琼脂平板，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，所得阳性克隆委托上海英骏生物公司测序，因此获得阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1)。这些质粒的构建过程如图4所示(实验中的内切酶、连接酶、试剂盒等购自天为时代公司)。
实施例7HSA/TP5融合蛋白的构建以实施例4中构建的质粒pPIC9K/HSA-Tα1为模板，在HSA基因的XbaI位点处设计引物，依SOE-PCR原理，构建出融合蛋白HSA/TP5。
其引物可用H55’-CCACTCTAGAGAAGTGCTGTGC-3’T55’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTAAACATCCTTTCTTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGC-3’引物委托上海英骏生物公司合成。PCR方法为100μl反应体系中加入2μl的pPIC9K/HSA-Tα1重组质粒，20μmol/L的H5，T5引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)。用Bio-Rad公司的PCR仪扩增DNA，PCR条件为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，循环25次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(约0.75kb)的条带，PCR产物T5用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。首先pPIC9K/H-T重组质粒用EcoRI/XbaI酶切成三段，回收1kb的H小片段；pPIC9K载体用EcoRI/NotI切，回收线性化的载体；另将上述PCR产物用XbaI/NotI切，直接回收。将1kb的H小片段、线性化的载体及回收的PCR产物用T4DNA连接酶催化连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α后，辅于含氨苄青霉素(100μg/μL)的LB琼脂平板，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，所得阳性克隆委托上海英骏生物公司测序，因此获得阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/HSA-TP5)。质粒的构建过程如图5所示(实验中的内切酶、连接酶、试剂盒等购自天为时代公司)。
实施例8毕赤酵母工程菌的构建及高拷贝工程菌株的筛选[26]将实施例3、例4、例5、例6、例7中构建的阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/HSA-Tα1)、阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/Tα1-HSA-Tα1)、阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)n-Tα1)、阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/HSA-TP5)、阳性克隆大肠杆菌DH5α(pPIC9K/Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1)分别培养扩增后，各纯化质粒约10μg，用SalI酶切。线性化后分别转化毕赤酵母GS115(Invitrogen Corp.USA公司酵母表达试剂盒提供的方法)，转化后的GS115，分别铺于MD琼脂平皿(2％琼脂，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10-5％生物素，2％葡萄糖)，30℃培养2-5天，挑取His+克隆。用灭过菌的牙签将每个克隆同时点种于MM、MD[2％琼脂，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp.)，4×10-5％生物素，2％甲醇]平板的对应位置上，30℃培养3-6天，平板上菌落均会有所生长，只有在MM平板上生长的菌落和MD平板上生长的菌落大小相差不多的菌株才为Mut+表型。将获得的His+Mut+转化子分别用牙签点种于不同浓度的G418平板，G418浓度分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml，30℃培养3-6天。根据各克隆耐受G418的情况，选出含有不同拷贝数的转化子。挑选经筛选的单菌落，置于装有50mlYPD(1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)培养基的250ml摇瓶中，30℃、250rpm培养24小时。按照1％接菌量取菌液接入BMGY[1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp.)，4×10-5％生物素，1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，1％甘油，10％磷酸钾缓冲液(pH6.0)]培养基中，30℃、250rpm培养至OD600＝2-8，室温下10000rpm离心5min，收集菌体，用1/5原培养体积的BMMY[1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp.)，4×10-5％生物素，1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，1％甲醇，10％磷酸钾缓冲液(pH6.0)]培养基重悬菌体，放置于30℃、250rpm的摇床上继续生长，每24h向BMMY培养基中添加甲醇至终浓度0.5％，按时间点分别取菌液样品，取样0.5ml，置于1.5mlEP管中，12000rpm离心5min，收集上清，SDS-PAGE凝胶电泳分析，筛选出表达量最高的菌株，以其作为表达融合蛋白的目标菌株。
实例9工程酵母的发酵以实施例4构建的Tα1-HSA-Tα1表达融合蛋白的工程酵母发酵和融合蛋白的纯化为例，其他工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化可用相同或相似的方法。
方案1从斜面上各挑取一环菌分别接入5瓶25ml/250ml三角烧瓶的YPD培养基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)中，30℃，250r/min振荡培养24小时；按1％接菌量取0.5ml上述培养的菌液接入25瓶50ml/500ml三角烧瓶的BMGY培养基中(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，pH6.0的0.1mol/L磷酸钾缓冲液，1.34％YNB，4×10-5％生物素(过滤除菌)，甘油10g/L)，30℃，250r/min振荡培养30小时；离心上述菌液收集菌体，用BMMY培养基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)1.34％YNB，4×10-5％生物素(过滤除菌))洗涤菌体沉淀，一并转入50ml/500ml BMMY三角烧瓶的培养基中；30℃，250r/min振荡培养12小时，补加甲醇至终浓度0.5％，每24小时补加一次，诱导表达4-7天，8000r/min离心收集上清，得大约1L的发酵液。
方案2工程酵母接种100mLYPD培养基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)摇床30℃，250转/分培养30小时。接种至装有15L基础培养基的20L发酵罐(B.BranCorp.Germany)，其中基础培养基的配制方法为85％的磷酸3.7mL/L，CaSO40.16g/L，K2SO42.6g/L，MgSO4.7H2O 1.95g/L，KOH 0.68g/L，30ml/L的甘油，121℃高压灭菌20分钟，1ml/LPTM(包括CuSO4.5H2O 6.0g/L，Cocl22H2O 3.0g/L，MnSO4.H2O 3.0g/L，H3BO40.02g/L，FeSO47H2O 65.0g/L，NaMoO42H2O 0.2g/L，ZnSO47H2O 20.0g/L，KI 0.1g/L，浓H2SO45ml/L，0.5ml/L 0.02％生物素，过滤除菌)。接种前用浓氨水将培养基pH调至5.8-6.0，发酵过程控制温度为30℃，溶氧大于20％饱和度，pH用25％氨水维持在5.8-6.0，培养至甘油耗尽后，此时溶氧陡然上升，开始流加甘油(50％的甘油含12ml/L的PTM)，继续培养，至菌体密度OD600值约为350时，开始补加甲醇(分析纯甲醇含12ml/L的PTM)诱导。诱导培养48-72小时。
