专利名称：：一种重组抗癌肽及其制备方法和其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组氨基酸及其制备方法和其应用，具休地说是涉及一种重组多肽及其制备方法和其应用。技术背景随着肿瘤分子学及肽组合化学的迅速发展，肽及肽的衍生物在肿瘤治疗中的作用成为人们研究的热点。目前人们己从海洋生物中分离出许多具有抗癌活性的小分子肽或环肽。如美国亚利桑那州癌症研究所Pettir等从Dolabellaauriculara海兔中分离出一系列具有抗癌活性的小分子肽(dolastatinsl-15)(详见PettitGR，KamanoY,HeraldLL.etal.Theisolationandstructureofaremarkablemarineanimalantineoplasticconsrituent.JAmChemSoc.1987,109(22):6883-6885;文献1-3);Rinerhart等从加勒比海的海鞘(Caribbeantunicates)中分离出五种具有抗癌活性的环肽didemninA、B、C、D、E(详见RinehartKLJr，GloerJB,CookJC.etal.Structureofthedidemnins,antiviralandcytotoxicdepsipeptidesfromaCaribbeantunicate.JAmChemSoc，1981,103(7):1857-1859)。不过令人遗憾的是，目前所分离的肽类物质其含量甚低，且合成困难，由此严重制约了其在制备抗癌药物中的应用。
发明内容本发明的目的之一是提供一种重组的抗癌肽。本发明的目的之—是提供一种该抗癌肽的制备方法。本发明的目的之三是提供一种含有该抗癌肽的表达载体。本发明的目的之四是提供该抗癌肽在制备抗癌药物中的应用。本发明的目的是这样实现的本发明所提供的重组抗癌肽，简称重组十三肽，其氨基酸序列为Gly-Arg-Gly國Asp-Ser-Val-Val國Tyr-Gly陽Leu-Arg-Ser-Lys(SEQIDNO.l)。本发明所述的重组抗癌肽的制备方法包括以下步骤a、用质粒pTWIN2载体，经内切酶BspQl处理后，插入粘性末端的含有OPN的RGD序列的十三肽，在设计引物时加上了半胱氨酸TGC，经过引物变性、退火的方法使引物与酶切处理后的载体按l:10(摩尔比)16°〇连接过夜，得到重组质粒pTWIN2-RGD。b、将重组质粒经大肠杆菌消化，转入大肠菌或大肠埃希菌，诱导、收集、纯化目的蛋白。在表达载体中插入本发明克隆的抗癌肽并且导入宿主细胞如大肠菌或大肠埃希菌表达重组十三肽。本发明抗癌肽是属小分子环状小肽，具有显著的抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用，同时便于人工合成，易于产业化。因此本发明抗癌肽可在制备抗癌药物中得到应用。尤其适用于制备治疗肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌或肺癌药物。本发明抗癌肽或含有该抗癌肽的表达载体经5.7mol/L盐酸水解16小时，通过氨基酸自动分析仪及氨基酸序列仪即可测定出其序列。本发明抗癌肽在用于制备抗癌药物时，可以抗癌肽为药物活性成分，并与药学上可以接受的载体如生理盐水、注射液、乳剂(如甘油三酯乳剂、水包油/油包水乳剂)或药用常规辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，按照常规的制剂技术将其制成注射液、输液剂、缓控释剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂等药物剂型。本发明抗癌肽可采用口服给药，也可采用注射等非口服途经给药。给药剂量可以是lng-10g/kg，具体给药剂量可依据不同的给药方式适时调整。医师也可依据病情，酌情确定。图l是pTWIN2载体图谱。具体实施方式下面的实施例、试验实施例和制剂实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例1本发明抗癌肽的重组、鉴定、纯化与收集。利用NEB(NewEnglandBiolabs)公司的IMPACT-TWIN系统，通过几丁质珠亲和层析及内含肽(intein)自剪接功能实现重组环状小肽的制备。一、构建重组质粒pTWIN2-RGDpTWIN2载体图谱，如图l所示。pTWIN2载体部分序列如下PblylinterRegion:pTWIN25'...ACTGGGACTCCATCGTTTCTATTACGG站ACTGGAGTCGAAGAGGTTTTT鄉DnaBlnteinFotwandPrimer—<~lnteinT...&pDnaBIntein…ValAlaAsnAsplielie/a1HistenGATTTGACTGTGCCAGGACCACATAACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACNrullutein~G1yArgAlaHetGlyG1yArgGluPheLeuGluGlySerSerTCysValSerGlyAspThrGGAAGAGCCATGGGCGGCCGCGAATTCCTCGAGGGCTCTTCCTGCGTATCCGGTGACACCATTSapINcoIWotIEcoRIXhoISapI...