专利名称：：喹羟酮的化学合成工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及兽药领域，尤其是兽药饲料添加剂。
背景技术：
：在药物改造研制上，自1965年黎巴嫩贝鲁特(Beirut)的Haddalin和Issidorides发表Beirut反应第一篇文章以来，已有上百种应用该反应合成的专利问世和合成不下一千种新的N，N-二氮杂奈-1，4二氧化物(喹噁啉)类化合物。事实上，根据Beirut反应合成的多种喹噁啉化合物的取代衍生物如痢立清(Catbadox)、喹乙醇(Quinocetone)、乙酰甲喹等作为抗菌及促生长剂应用于畜牧兽医及养殖业中，已取得了巨大的经济与社会效益。但此类化合物存在较大的毒副作用，单纯地改变其侧链已不能满足需要，因为结果往往是毒性降低，其效果也大大下降。我国对喹噁啉类化合物的研究是一项热门课题，多年来先后仿制出许多兽药及饲料添加剂药物如喹乙醇、乙酰甲喹等，下一步任务是创新。本工作借助HIRFL提供的重离子束对喹噁啉进行结构改造，只要离子注入能量大于其每个化学键的最低结合能(约10eV/键)，那么结构改造就可能发生。尽管目前寻找新药有许多途径，但前期都需用较长时间做大量实验，一般开发一类新药至少要10年左右，如能有新的简单、快捷方法，将会加速开发新药的步伐，縮短研制周期，大大降低研究费用，重离子在这方面或许会有所作为，虽然刚刚起步，但它对药物结构改造和拓宽筛选途径，已显示出了巨大潜力，对医药事业的发展将会起到积极的推动作用。在先导药物分子接受了离子能量后，便会造成分子链的断裂和键的破坏，当它们修复时，就会发生重组，也可能与停留在周围的离子发生作用，通过置换或加成(例如，加氧、抽氢、环的扩大或縮小等)反应，构成与原来分子结构与组成不相同的新分子或多个单体。这种新分子或单体可能具有更好的药效(例如，抗菌活性增强，毒性降低等)。这样，就可以用分离出的药效明显的单体作为标样来进行化学合成，通过药理学、毒理学和临床试验满意后，再经过中试和一定的审批手续，就能正式生产这种新药，从而找到一种快捷有效的研制新药的新途径。在国内，利用离子束来进行药物品质改良方面，主要是对微生物的辐照诱变育种，因为国内用来做这方面工作的离子束能量都很低，不可能辐照很厚的样品。而我们拟釆用的是兰州重离子研究装置(HIRFL)提供的中能重离子束，它可以辐照较厚的固体药物样品，类似的工作在国内外还未见报道。但在国外已有常规辐射(如x-、Y-射线)对有机化合物进行分子结构改造的研究，然而常规辐射的LET(即单位路程上转移的能量)要比重离子小得多，而且这种辐射粒子不可能参与置换或加成反应，它使分子结构改变的效率较低。所以利用重离子束进行这项研究具有独特优势。本工作应用重离子'2(:6+,'608+对喹烯酮结构进行改造，获得至少四种辐照产物，并对辐照后的喹烯酮进行紫外、薄层层析(TLC)的分析及抗菌活性的研究，将分离后的单体进行红夕卜、核磁、质谱并初步确定了结构。结果表明，重离子辐照后的喹烯酮抗菌作用明显提高，辐照产物单体化学结构将为人工化学合成提供基础，有可能成为寻找新药的一种方法，有关此方面的工作未见报道。
发明内容本发明的目的为利用重离子对喹烯酮辐照产生的新物质作为标样，进行化学合成制备出抗菌活性强、毒性低的喹羟酮，本发明所公开的就是喹羟酮的化学合成工艺。喹烯酮在重离子加速器中经'2(:6+或'6(T的辐照产生了喹羟酮，其抑菌活性比喹烯酮更强，呈黄色粉末状，无臭，在吡啶，二甲基亚砜中溶解，微溶于二氧六环、丙酮，不溶于水、乙酸乙酯中。化学名为E-2-甲基-3-2，-羟基苯乙烯甲酰基喹喔啉-1，4-二氧化物(喹羟酮)，分子式为C18H14NA，分子量322，溶点为183-185'C。本发明设计了如下3条合成喹羟酮的路线及化学合成工艺。合成路线l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>根据合成路线1制定的喹羟酮的化学合成工艺，步骤如下(1)将18.3g邻硝基苯胺和0.42g四丁基溴化铵溶于70g甲醇中，加入25.3g的50%氢氧化钠水溶液，在0-l(TC下继续搅拌，慢慢滴入127g次氯酸钠水溶液，然后在0-10'C下继续搅拌l小时，分去水相，得苯并呋咱一l一氧化物得甲苯溶液，在真空下蒸去甲醇，加水洗涤、过滤，得苯并呋咱一l一氧化物。