专利名称：一种携带神经营养因子穿过血脑屏障的融合蛋白及其编码基因与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经营养因子融合蛋白，尤其涉及含蛋白转导结构域的神经营养因子融合 蛋白的制备、其编码核苷酸序列、含有它们的表达载体、宿主细胞，以及它们的用途。
背景技术：
神经营养因子(neurotrophins， NTs)是指机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、 分化的一类蛋白质因子，为一类低分子量蛋白的家族。在神经系统发育过程中,那些获得了 充分神经营养作用的细胞得以存活,而另一些则自然死亡,神经细胞的死亡伴随着神经系统 的发育而发生。神经细胞的非自然死亡(例如一些退行性神经病变),可以通过获取外界神经 营养因子而得以缓解。神经营养因子已成为当前神经科学领域最激动人心的研究热点之一。哺乳动物的NTs包括神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF )、神经营养蛋白-3 (neirotrophin 3, NT-3 )、和神经 营养蛋白4/5 (neurotrophin4/5， NT-4/5)。家族中每一个成员形成分子间二聚体后，与各自 特定的受体结合，使得受体二聚体化和自体磷酸化，激活多种下游效应分子和信号传导途 径链，从而产生对神经元的生长和生存的营养作用(Zweifei LS，et al.Function and mechanisms of retrograde neurotrophin signaling. Nature Review Neuroscience. 2005;6:615-625 )。从结构上看，神经营养因子家族成员间具有许多共同的特点，包括具有相似的分子量(13.2-15.9千道尔顿(kDa)); —级结构的氨基酸序列同源性接近或超过50%;等电点为9-10; 在相同的位点上有6个半胱氨酸残基并形成三个分子间的二硫键。在NTs前体蛋白的N末端疏 水区信号肽后，含有连续的碱性氨基酸残基。氨基酸序列分析表明，所有NTs家族成员的成熟 区蛋白都由分子量为31-35kDa的前体蛋白，经前体蛋白转化酶切割成为成熟蛋白而发挥生理 功能。由于NTs为生物多肽类分子，经外周血管途径给药后，不能穿过由脑血管单层内皮细胞 间紧密连接形成的血脑屏障(blood-brainbarrier, BBB)，或穿过的量达不到生理作用浓度， 因此只有在动物脑缺血区或脑脊液中直接注射给药，NTs才能发挥神经保护功能。然而，在 临床上采用这种给药方式，不仅增加了医护人员的技术要求，该给药方法可带来新的创伤，
而且病人也是不愿接受的。因此，寻找新的给药方法和途径是NTs进入临床使用的前提条件 (Miller G. Breaking down barriers. Science.2002;297:l 116-1118)。使药物通过BBB到达大脑发挥生理功能，最先采用的方法是利用高渗糖水溶液使得BBB 上的内皮细胞瞬时性脱水而收縮，从而打开内皮细胞间的紧密连接，使得药物通过BBB进入 脑实质。这种方法使目的药物通过B:BB的同时，也可使血液中的其他成分通过，包括血液中 的有毒成分，因此目前还不能进行大规模的临床试验(Miller G. Breaking down barriers. Science. 2002;297:1116- 1118)。有研究人员利用BBB上特异性的蛋白转运受体作为靶点，如转铁蛋 白受体或胰岛素受体，研制出抗这些受体的单克隆抗体-NTs的偶联物或融合蛋白，经外周血 管给药后，其中的单克隆抗体能特异性结合于BBB血液表面的受体而被其内吞，经细胞内转 运，从BBB脑实质面的受体离开，进入大脑(与转运转铁蛋白的机理相同)，从而使偶联物 中的NTs也同时通过了BBB。但这种方法中的偶联物不稳定，通过基因工程方法得到的融合 蛋白产量低，成本高，难以大量临床应用(Zhang Y, et al.。Neuroprotection in transient focal brain ischemia after delayed intravenous administration of brain-derived neurotrophic factor conjugated to a blood-brain barrier drug targeting system. Stroke. 