付!;hRIR1Intein...GTAATGACTAGTGGCGGTCCGCGCACTCTGGCTGAACTGGAGSGCAMCCGTTCACC...3'Spei—励RIR1InteinReversePrimerpTWIN2载体含有两个内含肽，N端的inteinl和C端的intein2，而多克隆位点则位于两个内含肽中间，为了利于蛋白的环化，利用内切酶SapI切割载体，因其有两个位于多克隆位点两端的酶切位点，且设计的酶切位点正好是反向互补，所以目的片段只会定向插入而不会反向插入。内切酶SapI的识别序列为5'…GCTCTTC(N)，…3'3'…CGAGAAG(N)JL…5'N表示识别位点后切割的碱基数，根据载体序列可知，pTWIN2载体经内切酶SapI切割后的粘末端为5'…ATTGTACAC3'3'…TAACATGTGTTG5'及5'TGCGTATCC…3'3'CATAGG…5'所以本发明人根据载体经Sapl处理后暴露的粘性末端及实验需要，设计带有相应粘性末端的含有OPN的RGD序列的十三肽，不包含终止码，其序列如下为了使目的蛋白利于环化，本发明人在设计引物时加上了半胱氨酸TGC，经过引物变性、退火的方法使引物与酶切处理后的载体按1:10(摩尔比)16'C连接过夜，得到重组质粒pTWIN2-RGD。由于SapI的切割及连接特点，片段与载体连上后导致SapI酶切位点的丢失，所以本发明人用PCR的方法鉴定连接产物。因SapI在运输过程中很不稳定，故本发明人采用NEB公司生产的与SapI的识别位点及切割位点完全一致的同裂酶BspQI作为内切酶来替代SapI。二、重组质粒的转化及鉴定将重组表达质粒(即连接产物)转化大肠杆菌DH5a，具体方法如下将10"l连接产物加入100ulDH5a感受态细胞中，充分混匀后冰浴30分钟，42°C热激90秒，迅速冰浴2—3分钟，涂菌(含氨苄的固体LB培养基)，将平皿倒置于37"C温箱培养过夜。次日挑单克隆菌落，先用菌落PCR的方法初步鉴定后送测序进一步鉴定。三、目的蛋白的诱导表达及纯化运用15ml的Chitin(几可丁)亲合柱进行蛋白纯化的方法(适用于1L的诱导培养菌)1.细菌培养将测序正确的重组提菌质粒，转入大肠杆菌ER2566(即pTWIN2载体自带的表达菌)，转化方法同上，只是lPl纯质粒转入50y1ER2566感受态细胞中。次日晚挑单克隆菌落，37t:水浴摇床振荡培养过夜。第二天按l:IOO的比例接种于10ml液体LB培养基(含氨苄100|ag/ml)，37'C振荡培养3-4h，后接种于1L液体培养基(含氨苄100吗/ml)，37。C培养至OD600达0.5-0.7。'2.诱导蛋白表达加入终浓度为O.lmM-l.OmM的IPTG，于12—37。C诱导蛋白表达2—20h，以确立最佳诱导条件并设立阴性对照(未诱导)。取样10-20^1进行SDS-PAGE电泳，取样1-2|il进行Westernblot鉴定。3.细胞收集5000xg，4t:离心10分钟，弃上清。将细胞冻融以利于破碎。注以下步骤4-9除有特殊注明以外，均在4。C操作。4.破碎细胞:用50ml适当的裂解缓冲液(20mMTris-HCl，pH8.5,0.5MNaClorBufferBl)将菌体重悬，冰浴，超声破碎细胞，使蛋白释放。19000><g离心30分钟，上清即为澄清的细胞粗提物。取样2-5^进行SDS-PAGE电泳鉴定(Westernblot鉴定1:10稀释，上样2-5pl)。5.Chitin柱的平衡将24mlchitinbeads(15ml柱床体积)倒入2.5x10cm柱中，10个柱床体积的相应缓冲液(同步骤4用液)4'C进行柱平衡。注Chitin(几可丁)的用量由融合蛋白的总量来决定，每毫升柱床体积大约能够结合3mg蛋白，因此一升培养菌所获得的约45mg融合蛋白大约需要15ml柱床体积的树脂。6.Chitin柱将澄清的细胞粗提物缓慢加入Chitin柱，流速约为0.5-1.0ml/min。取少量流过液进行SDS-PAGE电泳，并与细胞粗提物的电泳进行比较，观察亲和柱的蛋白结合效率。上柱前可将细胞粗提物与ColumnBuffer按比例1:2-1:5混合稀释，以提高蛋白结合效率。7.洗柱用800mL(至少20倍柱床体积)的缓冲液彻底洗柱，由于CBD(几丁质结合域)和Chitinbeads(几可丁珠)的结合力很强，洗柱时可以用较高的流速(如2-3ml/min)和更苛刻的洗柱条件(如高盐1MNaCl和/或非离子性去污剂)。8.诱导Intein的自我裂解活性:Intein位于目的蛋白的C端，用3倍柱床体积的Buffer(缓冲液)B3(含30-50mMDTT)洗柱，用柱帽堵上，4。C放置过夜。用于IPL(内含肽介导的蛋白连接反应)连接反应的目标蛋白(C末端带有硫酯键)则需用BufferB4(含MESNA巯乙磺酸钠)诱导intein的裂解。