实例10融合蛋白的纯化方案1收集发酵液样品，8000转/分离心20分钟，离心取上清超滤，收集滤液。利用全自动蛋白层析系统通过阳离子交换层析，疏水层析和阴离子交换层析对目的融合蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析呈电泳纯为均一条带。
方案2收集发酵液样品，8000转/分离心20分钟，离心取上清超滤，收集滤液。取滤液离心取上清，用bule-sepharose(Amersham产品)亲和色谱进行分离，上样缓冲液为pH为4.0-6.0缓冲液，上样平衡后用2.0M的Nacl进行吸脱，收集含有目的蛋白的洗脱峰；超滤浓缩后用Phenyl Sepharose 6 F.F(Amersham产品)疏水填料进行柱层析分离，为6.0-8.0的缓冲液，上样平衡后用0-1.5M的缓冲液进行剃度吸脱，收集吸脱液；超滤浓缩后用DEAESepharose(Amersham产品)阴离子交换色谱进行分离，上样缓冲液为pH为6.0-8.0的缓冲液，上样平衡后用0-1.0M的Nacl进行剃度吸脱，收集目的峰，即为纯化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈电泳纯为均一条带。如图4。其中1为分子量标准，自上而下分别为94，67，43，30KD。
实例11新型胸腺肽融合蛋白的生物活性及非临床药动学评价细胞活性分析1制备小鼠脾细胞悬液(1)脱臼处死小鼠，置75％乙醇中浸泡消毒。剪开腹腔，分离脾脏，在不同的平皿中用Hanks液洗净血迹，去除结缔组织。(2)在有少量细胞培养液的平皿中，用无菌注射器芯将脾脏挤压过100目的钢丝网，得到单个细胞。(3)用1％台盼蓝染色法检测细胞活力，计数细胞。再用含10％小牛血清的细胞培养液将脾细胞配成6-8×10-6个细胞/mL，将细胞悬液，以100μl/孔铺96孔板。2MTT法测定细胞增殖(1)将纯化的样品用0.22μm滤膜无菌过滤，不同剃度稀释；市售人工合成的胸腺肽α1和胸腺五肽作为阳性对照溶解后同法处理稀释；另以缓冲液作为阴性对照。每孔加100μl样品，复3孔。(2)将96孔板置于37℃，5％CO2孵箱中44h后用MTT法测定。结果见图7，说明等摩尔的重组胸腺肽蛋白HSA-Tα1与等摩尔对照胸腺肽α1，等摩尔的HSA-TP5与等摩尔的对照TP5相比，显示重组胸腺肽蛋白的活性较对照为低，但差异不明显。等摩尔的重组蛋白Tα1-HSA-Tα1活性要明显好于等摩尔的对照，而且等摩尔的重组胸腺肽Tα1-HSA-Tα1的活性也要明显好于HSA-Tα1和HSA-TP5。
大鼠静脉注射给予重组HSA-Tα1，HSA-TP5，Tα1-HSA-Tα1胸腺肽蛋白，分别于0.016，0.083，0.167，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，72，120小时的不同的时间采样，用碘示踪法测定血中胸腺肽浓度，其中药—时曲线见图8，实验结果中不同大鼠的个体差异比较明显，胸腺肽蛋白Tα1-HSA-Tα1，HSA-Tα1，HSA-TP5显示了比胸腺肽Tα1更长的半衰期，Tα1-HSA-Tα1显示了比HSA-Tα1，HSA-TP5更长的半衰期。
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SEQ ID NO1为人血清白蛋白的基因和蛋白质序列1GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA451Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly1546 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT9016 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr3091 CTT CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA13531 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu45136 GTA ACT GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTT GCT GAT GAG TCA GCT GAA18046 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu60181 AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC22561 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys75226 ACA GTT GCA ACT CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC27076 Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys90271 TGT GCA AAA CAA GAA CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC31591 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His105316 AAA GAT GAC AAC CCA AAC CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT360106 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val120361 GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG405121 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu135406 AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT450136 Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr150451 GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT AAA GCT GCT TTT495151 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe165496 ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT GCC TGC CTG TTG CCA540166 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro180541 AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA585181 Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys195586 CAG AGA CTC AAG TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA GAA AGA GCT630196 Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala210