2001;32:1378-1384)。发明内容针对现有技术的缺点，木发明提供一种神经营养因子融合蛋白、及其核苷酸序列的制 备方法和用途，解决了偶联物不稳定、融合蛋白产量低和高渗溶液易将血液中有毒成分带 入脑实质中的问题。为了实现上述目的，本发明提供一种用于携带神经营养肉子穿过血脑屏障的融合蛋白，包括与神经营养因子成熟区蛋白的氨基酸序列有至少75%同源性的第一区；与蛋白转导 结构域的氨基酸序列有至少70%同源性的第二区；其中，所述第二区位于所述第一区的羧 基末端。在一个优选实施方式中，所述第一区与祌经营养因子成熟区蛋白的氨基酸序列有至少85%的同源性；所述第二区与蛋白转导结构域的氨基酸序列有至少85%的同源性。在一个特别优选实施方式中，所述第一区为人神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养蛋白3或神经营养蛋白4/5。在另一个实施方式中，所述第二区为来源于果蝇的同源异型蛋白Antp、来源于小鼠血管内皮细胞I型膜蛋白Cadherin中的pVEC或来源于人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白Tat。在另一个实施方式中，所述第二区紧邻所述第一区或通过间隔氨基酸与所述第一区相连。在另一个实施方式中，所述第一区为人脑源性神经营养因子；所述第二区为来源于果 蝇的同源异型蛋白Antp，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。在另一个实施方式中，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示或其互补序列。本发明还提供一种表达载体，其含有如SEQIDNO: 2所示的序列或其互补序列的核 苷酸序列。本发明还提供一种宿主表达系统，其含有所述的表达载体。本发明还提供所述融合蛋白在制备治疗神经营养因子相关疾病的药物中的应用。在本发明的一个实施方式中，还提供在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋 白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入而得到的功能等同物。本发明还提供的编码本发明融合蛋白的核苷酸序列，能够编码具有PTD和NTs各自生 物学活性的序列；包括等位基因和物种同系物，还包括突变体和变异体。本发明所述的"蛋白转导结构域"(protein transduction domain, PTD)是一类能够将与其 物理或化学连接的化合物、蛋白质或核酸类分子，带过血脑屏障或细胞膜进入细胞浆，甚 至胞核内发挥各自的生物学功能的结构域，其富含正电荷。PTD介导的连接物通过细胞膜 进入胞体不需要能量和受体帮助(Wadia JS，et al. Transducible TAT-HA fiisogenic peptides enhances escape TAT-fiision proteins after lipid raft macropinocytosis. Nature Medicine. 2004; 10(3):310-315)。现已发现多种PTD，如来自果蝇的同源异型蛋白Antp (Eiriksdottir E， et al. Cellular uptake of cell-penetrating peptides. Drug Design. Online 1. 2004;161-173),.来源于d、 鼠血管内皮细胞I型膜蛋白Cadherin中的pVEC (Elmquist A， et al. VE-cadherin derived cell-penetrating peptide, pVEC, with carrier functions. Exp. Cell Res. 2001;269:237-244)，及来 源于人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白(Trans-activator transcription, Tat)。与现有技术相比，本发明的优点是将所述第二区置于所述第一区的羧基端(C端)，使 得神经营养因子的氨基端(N端)裸露出来，维持了正确的N端立体构象，从而发挥神经 营养因子的生物活性。
