专利名称：一种合成胸腺肽α1的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种合成的胸腺肽α 1的分离纯化方法，属于生物药品制备工艺领域。
背景技术：
胸腺肽α 1(Τα 1)是胸腺素主要的生物活性成分，为人体内重要的免疫调节物质，研究表明，胸腺肽α 1促进骨髓肝细胞发育分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞，诱导T淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的T细胞进一步分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞；诱导T淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的T细胞进一步分化为几个不同的亚群，如杀伤细胞、记忆细胞、效应细胞、辅助T淋巴细胞等，并产生各种可溶性介质；增强淋巴细胞对有丝分裂的反应，并可增加淋巴组织的蛋白质和核酸的合成；增加IFN-γ、IFN-α、IL_2、IL-3和淋巴毒素的生成，增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应；抑制自身免疫反应；恢复抑制性T细胞的功能。胸腺肽α 已被广泛应用于临床，治疗多种疾病，如用于慢性乙型肝炎的治疗、用于丙型肝炎、肝细胞癌、恶性黑色素瘤的治疗；用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗。胸腺肽是一种由观个氨基酸组成的生物活性多肽，等电点为4. 2，分子量为3108 道尔顿。目前，国内外Τα 1的生产方法主要有3种，即组织提取法、基因工程法和化学合成方法，其中，固相化学合成法制备T a 1已成为主流技术之一。程虎(程虎，韦萍，朱颐申.固相合成胸腺素a 1.南京工业大学学报[J], 2004,26(2) 78)利用Fmoc-Asn(Trt)-Wang resin为起始，合成得到胸腺肽a 1。韩香(韩香，顾军，苑庆兰，等.人胸腺肽al 的固相合成及体外活性研究.中国药物化学杂志[J].2004，14(l) 27)也通过采用 Fmoc-Asn(Trt)-Wang resin固相树脂合成得到人胸腺肽α 1。由于在Fmoc固相方法合成Τα 1过程当中，每一步的连接效率不可能达到100%， 中间会出现各种副反应、消旋化等问题，使得合成此多肽是一种低纯度的粗产品，这些杂质包括非对映异构的(外消旋)多肽、缺失(不完全)肽、断裂肽、反应副产物、氧化肽、氨基酸侧链的不完全脱保护所形成的副产物、合成中所用的毒性试剂和溶剂等，这些副产物有的与目标产物结构上很相近的物质，结构差异小，物理化学性质也很接近，这样便增加了分离纯化的难度及成本，如在观位Ser容易出现消旋杂质，其理化性质与目标T a 1及其相似，因此分离纯化问题也是化学合成多肽中的一个最大障碍。目前，化学合成多肽常规分离方法是采用大分子如蛋白质等化合物的分离方法， 其常用手段有三种凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱。分离固相合成Ta 1 的纯化方法多采用两步分离法，即首先采用离子交换色谱柱除去粗品中的绝大多数的杂质，然后，再采用反相高效液相色谱进行最后的纯化，再将高效液相中纯化后的Ta 1进行真空减压浓缩，除去其中的有机溶剂，如经常会用到的乙腈，且由于在工业化生产过程中， 生产制备的药液体积大，采用旋转真空浓缩，需要在一定的温度下进行，但肽或蛋白类药物又不宜在较高的温度下浓缩，只能控制相对低的温度进行真空浓缩，浓缩所需的时间长，而肽或蛋白类药物在长时间加热的情况下，容易变性失活。尽管，纳滤技术应用已很广，但其在分离或浓缩寡肽时，都是通过纳滤浓缩除去一些小分子氨基酸或可用纳滤膜分级的短肽，或者对单价盐或多价盐的截留，而对混在多肽或蛋白中的有机溶剂，通常都是用真空浓缩技术，除去其中的有机溶剂，未见采用纳滤技术除去肽中的有机溶剂的方法应用。