631 TTC AAA GCA TGG GCA GTA GCT CGG CTG AGC CAG AGA TTT CCC AAA675211 Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys225676 GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC AAA720226 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys240721 GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT765241 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp255766 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAA GAT TCG810256 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser270811 ATC TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA855271 Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu285856 AAA TCC CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT900286 Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala300901 GAC TTG CCT TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT945301 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val315946 TGC AAA AAC TAT GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT990316 Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe330991 TTG TAT GAA TAT GCA AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG1035331 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu3451036 CTG CTG AGA CTT GCC AAG ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC1080346 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys3601081 TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT1125361 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp3751126 GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA1170376 Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln3901171 AAT TGT GAG CTT TTT GAG CAG CTT GGA GAG TAC AAA TTC CAG AAT1215391 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn4051216 GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA CCC CAA GTG TCA ACT1260406 Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr4201261 CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA GTG GGC AGC1305421 Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser4351306 AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC TGT GCA GAA1350
436 Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu4501351 GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG CAT GAG1395451 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu4651396 AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACC AAA TGC TGC ACA GAA TCC1440466 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser4801441 TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA148548l Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu4951486 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT1530496 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His5101531 GCA GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA1575511 Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys5251576 CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA1620526 Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr5401621 AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA1665541 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val5551666 GAG AAG TGC TGC AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG1710556 Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu5701711 GAG GGT AAA AAA CTT GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA1755571 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly LeuSEQ ID NO2为胸腺肽α1的基因和蛋白质序列1AGT GAT GCT GCT GTT GAT ACT AGT AGT GAA ATT ACT ACT AAG GAT451Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp1546 TTG AAG GAA AAG AAG GAA GTT GTT GAA GAA GCT GAA AAC8416 Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn28SEQ ID NO3为胸腺肽九肽的基因和蛋白质序列1GAA GCT AAG AGT GAA GGC GGC AGT AAC271Glu Ala Lys Ser Gln Gly Gly Ser Asn9