图1为人NTs-PTD/Antp核酸结构示意图；图2为BDNF-PTD/Antp融合蛋白表达载体的限制性内切酶酶切图谱分析； 图3为BDNF-PTD/Antp融合蛋白表达的SDS-PAGE分析图4为表达产物BDNF-PTD/Antp的Western blot分析图；图5为BDNF-Antp给药后，小鼠脑组织的Westernblot分析图；图6为不同浓度的BDNF-PTD/Antp与BDNF的生物学活性比较；图7为重组BDNF蛋白和重组BDNF-PTD/Antp融合蛋白通过BBB后在脑组织中的分 布图；图8为不同结构形式的BDNF-PTD/Antp融合蛋白的功能性比较； 图9为沙头鼠脑缺血模型经腹腔途径给予BDNF-Antp，断头处死后的TTC染色图； 图10为图9所述TTC染色后的灰度扫描图；图11为经腹腔途径给予BDNF-PTD/Antp后小鼠黑质酪氨酸羟化酶免疫组化图。
具体实施方式
在Antp蛋白分子内部的高度碱性区(氨基酸41-59)，富含较多的正电荷，与跨膜密切有 关，即所谓的蛋白转导结构域(Snyder EL and Dowdy SF.Cell penetrating peptides in drug delivery. Pharm Res.2004;21(3):389-393.)。在本发明中把来源于Antp的PTD简称为PTD/Antp， 下同。PTD/Antp可与多种全长蛋白质或多肽类形成融合蛋白，这些蛋白质的分子量可为 10-120kDa，包括卵血清蛋白(ovalbumin)、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP)， 细胞周期蛋白激酶抑制剂p27Kipl等(Ryu J, et al. Enhanced uptake of a heterologous protein w池 an HIV陽l tat protein transduction domains(PTD) at both termini, Mol Cells. 2003;16(3):385-391)。 另外，PTD/Antp不仅能携带蛋白质进入动物体内组织细胞，而且可保证所携带蛋白质的生物 活性(Asoh S, et al. Protection against ischemic brain injury by protein therapeutics.尸roc. Ato/. 爿cm/.5W.2002;99:17107-17112)。把PTD/Antp置于蛋白质的氨基(N)端或羧基(C)端，皆可使所携带的目的蛋白质通过 细胞膜。在设计融合蛋白时，可根据实际情况需要设计合适的融合方式。PTD/Antp介导的蛋 白质可穿过由脑血管内皮细胞组成的BBB，使所携带蛋白进入大脑发挥生理作用，.而这些蛋 白在正常情况下是不能通过BBB的。本发明是基于发明人的意外发现而做出的。本发明制备的融合蛋白中，PTD位于NTs的C 端，获得了比PTD位于NTs的N端更好的效果。推测可能的原因，NTs的N端含蛋白前导区(prepro-)的全长神经营养因子，通过分子间的二硫键形成二聚体后，优先结合于其特异性 受体p75，引起下游途径的信号传导，可能诱导神经元的死亡和凋亡(LuB,etal.Theyinand yang of neurotrophin action. 7V她re 7V"ewms"'e"ce. 2005;6:603-614; Teng HK， et al.ProBDNF induces neuronal apoptosis via activation of a NTR receptor complex of p75 and sortilin. Jo/Wwrasc/e"ce. 2005;25(22):5455-5463)。神经营养因子执行神经营养生理功能时需要切割 前体蛋白，裸露N端的成熟蛋白区可形成分子间的二硫键，新形成的二聚体和其特异性的酪 氨酸蛋白激酶(trK)受体家族成员结合，诱导下游途径信号传导，发挥神经营养功能OVfl似w i evz'ews^ewrascz'e"ce. 2005;6:603-614)。