(2)将16.2g的苯并呋咱一l一氧化物和13.5g的乙酰丙酮溶于30ml的三乙胺中，让该溶液在室温下静置，收集沉淀，干燥后可得2—乙酰基一2甲基喹噁啉一l，4二氧化物，经用甲醇重结晶可得纯品。(3)将5g的2—乙酰基一2甲基喹噁啉一l，4二氧化物溶于20ml1，6-二氧六环中溶解，加入3g水杨醛,25-9(TC,缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，倒入水中，终止反应,沉淀析出，抽滤，得到粗产品，丙酮洗涤得到喹羟酮纯品。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>合成路线2:根据合成路线2制定的喹羟酮的化学合成工艺，步骤如下将5g水杨醛加入到10ml2，4一戊二酮，反应温度25-6CTC，缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中，终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，乙醇重结晶得到中间体纯品。称取中间体5g加入20ml乙醇溶解，加入3.5克苯并呋咱，反应温度25-60'C，缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中，终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，丙酮重结晶得到喹羟酮纯品。合成路线3:O根据合成路线3制定的喹羟酮的化学合成工艺，步骤如下将5g苯并呋咱加入到10ml2,4-戊二酮，反应温度25-80°C，缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中，终止反应,沉淀析出，抽滤，得到粗产品，乙醇重结晶得到乙酰甲喹纯品。将5g的乙酰甲喹溶于20ml1,6-二氧六环中溶解，加入3g水杨醛,25-90。C，缓慢倒入4n!l二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中，终止反应,沉淀析出，抽滤，得到粗产品，丙酮重结晶得到喹羟酮纯品。经上述三种工艺合成的产品进行红外光谱、质谱和核磁共振的谱学鉴定，解析分子结构，测试结果如下1、红外光谱(IR):仪器采用NicoletNEXUS670FT-IR仪器，IR(KBr)cnf1:3500-2850,3084,1661,1566,1447，1329,1260，1091;2、质谱(MS):仪器型号HP-5998,EI-MS显示有[M]+322;3、核磁共振(NMR):仪器采用IN0VA-400MHz超导核磁共振仪，'HNMR(DMS0_d6)Sppm:10.88(OH),8.5(1H,d,J=8.4Hz,H_5),8.42(1H,d,J=8.4Hz,H-8),7.97(2H,m,H_6,H_7),7.84(1H,d，J=16.4Hz,H-13)'7.56(1H,d,J=7.6Hz,H-19),7.33(1H,d，J=16.4Hz，H-12)，7.28(1H,t,J=7.2Hz,H-17),6.92(1H'd,J=8.0Hz,H_16),6.83(1H,t,J=7.2,Hz,H-18),2.36(3H,s,3-CH3);13CNMR(DMS0-D6)Sppm:187.3,160.0,144.6,139.0,138.9,137.6,136.6,133.1,132.5,131.5，130.9,125.3,120.6,119.7,119.5,116.5,14.0;根据EI-MS数据，结合核磁共振(NMR)谱数据可确定该化合物分子式为C,晶美04分子量为322;IR中1661峰以及13CNMR中S181.3表明分子中存在羰基官能团，5H7.84(1H,d,J=16.4Hz,H-13),SH7.33(1H，d，J=16.4Hz,H-12)的化学位移以及偶合常数表明分子中C-12，13的双键为反式构型；根据HMQC归属碳上的质子信号，根据HMBC归属碳氢远程相关，COSY显示5、8上的质子与6、7位的质子有远程偶合关系，12位和13位上的质子有远程偶俣关系，17位和16，18位上的质子有远程偶合关系；18位和17、19位上的质子有远程偶合关系；以上数据及分析结果可确定该化合物为喹羟酮。