SEQ ID NO4为胸腺肽α原的基因和蛋白质序列1ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC AAG451Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys1546 GAC TTA AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCA GAA AAT GGA9016 Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly3091 AGA GAC GCC CCT GCT AAC GGG AAT GCT AAT GAG GAA AAT GGG GAG13531 Arg Asp Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu45136 CAG GAG GCT GAC AAT GAG GTA GAC GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG18046 Gln Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly60181 GAG GAA GAG GAG GAG GAA GAA GAA GGT GAT GGT GAG GAA GTG GAT2256l Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Val Asp75226 GGA GAT GAA GAT GAG GAA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAG CGG GCA27076 Gly Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala90271 GCT GAA GAT GAT GAG GAT GAC GAT GTC GAT ACC AAG AAG CAG AAG31591 Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys105316 ACC GAC GAG GAT GAC TAG333106 Thr Asp Glu Asp Asp End11lSEQ ID NO5为胸腺肽五肽的基因和蛋白质序列1AGA AAG GAT GTT TAC151Arg Lys Asp Val Tyr权利要求
1一种新型的长效胸腺肽蛋白，包括与序列表中SEQ ID No1血清白蛋白或者与血清白蛋白至少85％序列同源的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽或者与胸腺肽至少85％序列同源的第二区，和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQID No2-5胸腺肽或者与胸腺肽至少85％序列同源的第三区，所述的胸腺肽蛋白可以由上述的第一区，第二区和第三区同时连接构成，也可以由第一区和第三区或者第一区和第二区连接构成。
2根据权利要求1所述的新型长效胸腺肽蛋白，其特征是所述胸腺肽蛋白包括与序列表中SEQ ID No1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽氨基酸序列相同的第二区和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽氨基酸列相同的第三区，或者上述三区的功能等同物。所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
3根据权利要求1和2所述的新型长效胸腺肽蛋白，其特征是所述连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽氨基酸列相同的第二区和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽氨基酸列相同的第三区，可以是相同的序列，也可以是不同的序列。
4根据权利要求1和2所述的新型长效胸腺肽蛋白，其特征是所述连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二区和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三区同时连接在血清白蛋白的C-末端及N-末端，所述与血清白蛋白同源的第一区位于胸腺肽蛋白的中间。
5根据权利要求1和2所述的新型长效胸腺肽蛋白，其特征是所述与血清白蛋白同源的第一区可以与连接在血清白蛋白的C-末端的与序列表中SEQ ID No2-4胸腺肽同源的第二区连接，而不与连接在血清白蛋白的N-末端的与序列表中SEQ ID No2-4胸腺肽同源的第三区连接形成融合蛋白。
6根据权利要求1和2所述的新型长效胸腺肽蛋白，其特征是所述与血清白蛋白同源的第一区可以与连接在血清白蛋白的N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三区连接，而不与连接在血清白蛋白的C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二区连接形成融合蛋白。
7根据权利要求1-6中任何一项所述的新型长效胸腺肽蛋白，其特征是所述与血清白蛋白同源的第一区与连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二区、血清白蛋白同源的第一区与连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三区直接连接，不设连接肽。
8根据权利要求1-6中任何一项所述的新型长效胸腺肽蛋白，其特征是所述与血清白蛋白同源的第一区与连接在血清白蛋白的C-末端的与序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二区，血清白蛋白同源的第一区与连接在血清白蛋白N-末端的序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三区之间设有连接肽，连接肽的较优选的长度为2-100个氨基酸残基，更优选的连接肽的长度为5-50个氨基酸残基。其中优选的连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n为1-10的整数，更优选的是1-5。
9根据权利1-8中要求，一种编码任一的多肽、蛋白、融合蛋白的多聚核苷酸序列。携带有该多聚核苷酸序列的载体，其中提供携带编码融合蛋白的基因序列的重组表达载体，较优选的是以pPIC9、pPIC9K为载体的重组表达载体。
10根据权利要求1所述的新型长效胸腺肽蛋白，其特征是表达融合蛋白的宿主是细菌、酵母、动物细胞、植物细胞以及含有本发明融合蛋白基因序列的转基因动、植物。优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是GS115。
11根据权利要求1-10中任何一项所述的新型长效胸腺肽蛋白，在免疫性缺陷性疾病及各种适应性疾病治疗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新型长效胸腺肽的制备及其医疗用途，包括编码该蛋白的DNA序列，携带该DNA序列的宿主细胞。本发明的新型长效胸腺肽蛋白包括与血清白蛋白至少85％序列同源的第一区，连接在血清白蛋白C－末端与胸腺肽至少85％序列同源的第二区和与连接在血清白蛋白N－末端与胸腺肽至少85％序列同源的第三区，可以是由第一二三区同时构成，也可以由第一区与第二和第三区任意连接构成。本发明长效胸腺肽蛋白的第一区与第二区之间，第一区与第三区之间可以设有连接肽，连接肽可以是一个也可以是多个；实验证实本发明的长效胸腺肽既有胸腺肽的生物活性，又具有较长的半衰期，这种长效胸腺肽可用于免疫缺陷性疾病及各种适应性疾病的治疗。
文档编号C07K14/435GK101067000SQ20071002164
公开日2007年11月7日 申请日期2007年4月20日 优先权日2007年4月20日
发明者陈建华, 张新国, 闫璐颖, 殷艺伟, 唐莉 申请人:中国药科大学