专利名称：对映-松香烷型二萜化合物大叶香茶菜壬、癸素及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体是从中国大叶香茶菜中分离得到的对映-松香烷型二碎化合物大叶香茶菜壬、癸素(macrophyninE， F) 及其制备方法和用途。上述化合物对多种肿瘤细胞抹具有强烈的抑制 作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为治疗各种 临床常见多发癌症的药物。
背景技术：
香茶菜属(Zsod朋)植物隶属唇形科 (Labiatae = Lamiaceae )罗 勒亚科(Ocimoideae),为多年生草本或灌木、半灌木，根茎常肥大木 质，疙瘩状。该属约有植物150余种，产自非洲南部至热带非洲(少 数种)，热带和亚热带亚洲，北达日本、俄罗斯远东地区，少数种产自 马来西亚延至大洋洲及太平洋岛屿。该属植物在我国有90种、21个变 种，遍布全国各地，但以西南诸省种类最多，其中云南分布有48种及 21个变种。香茶菜属植物中的次生代谢成分类型是异常丰富的，根据迄今从 香茶菜属植物中已阐明结构的化合物，除了富含各种类型的对映-贝壳 杉烷类二萜化合物(e",-kauranoids )外，还含有对映-赤霉素烷 (ewf-gibberellane )、 异海松烷 (isopimamne )、 对映-海松烷 (ewf-pimarane )、 +〉香》克(abietane )、 乂于映-+〉香;^ ( ewf-abietane )和半 日花烷(labdane)等四环、三环、二环类二碎化合物。另外还含有单 碎、倍半碎、三萜类化合物和酚性成分(黄酮、木质素、多元酚类化 合物)等。二十世纪八十年代，程培元教授对中国大叶香茶菜进行了化学成 分的研究，从中提取分离得到贝壳杉烷型和对映贝壳杉烷型二薛，并 且对大叶香茶菜中抗肿瘤活性二萜进行了研究，证明大叶香茶菜丙、己、庚、辛素对QGY-7703肝癌细胞具有细胞毒作用，IC5o值(半数抑 制浓度)都在5pg/ml以下。但是，本发明中两种对映-松香烷型二萜类化合物为首次从香茶菜 中分离提取得到的新化合物，在其它天然材料中也未有报道，在已有 文献中也未有关于对映-松香烷型二辟化合物大叶香茶菜壬、癸素及其 药理活性的任何报道，而实验证明这两个化合物具有明显的抑制肿瘤 细胞活性，可以在制备治疗癌症/肿瘤的药物中应用。发明内容在开发利用我国的药用植物资源，从中寻找具有生物活性及药用 前景的天然产物的过程中，研究人员发现，大叶香茶菜(Zso^" macra/ /^/fl ( Migo ))的乙酸乙酯粗提物在体外抗肿瘤筛选实验中对 HepG2肝癌细胞抹显示良好的抑制活性。进一步的生物活性跟踪研究， 导致了对映-松香烷型二碎化合物大叶香茶菜壬、癸素的发现。文献检索表明，大叶香茶菜壬、癸素是结构新颖的对映-松香烷型 二辟化合物。体外抗肿瘤生物活性筛选实验表明，大叶香茶菜壬素对 HepG2人肝癌细胞抹、SW-1990人胰腺胆管癌细胞林、HO-8910人卵 巢癌细胞抹、SMMC-7721人肝癌细胞抹具有强烈的抑制作用；大叶香 茶菜癸素则对HO-8910人卵巢癌细胞抹有抑制作用，可作为一类研制 新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为治疗各种临床常见多发癌症 的药物。因此，本发明的 一个目的在于提供从中国大叶香茶菜中提取分离 得到的两个新的对映-松香烷型二辟化合物大叶香茶菜壬、癸素。本发明的另 一 目的是提供上述对映-松香烷型二碎化合物大叶香茶 菜壬、癸素的制备方法。本发明的又一 目的是提供上述对映-松香烷型二碎化合物大叶香茶 菜壬、癸素在制备治疗癌症和/或肿瘤药物中的应用。