Intein位于目的蛋白N端，用3倍柱床体积BufferB2洗柱，温室放置过夜。9.目标蛋白的洗脱次日，用3倍柱床体积的BufferBl或相应的诱裂解Buffer3(-DTT)，将目的蛋白洗脱收集。大约收集8-10管，每管5-7.5ml(1/2柱床体积)。目标蛋白大多在一个柱床体积里被洗脱(约20ml)，可以很方便的通过280nmUV吸光值或Bradford蛋白检测法进行检测。10.SDS-PAGE电泳分析Chitin柱上结合的intein-CBD及未洗脱的目的蛋白可通过1%SDS洗脱分离观察intein的裂解效率。(此外，还有一种更简便的方法取40plchitinbeads,加入203xSDSSampleBuffer混匀，吸取5上样，SDS-PAGE电泳分析。11.Chitin树脂的再生Chitin树脂可通过以下步骤重复再生使用4-5次。用3倍柱床体积的0.3MNaOH(即蛋白剥脱液StrippingSolution)漂洗Chitin柱，使树脂在该液中浸泡30分钟后，再用7倍柱床体积的0.3MNaOH进一步洗脱，最后用20倍柱床体积的水和5倍柱床体积的ColumnBuffer漂洗。Chitin树脂可贮存于4"。如长时间贮存，则需在ColumnBuffer(洗脱缓冲液)中添加0.02%的叠氮钠。四、目的蛋白纯化采用IMPACT系统进行目的蛋白纯化。IMPACT系统是NEB公司开发研制的一种蛋白融合表达及纯化系统。IMPACTTM表达的目的蛋白与蛋白自剪接元件(称为"内含肽"，intein)及几丁质结合蛋白形成融合蛋白，通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白。然后诱导内含肽的肽键裂解活性，在几丁质介质上将目标蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的。五、目的蛋白的鉴定方法融合蛋白用12。/。的SDS-PAGE(变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)，已纯化的目的蛋白小肽用Tricine凝胶电泳鉴定，若需进一步区分多聚体形式、环化形式及线性形式的蛋白则需要激光飞行质谱法检测。所测氨基酸序列为Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Val-Val-Tyr-Gly-Leu陽Arg隱Ser-Lys。SEQIDNO.l如下SEQUENCELISTING<110>河北医科大学<120>—种重组抗癌肽及其制备方法和其应用<130>0701<160>1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>13<212〉PRT<213>人源骨桥蛋白(Humanosteopontin)<400>1GlyArgGlyAspSerValValTyrGlyLeuArgSerLys1510实施例2本发明抗癌肽(以下简称重组13肽)对肿瘤细胞迁移的抑制作用。将细胞接种于玻片上，细胞生长至IOO%融合后，取出玻片，用无菌吸头在玻片上划痕.PBS洗净被刮下的细胞后，将玻片置于含13肽(10、20pg/ml)的培养液中，继续孵育24h后取出，进行固定和HE染色.于低倍镜下观察细胞伤口愈合情况.任意取3个视野，计数迁移细胞的数量，以此表示细胞的迁移活性.以空白培养基为阴性对照。详细结果见表l。表1:重组13肽对细胞迁移能力的抑制作用(以20pg/ml为例)细胞类型阴性对照组13肽处理组血管平滑肌细胞320±2576±15*MCF-7573±49173±22*OVCAR431±62113±28*HT29332±3989±28**P<0.05结果表明，重组13肽能够有效降低细胞的迁移、运动能力，通过局部给药，可适用于防治以细胞迁移为机制的疾病，如血管内膜增生和肿瘤的周边浸润。实施例3重组13肽对肿瘤细胞侵袭的抑制作用将细胞接种于直径5微米的微孔滤膜上，将滤膜至于一Boyden小室上、下层之间(接种细胞面向上)，将含13肽(10、20ng/ml)的培养液加入上室(阴性对照同上)，下室均加入含10°/。小牛血清的培养基，于37"C孵育6小时，取出后用棉签刮除接种面的细胞，然后将膜固定，于显微镜下取3个视野，计数穿至膜背面的细胞数，以此表示细胞的侵袭能力。详细结果见表2。表2:13肽处理组6±1.5*17±2.2*23±2.8*29±8*细胞类型阴性对照组血管平滑肌细胞20±5MCF-773±9OVCAR131±32HT29153±39*P<0.05结果表明，重组13肽具有抑制细胞侵袭的能力，局部给药可用于减少肿瘤的侵袭和转移。实施例4重组13肽对肿瘤转移的抑制作用脾内种植瘤肝转移膜型手术暴露腹腔，取2><106细胞，用含13肽(10、20|ig/ml)的培养基预处理l小时后，将细胞注射至BALB/c-nu/nu脾包膜内，于术后15天取脾和肝脏，测量瘤体积和肝转移结节数。阴性对照同上。详细结果见表3。表3:重组13肽对肿瘤肝转移发生率的影响(％，n=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果表明，重组13肽能够降低肿瘤肝转移的发生率。