若PTD结合在全长神经营养因子的N端，则可能诱导 神经元的死亡和凋亡，而若全长神经营养因子切割前体蛋白，则连同结合在其N端的PTD—同 切割，导致切割后的成熟蛋白不能穿过血脑屏障；若PTD结合在成熟蛋白的N端，则导致成熟 蛋白的N端不能裸露出来，故不能形成二聚体而与特异性受体结合，从而发挥神经营养功能。 所以说，裸露的N末端结构，对维持神经营养因子成熟蛋白区发挥神经营养功能时的正确立 体构象(仅与trK受体结合，而不与p75受体结合)起重要作用。PTD序列优选紧邻NTs，也可以通过间隔氨基酸残基序列和NTs相连。间隔氨基酸序列的 长度可以是l-20个氨基酸或者更长，例如1-10个，特别优选柔性氨基酸残基。在NTs成熟蛋白 区前，直接连接甲硫氨酸作为起始氨基酸。PTD经或不经间隔氨基酸与NTs连接后，PTD需能 够发挥穿过细胞膜，或BBB的能力，二则要求PTD和间隔氨基酸(如果经间隔氨基酸连接) 不影响NTs的空间立体构像和活性二聚体的形成，保证了NTs的神经营养功能。编码NTs和PTD的核苷酸序列可以是天然的或合成的序列，包括等位基因和物种同系物， 还包括突变体和变异体。可以对NTs和PTD的编码核苷酸进行适当更换，例如增加、替换、缺 失一个或多个核苷酸，而仍保留其编码蛋白质的能力。用本领域周知的方法，如PCR (Saiki， etal. Science,239:487-491,1988)、 RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库等方法 可获得NTs和PTD的核苷酸序列。用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可来源 于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞及文库等。如编码NGF的核苷酸序列可用PCR方 法从含有NGF cDNA的文库中获得；编码BDNF核苷酸序列可用RT—PCR方法从脑组织中提取 RNA，经逆转录后得到的cDNA为模板得到；而编码PTD的核苷酸序列可用人工合成方法获得。 人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。如利用大肠杆菌偏爱 的密码子设计出，Antp蛋白中的PTD的一个示范性编码核苷酸序列和对应的氨基酸序列如下ATGC-3，SGRQIKIWFQNRRMKWKKC若需要，可用本领域公知的方法对多聚核苷酸序列进行突变、缺失、插入和与其他核苷 酸序列连接等。编码NTs和PTD的核苷酸序列的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可 以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在扩增编码序列的两端引物上引入限制性内切酶识别位点，经酶切、连接后获得编码融合蛋白的基因。融合蛋白的核酸序列经测序验
证正确性后，可用本领域公知的方法把含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。 所用的标准分子克隆过程见J.Sambrook等的叙述(J. Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratry Manual. Cold Spring Harbor Lab(CSHL)， 2001 )。可在多种不同的表达系统中进行本发明的NTs-PTD融合蛋白的表达。本发明中融合蛋白 的基因序列，连接在原核生物细胞表达载体中，得到pNTs-PTD，可在大肠杆菌中表达融合蛋 白。该融合蛋白的基因序列，同样可连接到酵母菌表达载体中，并在到酵母菌中表达得到该 融合蛋白；或者，该融合蛋白的基因序列，可连接到动植物细胞表达载体内，并在动植物细 胞中表达得到该融合蛋白。需要的表达载体和其对应的宿主可从公司购得，如大肠杆菌pET 载体系列可从Novagen公司，酵母菌表达载体pPIC系列及哺乳动物细胞表达载体pcDNA系列 可从Invitrogen公司购买。