本发明的对映-松香烷型二萜化合物大叶香茶菜壬、癸素分别具有如下的化学结构式大叶香茶菜壬素 大叶香茶菜癸素 (Macrophynin E) (Macrophynin F)本发明提供的从大叶香茶菜中提取分离化合物大叶香茶菜壬、癸 素的方法，包括如下步骤l)提取将大叶香茶菜用醇溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸 膏；将该粗浸膏溶于NaCl溶液，混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，所得萃 取液浓缩后得到乙酸乙酯浸膏； 2)分离步骤1)中得到的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石 油醚/丙酮体积比100:0 — 90:10 — 80:20 — 70:30 — 50:50 — 30:70 — 0:100 进行梯度洗脱；其中，石油醚/丙酮体积比80:20洗脱部分，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱纯化，得 到大叶香茶菜癸素；石油醚/丙酮体积比70:30洗脱部分，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱纯化，得 到大叶香茶菜壬素。上述的制备方法中，在步骤l)提取中，所述的醇溶剂优选为95% 乙醇，所述的NaCl溶液优选为0.7~1.5 NNaCl溶液。上述的制备方法中，在步骤l)提取中，所述的醇溶剂提取是采用 常温渗漉提取。上述的制备方法中，所述步骤2 )中石油醚/丙酮体积比80:20洗脱 部分，经Sephadex LH-20凝力交柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/ 曱醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比95:5的氯仿/ 曱醇，将Rf值在0.48 0.53处的洗脱液合并、减压浓缩，得到大叶香茶菜癸素；所述步骤2)中石油醚/丙酮体积比70:30洗脱部分，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱，所得洗 脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比90:10的氯仿/甲醇，将Rf值在 0.45-0.50处的洗脱液合并、减压浓缩，得到大叶香茶菜壬素。本发明对对映-松香烷型二萜化合物大叶香茶菜壬、癸素进行了抗 肿瘤活性测试，表明这些化合物具有明显的抗肿瘤作用。可用于制备 治疗癌症和/或肿瘤的药物。
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。'H-画R用Varian Inova 600型仪测定；MS ( ESIMS及HRESIMS ) 用Q-TOF Micro LC-MS-MS型质谱仪测定；所使用的硅胶，为青岛海 洋化工厂生产；各种溶剂均由国药集团试剂有限公司生产，均为分析 纯。如无特殊说明，以下实施例中涉及到的液/液之间比值均为体积百 分比或体积比。制备实施例对映-松香烷型二辟化合物大叶香茶菜壬、癸素的制备(1)提取大叶香茶菜干重2 kg,用95%乙醇(5L )常温渗漉提 取3次，提取液合并后减压浓缩，所得粗浸膏混悬于500 ml 1NNaCl 溶液，以乙酸乙酯500 ml反复萃取该混悬液3次，所得萃取液合并后 减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏28.8 g。(2 )分离将乙酸乙酯浸膏28.8 g以200-300目硅胶柱层析，以 石油醚/丙酮100:0 —90:10一80:20 —70:30 —50:50 —30:70 —0:100梯度 洗脱，每次用量1000ml;其中，石油醚/丙酮80:20洗脱部分314.3 mg,以Sephadex LH-20 凝胶纯化，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱，所得洗脱液经薄 层层析检测，展开剂为氯仿/曱醇95:5，将Rf值在0.48-0.53处的洗脱 液合并、减压浓缩即得到大叶香茶菜癸素7.3 mg; 石油醚/丙酮70:30洗脱液浓缩物得420.0 mg，该部分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱，所得洗 脱液经薄层层析4全测，展开剂氯仿/曱醇90:10,将Rf值在0.45 0.50处 的洗脱液合并、减压浓缩即得到大叶香茶菜壬素12.7 mg。大叶香茶菜壬素的理化性状如下白色粉末，光学活性[a]D加十 28.4° ( c， 0.32, CHC13); IR谙中出现3500.3cm" (-OH )吸收峰;电 子轰击质谱给出分子离子峰m/z302 [M]+,高分辨电子轰击质谱显示其 分子式为C20H30O2 {m/z 302.2251 [M]+， △ = +0.5 mmu}。 ！H与13C画R 数据见表l。同时，通过测定二维H-H相关谱(DQF-COSY)、 H-C相 关镨(HMQC)、 H-C远程相关谱(HMBC)以及旋转坐标系NOE i普 (ROESY )，确定了所有碳原子和氬原子的信号归属及该化合物的化学 结构。大叶香茶菜癸素的理化性状如下无色针状晶体，光学活性[a]D2Q +44.8° ( c， 0.39， CHC13); IR谱中出现3411.3 (-OH )、 1695.1和1465.7 (a,P-不饱和酮)cm"等吸收峰；电子轰击质谱给出分子离子峰m/z 334 [M]+，高分辨电子轰击质谱显示其分子式为C20H30O4 {m/z334.2l46 [M]+, A = +0.2mmu }。 'H与l3C NMR数据见表1 。同时，通过测定二 维H-H相关谱(DQF-COSY)、 H-C相关i普(HMQC )、 H-C远程相关 i普(HMBC )以及旋转坐标系NOE谱(ROESY),确定了所有碳原 子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。表1大叶香茶菜壬、癸素的氬谱和碳谱数据表(J(Hz)，CDCl3) a'b 大叶香茶菜壬素 大叶香茶菜癸素"H) "C) "H) <5 (C) <formula>formula see original document page 10</formula>H-C (19) 1.06 (s) 26.7 (《) 1,23 (s) 28.3 (g)H-C (20) 1.18 26.0 (《) 1.07 G) 21.9 (g)注aVarian Inova 600 MHz;溶剂CDC13, 5化学位移单位ppm， 'H-NMR和13C-NMR分别以溶剂中残存的氯仿(S 7.26 ppm )和氖代氯 仿内标(5C77.0) ;b核磁共振信号的归属是在HMQC、 HMBC等二维 谱基础上完成的。试验实施例对映4>香烷型二萜化合物大叶香茶菜壬、癸素的体外抗肿瘤活性测试对照组OD值-治疗组OD值肿瘤细胞抑制率(％) = - Xioo%对照组OD值测试原理MTT法活细胞的线粒体中存在与NADP (烟酰胺腺 噤呤二核苦酸磷酸，辅酶II )相关的脱氢酶，可将黄色的噻唑蓝MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl ) -2，5-diphenyl tetrazolium bromide )还/^、 为不溶性的蓝紫色甲臢(Formazan),死细胞中此酶消失，MTT不被还 原。用三联液或者DMSO( 二曱亚砜)溶解曱臢后可用酶标仪在570 nm 处检测光密度(OD)值。光密度值与活细胞数成正比。所用细胞抹为HepG2人肝癌细胞林、SW-19卯人胰腺胆管癌细 胞抹、HO-8910人卵巢癌细胞抹、SMMC-7721人肝癌细胞林。由第二 军医大学提供。实验方法MTT法按不同肿瘤细胞生成速率，将一定数量 (1000-10000个)处于对数生长期的人肿瘤细胞抹接种于％孔培养板
内，在37。C、 5%(202条件下培养6-24小时，细胞贴壁后加入不同浓度 的受试药物(即大叶香茶菜壬、癸素先用DMSO溶解后，再用PBS(磷 酸盐緩沖液)或者生理盐水稀释成不同浓度，因为DMSO对细胞是有 毒性的，会产生假阳性)10^1/孔，加培养基至100|111/孔，每个浓度均 为3-5个复孔，阴性对照组(DMSO用PBS或者生理盐水稀释成不同 浓度与受试药物中DMSO的浓度相对应)，阳性对照组(5-氟尿嘧啶) 和空白组(只有培养基，无细胞)与受试药物组做相同的处理。肿瘤 细胞在37°C 、 5%C02条件下培养2-4天后，加PBS新鲜配制的5 mg/ml MTT液20pl/孔；继续培养4小时后，弃上清液，加DMSO 150fil/孔， 振荡10 min，使结晶物充分溶解，然后在570 nm用酶标仪测定OD值。 实验结果见表2。表2 大叶香茶菜壬、癸素对人肿瘤细胞增殖的抑制作用組别l(T5 M/L时对肿瘤细胞的抑制率(％ )HepG2SW-1990HO-8910SMMC-7721大叶香茶菜壬素94.099.097.071.4大叶香茶菜癸素0.000.0030.07.65阴性对照组0.000.000.000.00阳性3十照组91.056.096.031.9总结大叶香茶菜壬素对HepG2人肝癌细胞林、SW-1990人胰腺 胆管癌细胞抹、HO-8910人卵巢癌细胞抹、SMMC-7721人肝癌细胞抹 具有强烈的抑制作用；大叶香茶菜癸素则对HO-8910人卵巢癌细胞抹 有抑制作用。均可用于制备治疗癌症和/或肿瘤的药物。