中国专利CN1152052C也公开了一种制备胸腺肽的工艺方法，其包括对新鲜的胸腺勻浆液进行破碎、离心、超滤截留分子量为6000-10000，然后再对超滤液进行纳滤浓缩，除去一些无机盐、短肽及氨基酸类的水溶性成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离纯化合成的Ta 1(胸腺肽a 1)的方法，本发明中，在浓缩经反相高效液相精纯的T a 1溶液时，采用膜浓缩的方式，具体为采用纳滤膜浓缩的方式进行浓缩除去小分子杂质，如在液相分离过程中带进来的有机溶剂乙腈，浓缩效率高，时间短，且只需在常温甚至低于常温的环境中就可进行，大大降低了 Ta 1在高温环境下长期接触而导致T a 1变性失效的风险。具体地，本发明涉及1、一种合成胸腺肽α 1的分离纯化方法，包括(1)用离子交换色谱纯化合成的粗肽；(2)反相液相色谱进一步精制纯化经离子交换色谱处理后的多肽；(3)将精制后的多肽浓缩，除去其中的有机溶剂；(4)浓缩液转盐、冻干干燥得成品；其中，所述的浓缩是采用膜过滤浓缩。2、项1中的分离纯化方法，其中所述的膜过滤浓缩是纳滤膜浓缩，纳滤膜孔径为 50-1000道尔顿。3、项1中的分离纯化方法，其中所述的离子交换柱纯化合成的粗肽中，所用的离子交换柱为阴离子交换柱。4、项3所述的分离纯化方法，其中所述的阴离子交换柱为弱阴离子交换柱。5、项4所述的分离纯化方法，其中所述的弱阴离子交换柱为DEAE sepharoseFast Flow离子交换柱。6、项1所述的分离纯化方法，其中阴离子交换柱的洗脱液为pH为5. 8的PB缓冲液A和pH为5. 8的PBS缓冲液B，梯度洗脱。7、项1所属的分离纯化方法，其中反相液相色谱柱为C18反相液相色谱柱。8、项1所述的分离纯化方法，其中反相液相色谱洗脱系统为含0. TFA的12% 的乙腈水溶液和含0. 1% TFA的20%的乙腈水溶液系统，梯度洗脱。9、项1所述的分离纯化方法，其中所述的转盐步骤中为采用反相色谱转盐，转盐缓冲液为醋酸溶液，转盐洗脱液为乙腈水溶液。10、项9所述的分离纯化方法，其中所述的醋酸缓冲液为0. 05-0. 5mol/L的醋酸溶液，所述的乙腈水溶液为质量百分数5% -30%的乙腈水溶液。在项1或项2中，浓缩采用的膜为耐有机溶剂的滤膜。
具体实施例方式本发明的目的是在于提供一种能提高胸腺肽α 1工业化生产效率的制备工艺，本发明所采用的工艺是对经固相合成的粗肽(Τα 1粗肽)先经离子交换柱色谱除去大部分的一些杂质，经离子色谱纯化后的Ta 1粗肽，再用反相液相色谱柱精制纯化，经反相液相色谱柱精制后的Ta 1溶液，采用膜过滤的方式浓缩以除去有机溶剂，以加快浓缩效率，降低 Tal长时间在高温环境下造成的变性的风险。本发明中，术语“膜过滤浓缩”是一种采用超滤膜进行分子截留，将不同大小分子通过不同的滤膜孔径以达到浓缩纯化的目的。在用膜过滤进行浓缩时，可以是在常压条件下进行过滤浓缩，也可以是在加压的条件下过滤浓缩。在本发明中，所采用的膜过滤方式为纳滤膜过滤，术语“纳滤膜”是指一种半透膜，能够允许溶剂分子或某些低分子量溶质或低价离子透过的一种功能性半透膜，在此用来浓缩本发明纯化后的T a 1，滤膜孔径大小为 50-1000道尔顿，优选为50-500道尔顿，更优选为50-200道尔顿。所用的膜为耐有机溶剂的膜。本发明中，术语“离子交换树脂”，可以是使用阳离子交换树脂，比如732型阳离子交换树脂、DOOl大孔阳离子交换树脂；也可以是阴离子交换树脂，如330碱性环氧系阴离子交换树脂、D301大孔碱性阴离子交换树脂、DEAE sepharose FastFlow阴离子交换树脂，本发明中，优选为阴离子交换树脂，更优选为弱阴离子交换树脂。在对固相法合成的粗肽、用阴离子交换树脂进行初步纯化时，离子交换洗脱系统，可以是用本领域常用的一些混合洗脱系统进行梯度洗脱，如可以是PB-PBS洗脱系统、 Tris-HCl和Tris-HCl-NaCl洗脱系统等缓冲溶液的混合系统梯度洗脱。PB是指磷酸盐缓冲液，即磷酸二氢钠和磷酸氢二钠按一定比例混合成的磷酸盐缓冲液，具体配置的比例，可以按照所需要配置的PH值的不同进行调整，这种缓冲溶液的配置方法是本领域技术人员所熟知的；PBS缓冲溶液是在PB缓冲溶液中加入一定量的NaCl，即可得到。