不同的宿主系统表达蛋白有其特定的优点，如大肠杆菌宿主易操作， 蛋白表达量高；哺乳动物细胞能使所表达的蛋白进行正确的翻译后糖基化修饰，但表达水平 低；而酵母菌介于二者之间。在本发明中，所表达的融合蛋白不需要翻译后糖基化修饰，复 性后的融合蛋白即可形成分子间的二硫键，因此选择大肠杆菌宿主系统。转化含NTs-PTD编码核酸的表达载体至宿主细胞去可用本领域公知的方法，如化学转化 或电穿孔等。成功转化的细胞可通过裂解细胞后PCR法鉴定，也可提取质粒DNA后酶切或测 序鉴定。可通过培养含有本发明核酸序列的宿主，如重组细菌、重组酵母、重组真核细胞等获得 大量的NTs-PTD融合蛋白。如用摇瓶培养含有本发明重组原核载体的大肠杆菌BL21 (DE3)， 经由实验优化的培养条件进行融合蛋白的大量表达，并运用液相层析和色谱技术对融合蛋白 进行纯化。在一个实施例中，纯化得到的BDNF-PTD/Antp融合蛋白，在体外细胞培养中，能明显 促进神经细胞PC12/trkB的增生，说明该融合蛋白保留了BDNF的神经营养活性。在另一个实 施例中，BDNF-PTD/Antp融合蛋白经小鼠尾静脉给药后4个小时，经本专业领域技术人员理 解的方法，能在大脑中检测到该融合蛋白。NTs有许多临床疾病的治疗前景，尤其对中枢神经系统神经退行性疾病。但外周血管或 肌肉途径直接注射给药NTs不能通过BBB而进入大脑发挥作用。本发明制备的NTs-Antp融合蛋 白因具有蛋白转导结构域，能将NTs经血管途径给药后带过BBB，因而，本发明制备的NTs-Antp 可经外周途径给药进入脑实质而发挥神经营养功能。含蛋白质转导域的NTs可经外周途径给药进入脑实质而发挥疗效，大大拓宽了NTs治疗临床疾病的适应症，如脑外伤性中枢神经损伤、脑血管中枢神经损伤、帕金森病、神经系统发育不良所致神经系统先天性疾病、脑萎缩、脑炎后遗症、新生儿缺氧性脑病、神经衰弱和神经性头疼、癜痫病、血管性痴呆、早老年性痴呆症、脊损伤、神经再植、多发性神经炎、糖 尿病性外周神经病变、神经断裂及退行性变、座骨神经损伤、面神经麻痹、视神经病变等。 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例一BDNF-PTD/Antp融合蛋白结构的设计请参阅图l， ATG为编码甲硫氨酸的核苷酸，PTD为蛋白转导结构域，NTs为人神经营 养因子家族成员编码成熟区蛋白的核苷酸序列，TER为核酸的终止密码子。在脑源性神经营 养因子成熟区前增加甲硫氨酸，PTD/Antp位于BDNF的C端，通过间隔氨基酸谷氨酸与BDNF 相连接，得到BDNF-PTD/Antp融合蛋白的结构。实施例二 BDNF-PTD/Antp融合蛋白基因的扩增和原核表达载体的构建根据基因库报导的编码BDNF成熟区蛋白的核苷酸序列，和上述BDNF-PTD/Antp 融合蛋白的结构，设计扩增BDNF-PTD/Antp融合蛋白基因的引物如下 引物I如SEQ ID NO:3所示5，陽GCCATATGCACTCTGACCCTGCCCGCCGA-3，(下划线为Ndel位点) 弓物1I如SEQIDNO:4所示GTCTGCCGGATCCCCTTTTAATGGTCAATGTACATAC-3 ，(下划线为Xhol位点) 用PCR法，以含人BDNF全长cDNA质粒popeMPBDNF(美国ATCC)为摸板，扩增 BDNF-PTD/Antp基因。PCR反应参数为94。C预变性3min， 94。C变性45sec， 58。C退火lmin， 72'C延伸lmin，共35个循环，最后72'C延伸10min。 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，按 DNA片段回收试剂盒提供方法，回收目的基因片段。利用PCR产物两端的NdeI和XhoI位点， 将其克隆于原核细胞表达载体pET30(a)(美国Novagen公司)。连接、转化均按《分子克隆》进 行。请参阅图2，用限制性内切酶进行分析，得到载体和目的基因片段，图中，泳道1和3分别 为低和高分子量核酸标准，泳道2中红色箭头为表达载体质粒片段，箭头为表达 BDNF-PTD/Antp融合蛋白的核酸片段。质粒酶切鉴定后送上海生工生物技术有限公司测序， 经序列测定，BDNF-PTD/Antp的基因是由如SEQ ID NO: 2的核酸组成，说明获得的目的基 因序列是正确的。