权利要求
1、结构式如下的对映-松香烷型二萜化合物大叶香茶菜壬素或癸素大叶香茶菜壬素 大叶香茶菜癸素(MacrophyninE)、 (MacrophyninF)。
2、 一种权利要求1所述的对映-松香烷型二辟化合物大叶香茶菜壬 素或癸素的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤1) 提取将大叶香茶菜用醇溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸 膏；将该粗浸膏溶于NaCl溶液，混悬均匀后用乙酸乙酯萃取，所得萃 取液浓缩后得到乙酸乙酯浸膏；2) 分离步骤1)中得到的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石 油瞇/丙酮梯度洗脱；其中，石油醚/丙酮体积比80:20洗脱部分，经 Sephadex LH-20纯化得到大叶香茶菜癸素；石油醚/丙酮体积比70:30 洗脱部分，经Sephadex LH-20纯化得到大叶香茶菜壬素。
3、 如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤l)中， 所述的醇'溶剂为95%乙醇。
4、 如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤l)中， 所述的NaCl溶液为0.7-1.5 NNaCl溶液。H
5、 如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤l)中， 所述的醇溶剂提取是采用常温渗漉提取。
6、 如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤2)中， 所述的石油醚/丙酮梯度洗脱是以石油醚/丙酮体积比100:0 — 90:10 — 80:20 — 70:30 — 50:50 — 30:70 — 0:100进4亍梯度洗脱；将石油醚/丙酮体积比80:20洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱 层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层 析检测，展开剂为体积比95:5的氯仿/曱醇，将Rf值在0.48-0.53处的 洗脱液合并、减压浓缩，得到大叶香茶菜癸素；将石油醚/丙酮体积比70:30洗脱部分，经Sephadex LH-20凝胶柱 层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱，所得洗脱液经薄层层 析检测，展开剂为体积比卯:IO的氯仿/曱醇，将Rf值在0.45-0.50处 的洗脱液合并、减压浓缩，得到大叶香茶菜壬素。
7、 权利要求1所述的对映-松香烷型二萜化合物大叶香茶菜壬素或 癸素在制备治疗癌症和/或肿瘤药物中的应用。
8、 权利要求1所述的对映-松香烷型二萜化合物大叶香茶菜壬素或 癸素在制备治疗肝癌、胰腺胆管癌或卵巢癌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及从大叶香茶菜中提取、分离获得的结构式的对映-松香烷型二萜化合物大叶香茶菜壬素、癸素及其制备方法和用途。经多次体外抗肿瘤活性实验表明，上述化合物具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可以在制备治疗癌症和/或肿瘤的药物中应用。本发明还可为研制新的治疗各种常见多发癌症药物提供先导化合物，对开发利用中国的药用植物资源具有重要意义。
文档编号C07C51/42GK101397241SQ20071004651
公开日2009年4月1日 申请日期2007年9月27日 优先权日2007年9月27日
发明者波 冯, 王国飞, 郭跃伟, 松 钦, 黄才国 申请人:中国科学院上海药物研究所