DMSO:化合的'HNMR(400MHz)和"C麵(100MHz)数据及gHMBC相互关系(5，ppm,TMS,DMSO"cU<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由此得出喹羟酮的化学结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>E-2-diethyl-3-2'-Hydro-PhenylethylecetoneQuinoxaline-l,4-dioxdeE-2-甲基-3-2'-羟基苯乙烯甲酰基-喹噁啉-l，4-二氧化物测试结果说明通过上述三种不同的化学合成工艺，都能得到所要求与重离子辐照物标样相同的喹羟酮。以下对化学合成产物喹羟酮进行肉鸡的促生长作用和抑菌作用进行研究。喹羟酮的促生长作用1、材料及方法1.1材料喹烯酮与喹羟酮，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制，纯度99%;喹乙醇，由山西芮城兽药厂生产，纯度大于98%;安卡红羽肉鸡，购于甘肃省种鸡场；试剂盒均由南京建成生化公司提供。紫外分光光度仪,HP2040A。1.2添加不同的喹噁啉类添加剂对肉鸡生产性能、蛋白代谢的影响。试验设计采用随机分组设计，各组基础日粮相同，选用1日龄健康安卡红羽肉鸡320只，平均体重为40.07土L94g。随机分为4组，每组4个重复，每重复20只，公母各半，各组初始体重差异不显著，4组分别为，I:空白对照II:喹乙醇，III:喹羟酮，IV:喹烯酮。1.3试验饲粮实验期为42天，分为0-3周龄和4-6周龄2期。试验饲粮根据《安卡红羽肉鸡饲养管理手册》推荐配制各阶段基础词粮配方。除豆粕、玉米，鱼干粉、麸皮的粗蛋白、钙和磷含量为实测值外，其它饲料组分的成分及能量价值均查自中国饲料成分及营养价值表。试验结果1不同水平的喹羟酮对肉鸡生产性能的影响在本试验中，添加喹羟酮的试鸡的平均日增重、采食量和饲料转化率都高于对照组，且50mg/kg和75mg/kg剂量组与对照组差异显著(P〈0.05)。由本试验可以看到，喹羟酮50mg/kg和75mg/kg的可提高日增重、采食量和饲料转化率，与其他喹噁啉添加剂相比，毒性小，无致畸、致癌、致突变性和光毒性。但随着添加剂量增大，各项指标有所下降。2不同水平的喹羟酮对氮的影响添加喹羟酮后，50mg/kg和75mg/kg组粗蛋白日食入量和表观利用率都显著高于对照组和100mg/kg组(P〈0.05);添加组的日排泄蛋白质显著低于对照组(P<0.05)。因为喹羟酮可以改变肠道微生物种类，抑制有害菌产生的毒物刺激肠道，减少肠壁细胞更新，使肠壁变薄，有利于对营养物质(特别是蛋白质)吸收利用。3不同浓度梯度喹羟酮对肉鸡血浆白蛋白和总蛋白的影响在本试验中添加不同浓度喹羟酮后，添加组和未添加组差异不显著(P〉0.05),喹羟酮50mg/kg组血浆总蛋白和白蛋白含量相对最高，为提高机体蛋白合成提供有利的内环境，从而增强蛋白利用率。本试验也充分说明，喹羟酮毒性小，对肝脏分泌蛋白功能没有负面影响。4不同浓度梯度喹羟酮对肉鸡小肠的影响添加不同水平喹羟酮后，50mg/kg和75mg/kg组的小肠重量和小肠重/体重的值比对照组显著低(P<0.05)，而小肠的长度各组之间差异不显著，本试验添加抗生素喹羟酮后，降低小肠重量，主要是因为喹羟酮抑制肠道有害微生物产生的有毒物质对肠壁的刺激，减少肠壁细胞更新，且肠壁纤毛排列更有规律且更加纤细，肠壁固有层更薄，有助于减少维持需要的营养物质和能量，使更多的营养物质用于试鸡的生长发育。5不同浓度梯度喹羟酮对肉鸡肌肉中RNA和DNA的影响添加不同浓度喹羟酮后，肉鸡肌肉中RNA的浓度都明显高于对照组(P〈0.05):而DNA浓度各组之间差异不显著(P〉0.05);添加喹羟酮的试鸡肌肉中RNA/DNA的值显著高于对照组(P>0.05)，而添加喹羟酮的各组之间差异不显著(P〈0.05)。