实施例三BDNF-PTD/Antp融合蛋白的诱导表达将经酶切和核酸测序分析正确的pBDNF-PTD/Antp重组质粒转化感受态表达菌株 BL21(DE3)plys，涂布于含50mg/mL卡那霉素，34mg/mL氯霉素的平皿中。随机分别挑取单个 阳性单克隆，接种到200mL含有卡那霉素(50mg/mL)和氯霉素(34mg/mL)的LB培养基试管 中，37"C培养过夜后，再转至1000mL含相同抗生素的LB培养基中继续培养l小时，至006()()=0.6 时，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导培养5个小时,5000prm/min，4r离心15min，弃上清收 集菌体。实施例四BDNF-PTD/Antp融合蛋白的纯化与Westem blot鉴定将诱导表达后收集的菌体按10g/ml (V: M)裂解于裂解液(8M尿素、0.1MNaH2PO4、 0.01MTris-Cl(PH8.0))中，超声破菌，4。C10000xg离心30min，取上清。经过Q-Sepharose离子 交换柱后，再用Sephacryl凝胶过滤柱纯化。纯化得到的融合蛋白纯度达到99.5%以上。纯化 后的蛋白用含0.1M精氨酸的PBS (O.IM磷酸盐缓冲液)溶液透析和复性。BDNF-PTD/Antp融合蛋白的鉴定请参阅图3，进行SDS-PAGE电泳和考马氏亮蓝染色后可 看到，与诱导前菌液相比，菌株经IPTG诱导表达后，在分子量为18kD位置上明显出现条带， 位置与预期目的蛋白大小一致，纯化后在同一位置上得到单一条带。图3中，l为蛋白质分子 量标准，2为诱导前工程菌菌体裂解液的上清液，3为诱导后工程菌菌体裂解液的上清液，与 诱导前相比，明显具有箭头所示的表达蛋白条带，4中箭头所示为纯化后的融合蛋白。将纯化 后的蛋白转至尼龙膜上，以兔抗人BDNF抗体进行Westemblot分析，结果请参阅图4。图4中， l为蛋白质分子量标准；2为诱导前菌体上清液；3为诱导后菌体上清液；4为纯化后蛋白。在 约18kD位置上出现了特异条带，与考马氏亮蓝染色的蛋白表达条带位置相同，说明表达并经 纯化后产物为含BDNF的蛋白。另外，将纯化蛋白经小鼠尾静脉给药4小时后取脑组织进行 Westemblot分析，BDNF-Antp融合蛋白处理组动物脑中能明显检测至UBDNF蛋白，见下图5。 图中，A代表BDNF-Antp处理组；B代表BDNF处理组。实验时，小鼠(25克)尾静脉分别给 予4pgBDNF-Antp和BDNF， 4小时后，取脑蛋白进行实验。与对照组相比，可见BDNF-Antp 给药组动物脑中有高含量的BDNF。实施例五BDNF-PTD/Antp融合蛋白的促细胞增殖活性用MTT法对BDNF-PTD/Antp融合蛋白的生物学活性进行了检测。在嗜铬细胞瘤细胞系PC12/trkB的培养液中，加入复性后基因重组蛋白BDNF-PTD/Antp和阳性对照的基因重组蛋白BDNF，与阴性对照(不加神经营养因子)相比，加入不同浓度基因重组BDNF-PTD/Antp和无PTD的基因重组BDNF，均能促进细胞的增生，经统计学分析具有显著的差异。而且，BDNF-PTD/Antp与BDNF相比，前者的生物学活性更好，结果见图6，说明将蛋白质转导域置 于BDNF的C末端，不影响BDNF蛋白N末端的空间结构和二聚体的形成，从而保留甚至增强 了BDNF的生物活性。实施例六BDNF-PTD/Antp融合蛋白的体内透过BBB实验在20 25克小鼠尾静脉中分别注射给予4u g基因重组BDNF-PTD/Antp蛋白和对照基 因重组BDNF蛋白，4小时后处死，取全脑，冰冻切片，用兔抗人BDNF抗体进行免疫组 织化学检测，结果发现BDNF组中可见部分区域呈阳性表达，与文献报道的内源性BDNF 组织分布位置一致，说明外周血管途径给予外源性BDNF不能通过BBB进入大脑；而 BDNF-PTD/Antp组动物的脑中多个部位有强阳性表达，尤其是海马和纹状体皮层，结果见 图7，说明经PTD修饰后的BDNF可发挥PTD的蛋白质转导域功能，使BDNF通过了 BBB 。NTs-PTD中含有蛋白质转导域，大大扩展了NTs的应用范围，特别是，NTs-PTD可经外周 途径，包括外周血管途径给药后透过BBB进入大脑，所以NTs可治疗CNS神经退行性疾病，还 包括周围神经退行性疾病。