本发明中，所选用的反相液相色谱柱优选为C18反相高效液相制备色谱柱，对经离子交换纯化后的Ta 1进行进一步精制纯化，以除去其中结构、性质极其相似的杂肽，反相液相色谱流动相系统为含0. 1% TFA的12%的乙腈水溶液和含0. 1% TFA的20%的乙腈水溶液系统，梯度洗脱。本发明中，进一步还包括转盐的步骤，以除去在精制纯化过程中带入的对人体有害的酸根离子，如TFA酸根离子。所述的转盐采用反相色谱转盐法，即将纳滤浓缩后的Ta 1 溶液上反相柱，以事先配置好的转盐缓冲液和转盐洗脱液洗脱，收集目标峰部分，即得T a 1 溶液，此时的T a 1溶液已除去TFA酸根离子，体积也相对较小，再次进行浓缩除去有机溶剂 (如乙腈)时，浓缩方法可以是采用真空减压浓缩法，也可以是用纳滤膜进行浓缩。实施例1离子交换色谱纯化固相合成的粗T a 1纯化准备准备容器具，250°C干热除热原或注射用水清洗；配制柱平衡缓冲液 A(20mmol/L PB，pH 5.8)和柱洗脱缓冲液B (20mmol/L PB，500mmol/L氯化钠，pH5. 8)，待用； 取Ta 1粗肽适量，加入柱平衡缓冲液溶解至约10mg/ml，0. 45 μ m过滤制成粗肽液，待用；准备AKTABASIC10制备液相色谱系统，介质为DEAEsepharose Fast Flow(阴离子交换树脂， 优选弱阴离子交换树脂)。将A泵的液体进口放入柱平衡缓冲液，将B泵的液体进口放入柱洗脱缓冲液。加电，开驱动，用柱平衡缓冲液平衡色谱柱，紫外检测器设定220nm，调流速lOOml/min，至基线平衡，待用。目标峰收集按照每毫升介质上样20mg量计算，将粗肽溶液上样。按照下表中的梯度进行洗脱。当步骤3洗脱出的第一个峰的峰高大于IOOmAU时开始收集，当峰高下降低于IOOmAU时停止收集。继续洗脱，直至洗脱步骤完成。收集部分即为Tal收集液I。
权利要求
1.一种合成胸腺肽α 1的分离纯化方法，包括(1)用离子交换色谱纯化合成的粗肽；(2)反相液相色谱进一步精制纯化经离子交换色谱处理后的多肽；(3)将精制后的多肽浓缩，除去其中的有机溶剂；(4)浓缩液转盐、冻干干燥得成品； 其中，所述的浓缩是采用膜过滤浓缩。
2.权利要求1中的分离纯化方法，其中所述的膜过滤浓缩是纳滤膜浓缩，纳滤膜孔径为50-1000道尔顿。
3.权利要求1或2所述的分离纯化方法，其中所述的膜过滤所用的膜为耐有机溶剂的滤膜。
4.权利要求1所述的分离纯化方法，其中所述的离子交换柱纯化合成的粗肽中，所用的离子交换柱为阴离子交换柱。
5.权利要求3所述的分离纯化方法，其中所述的阴离子交换柱为DEAEsepharoseFast Flow离子交换柱。
6.权利要求1所述的分离纯化方法，其中阴离子交换柱的洗脱液为pH为5.8的PB缓冲液A和pH为5. 8的PBS缓冲液B，梯度洗脱。
7.权利要求1所属的分离纯化方法，其中反相液相色谱柱为C18反相液相色谱柱。
8.权利要求1所述的分离纯化方法，其中反相液相色谱洗脱系统为含0.TFA的 12%的乙腈水溶液和含0. 1% TFA的20%的乙腈水溶液系统，梯度洗脱。
9.权利要求1所述的分离纯化方法，其中所述的转盐步骤中为采用反相色谱转盐，转盐缓冲液为醋酸溶液，转盐洗脱液为乙腈水溶液。
10.权利要求9所述的分离纯化方法，其中所述的醋酸缓冲液为0.05-0. 5mol/L的醋酸溶液，所述的乙腈水溶液为质量百分数5% -30%的乙腈水溶液。
全文摘要
本发明涉及一种胸腺肽α1化学合成后的纯化工艺，具体是对经化学合成的胸腺肽α1，其脱盐和浓缩将传统上所使用的离子交换和减压浓缩结合的方式改为纳滤一步完成，本发明工艺简单，效率高，耗能低，非常适合工业化生产。
文档编号C07K1/36GK102477094SQ201010566609
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者吉春, 熊国裕, 许晓 申请人:北京凯因生物技术有限公司, 北京凯因科技股份有限公司