因此认为，喹羟酮可以影响代谢，增加肌肉中的RNA浓度和RNA/DNA值，从而导致蛋白质、细胞的形成和组成增多，促进肌肉蛋白合成增强，进而达到增加动物体重，促进生产。不同浓度喹羟酮实验证明，添加50mg/kg和75mg/kg喹轻酮主要有以下几个作用1、饲养试验表明，提高曰增重、增加釆食量，提高饲料转化率2、消化代谢试验表明，喹羟酮可提高饲料氮的利用率，增加氮沉积；3、通过分析肌肉中RNA和DNA的浓度表明，喹羟酮促进肌细胞的肥大性增生，增强肌肉的生物蛋白合成能力。4、对小肠分析试验表明，喹羟酮可改善小肠组织结构，使肠壁变薄，增强对营养物质的吸收利用。在试验过程中，50mg/kg的添加效果最为明显，而高剂量喹羟酮对试鸡的生产性能影响并不显著，因此在实践中适宜的添加量可保证畜禽最大限度发挥生产性能，同时也可降低生产成本，得到最高的经济效益，是理想的促生长饲料添加剂。体外抑菌试验试验为对喹羟酮(M)和喹烯酮(0)的抑菌性进行对比。喹稀酮、喹羟酮的抑菌试验对比试管法(单位u/ml)<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注0为喹烯酮，M为喹羟酮；"一"抑菌，"+"长菌杯碟法(单位mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上体外抑菌试验结果看出喹羟酮的抑菌性比喹烯酮的抑菌性高。体内抗菌实验每组用20只肉鸡进行试验，健康对照组不感染，不给药，与实验组在同一条件下饲养，观察结果全部健活。感染组用大肠杆菌进行腹腔感染但不给药，一般于24h内即明显发病，腹泻沉郁，三天内全部死亡。感染给药组全部存活，精神正常。感染药物对照组与以上相同剂量喹烯酮，存活15只，精神JE常。体外抑菌与体内抑菌结果一致。本发明的有益效果本发明是以重离子辐照产物作为标物，通过设计出的工艺路线，制定的化学合成工艺进行合成的有效范例，这大大缩短了研制周期，节约了大量的费用，为今后的新药研制工作开辟了新的道路。喹羟酮是一种新的化合物，与已有的喹烯酮相比具有促生长作用高、抗菌活性强，毒性低等优点，是一种极有生命力的兽药饲料添加剂。图1-1为喹噁啉类化合物通过重离子辐照后获得喹羟酮新化合物的路线框图1-2为图1-1的续图。具体实施例方式现将喹羟酮的三种化学合成工艺的实施过程叙述如下第一种工艺路线的合成工艺(1)将18.3g(0.133mol)邻硝基苯胺溶于70g甲醇中，加入25.3g(0.266mol)的50%氢氧化钠水溶液，在O-l(TC下继续搅拌，慢慢滴入127g(0.185mol)次氯酸钠水溶液(有效氯含量为5.2%)，约一小时滴加完毕，然后在0-l(TC下继续搅拌1小时，分去水相。得苯并呋咱一1—氧化物的甲醇溶液，加水洗涤，过滤，镥17.4g的苯并呋咱一1—氧化物。(2)将16.2g的苯并呋咱一1—氧化物和13.5g的乙酰丙酮溶于;30ml的三乙胺中，让该溶液在室温下静置18小时，收集沉淀，干燥后可得16g的2—乙酰基一2甲基喹噁啉一l，4二氧化物，用甲醇重结晶可得纯品。(3)将5g的2—乙酰基一2甲基喹噁啉一l，4二氧化物溶于20ml1，6—二氧六环中溶解，加入3g水杨醛，25—9(TC，缓慢倒入4ml二乙胺，例入时呈线状，颜色逐渐变为褐色，反应20-60min(反应时间视颜色变化情况而定)，倒入水中，终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，用丙酮洗涤得到5.0-6.8g喹羟酮纯品。第二种工艺路线的合成工艺(1)将5g水杨醛加入到10ml2，4—戊二酮，反应温度25-60'C,缓慢倒入4ml二乙胺，倒入时呈线状，颜色逐渐变为褐色，反应20-60tnin(反应时间视颜色变化而定)，倒入水中终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，用乙醇重晶得到4-5.5g中间体纯品。(2)称取中间体5g加入20ml乙醇溶解，加入3.5g苯并呋咱，反应温度25-60。C，缓慢倒入4ml二乙胺，倒入时呈线状，颜色逐渐变为褐色，反应20-60min(反应时间视颜色变化而定)，倒入水中终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，用丙酮重结晶得到4.8-5.2g喹羟酮纯品。