实施例4按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分:重组十三肽50mg乳糖70mg硬脂酸镁3mg聚乙烯比咯烷酮130mg实施例5取以一下各成分，按照本领域己知的方法制备成冻干注射剂:重组十三肽150mg水解明胶5mg甘露醇10mg半胱氨酸1.0mg注射液用水lml本发明中所用溶剂、试剂、洗脱液等化学制剂均可从专业销售商或商店购得。以下内容是本发明中所用溶剂、试剂、洗脱液等化学制剂的英文名称及组成CellLysisandColumnBuffer(BufferBl)(—种细胞裂解液和洗脱缓冲液)20mMNa-HEPES(orTris-HClorNa-Phosphate)(pH8.5orifneeded,pH6.0-9.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)1mMEDTA(optional)(—种络合剂)BufferB2(—种细胞裂解液和洗脱缓冲液)20mMNa國HEPES(alternatively,Tris-HClorNa-Phosphate)(pH7.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)1mMEDTA(optional)BufferB3(CleavageBufferforthiolinducedcleavage)(—种裂解缓冲液)20mMNa-HEPES(orTris-HClorNa誦Phosphate)pH8.5(orpH8.0—9.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)1mMEDTA(optional)40mMDTTor卩-mercaptoethanolorcysteine*(30—50mM)*2-mercaptoethanesulfonicacid(用于内含肽介导的蛋白连接反应)(Intein-meditatedProteinLigation(IPL))(内含肽介导的蛋白连接)反应BufferB斗用于内含肽介导的蛋白连接反应Intein-meditatedProteinLigation(IPL)20mMNa曙HEPES(orTris-HClorNa-Phosphate)pH8.5(orpH8.0—9.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)50mM2-mercaptoethanesulfonicacid(or30一50mM)StrippingSolutionI(—种蛋白剥脱液)用于洗脱Chitin柱上结合的intein-CBD及未洗脱的目的蛋白；Chitin柱的再生。1%SDS:20mMNa画HEPES(orTris-HClorNa-Phosphate)pH8,5(orpH8.0-9.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)StoreatroomtemperatureStrippingSolutionII(用于Chitin柱的再生):0.3MNaOH。权利要求1、一种重组抗癌肽，其氨基酸序列为SEQIDNO.1。2、一种权利要求1所述的抗癌肽的制备方法包括以下步骤a、用质粒pTWIN2载体，经内切酶BspQI处理后，插入粘性末端的含有OPN的RGD序列的十三肽，在设计引物时加上了半胱氨酸TGC，经过引物变性、退火的方法使引物与酶切处理后的载体按l:10(摩尔比)16"C连接过夜，得到重组质粒pTWIN2-RGD;b、将重组质粒经大肠杆菌消化，转入大肠菌或大肠埃希菌，诱导收集纯化目的蛋白。3、包括有SEQIDNO.l的表达载体。4、权利要求1所述的抗癌肽在制备抗癌药物中的应用。5、权利要求1所述的抗癌肽在制备治疗肠癌药物中的应用。6、权利要求1所述的抗癌肽在制备治疗乳腺癌药物中的应用。7、权利要求1所述的抗癌肽在制备治疗卵巢癌药物中的应用。8、权利要求1所述的抗癌肽在制备治疗肝癌药物中的应用。9、权利要求1所述的抗癌肽在制备治疗肺癌药物中的应用。全文摘要本发明公开一种氨基酸序列为SEQIDNO.1的抗癌肽，其表达体和其制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。该方法包括a.用质粒pTWIN2载体，经内切酶BspQI处理后，插入粘性末端的含有OPN的RGD序列的十三肽，在设计引物时加上了半胱氨酸TGC，经过引物变性、退火的方法使引物与酶切处理后的载体按1∶10(摩尔比)16℃连接过夜，得到重组质粒pTWIN2-RGD；b.将重组质粒经大肠杆菌消化，转入大肠菌或大肠埃希菌，诱导收集纯化目的蛋白。本发明抗癌肽具有良好的抗癌活性，且易于合成。文档编号C07K7/08GK101153056SQ200710062538公开日2008年4月2日申请日期2007年8月10日优先权日2007年8月10日发明者温进坤,梅韩申请人:河北医科大学