第三种工艺路线的合成工艺(1)将5g苯并呋咱加入到10ml2,4—戊二酮，反应温度25-80°C,缓慢倒入4ml二乙胺，倒入时呈线状，颜色逐渐变为褐色，反应20-60min(反应时间视颜色变化而定)，倒入水中终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，用乙醇重结晶得到4.5g乙酰甲喹纯品。(2)将5g的乙酰甲喹溶于20ml1,6—二氧六环中溶解，加入3g水杨酸，25-9CTC，缓慢倒入4ml二乙胺，倒入时呈线状，颜色逐渐变为褐色，反应20-60min(反应时间视颜色变化而定)，倒入水中终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，用丙酮重结品得到5.0-6.8g喹羟酮纯品。上述各例的反应时间与反应温度有关，如反应温度低，反应时间就要长一些，如反应温度高，反应时间可短一些。权利要求1.喹羟酮的化学合成工艺，其特征为工艺步骤如下(1)将18.3g邻硝基苯胺溶于70g甲醇中，加入25.3g的50％氢氧化钠水溶液，在0-10℃下继续搅拌，慢慢滴入127g次氯酸钠水溶液，滴加完毕后在0-10℃下继续搅拌1小时，分去水相。得苯并呋咱-1-氧化物的甲醇溶液，加水洗涤，过滤，得苯并呋咱-1-氧化物。(2)将16.2g的苯并呋咱-1-氧化物和13.5g的乙酰丙酮溶于30ml的三乙胺中，让该溶液在室温下静置，收集沉淀，干燥后可得2-乙酰基-2甲基喹噁啉-1，4二氧化物，用甲醇重结晶可得纯品。(3)将5g的2-乙酰基-2甲基喹噁啉-1，4二氧化物溶于20ml1，6-二氧六环中溶解，加入3g水杨醛，25-90℃，缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中，终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，丙酮洗涤得到喹羟酮纯品。2、喹羟酮的化学合成工艺，其特征为工艺步骤如下(1)将5g水杨醛加入到10ml2，4一戊二酮，反应温度25-60°C，缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，乙醇重晶得到中间体纯品。(2)称取中间体5g加入20ml乙醇溶解，加入3.5g苯并呋咱，反应温度25-60°C，缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，丙酮重结品得到喹羟酮纯品。3、喹羟酮的化学合成工艺，其特征为工艺步骤如下(1)将5g苯并呋咱加入到10ml2,4—戊二酮，反应温度25-8(TC，缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，乙醇重结晶得到乙酰甲喹纯品。(2)将5g的乙酰甲喹溶于20ml1,6—二氧六环中溶解，加入3g水杨醛，25-90'C，缓慢倒入4ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，再倒入水中终止反应，沉淀析出，抽滤，得到粗产品，丙酮重结晶得到喹轻酮纯品。全文摘要本发明为喹羟酮的化学合成工艺，涉及兽药饲料添加剂领域，现有的合成技术是从多种喹噁啉化合物的取代衍生物中选取，但此类化合物存在较大的毒副作用，单纯改变侧链已不能满足需要，本发明利用重离子束对喹噁啉进行结构改造，产生出新的化合物分子，通过药效学研究，分离出标样进行化学合成，本发明设计了三条合成路线，并对应了三种化学合成工艺，对新的化合物进行了谱学鉴定，确定为都是喹羟酮，经过进一步的促生长和毒性试验，显示出比先导化合物喹烯酮有明显的改进和提高，本发明具有研制周期大大缩短，研制费用大量节约的有益效果，并表明喹羟酮是一种极有生命力的兽药饲料添加剂。文档编号C07D241/00GK101182313SQ200710122910公开日2008年5月21日申请日期2007年7月3日优先权日2007年7月3日发明者何荣智,卫增泉,梁剑平,王曙阳申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所