实施例七PTD分别结合在BDNF的羧基端和氨基端的效果比较将PTD/Antp置于BDNF的氨基端，同实施例二-实施例四的方法制备Antp-BDNF。用MTT 法对BDNF-Antp和Antp-BDNF融合蛋白的生物学功能活性进行了比较。在嗜铬细胞瘤细胞系 PC12/trkB的培养液中，加入复性后基因重组BDNF-Antp、 Antp-BDNF融合蛋白和阳性对照的 基因重组蛋白BDNF，与阴性对照(不加神经营养因子)相比，加入不同浓度基因重组 BDNF-Antp和无PTD的基因重组BDNF，均能促进细胞的增生，经统计学分析具有显著的差异； 而Antp-BDNF组促细胞增生能力，与阴性对照组相比，无显著性差异。结果见图8，图中橫坐 标表示不同结构形式BDNF的浓度(nM);纵坐标表示神经元样阳性细胞百分比(％)。说明 N-末端裸露的BDNF能更有效促进PC12-trkB细胞增生，且BDNF的N-末端可能是其促细胞增 生的功能结构域。实施例八BDNF-Antp具有恢复脑卒中后神经元功能的应用前景实验步骤制备沙头鼠脑缺血模型，不同时间点经腹腔途径给予BDNF-Antp，断头处死后用TTC染色(结果见图9)、及染色后的灰度扫描(结果见图IO)。图9显示BDNF-Antp能保护鼠脑前脑缺血后神经元的坏死。外周途径给予BDNF-Antp后，经TTC染色后的灰度扫描，及统计学分析表明，BDNF-Antp给药组与生理盐水对照组之间有明显差异。其中A是沙土鼠前脑缺血注射生理盐水组；B是沙土鼠前脑缺血前2h注射BDNF-Antp组；C是沙土鼠前脑缺血 Oh注射BDNF-Antp组；D是沙土鼠前脑缺血lh注射BDNF-Antp组；E是正常脑组。图10是TTC 染色后灰度比较。正常脑组及缺血后，各时间点用药组，与缺血后不用药组之间TTC染色后 灰度比较，有显著性差异，说明BDNF-Antp通过BBB能保护缺血后神经元的坏死。其中l组沙 土鼠前脑缺血注射生理盐水组；2组:沙土鼠前脑缺血0h注射BDNF-Antp组；3组沙土鼠前脑 缺血lh注射BDNF-Antp组；4组沙土鼠前脑缺血前2h注射BDNF-Antp组；5组正常脑组。实验结果经统计学分析表明，BDNF-Antp能够逆转神经元的缺血性死亡，保护程度与 缺血前后不同时间点给药密切相关。该结果说明BDNF-Antp具有治疗临床上脑中风后神经元 功能恢复的应用前景。实施例9: BDNF-Antp具有治疗帕金森氏症的应用前景。实验步骤及结果MPTP诱导小鼠帕金森氏症模型后，用BDNF-Antp治疗，与模型组相比， BDNF-Antp治疗组能明显减少MPTP对多巴胺神经元的损伤，结果见下图ll。图11表示C57BL 小鼠脑中黑质酪氨酸羟化酶(多巴氨神经元的阳性标记)免疫组化。其中A为正常对照组，脑黑 质有正常的多巴氨神经元;B为模型组(腹腔注射MPTP)，脑黑质的多巴氨神经元明显减少； C为BDNF-Antp融合蛋白给药组(注射MPTP前2小时腹腔注射BDNF-Antp， 5ug/25克小鼠)，与 模型B组相比，脑黑质的多巴氨神经元数量明显增加。该结果说明，BDNF-Antp具有治疗帕 金森氏症的应用前景。实施例10: Antp-PTD突变体(与Antp-PTD有70。/。同源性)的蛋白转导功能随机突变编码Antp-PTD氨基酸的核苷酸，用实施例2中的PCR方法克隆了编码BDNF-Antp/PTD突变体(其中Antp/PTD突变体与Antp/PTD有70。/。氨基酸同源性)的基因，用实施例 3及实施例4中的方法，制备该突变体。用实施例6的方法研究该BDNF-Antp/PTD突变体(其 中Antp/PTD突变体与Antp/PTD有70。/。氨基酸同源性)体内通过BBB进入大脑的能力。结果表 明，与BDNF-Antp/PTD原蛋白一样，BDNF-Antp/PTD突变体(其中Antp/PTD突变体与 Antp/PTD有70。/。氨基酸同源性)组经尾静脉给药后，在动物的脑中多个部位有强阳性表达， 尤其是海马和纹状体皮层，说明与Antp/PTD有70。/。氨基酸同源性的Antp/PTD突变体，同样具 有PTD的蛋白转导结构域功能，使BDNF通过了BBB 。在另一个实施例中，所述Antp/PTD突 变体与Antp/PTD有85。/。氨基酸同源性，经实验证实，同样具有PTD的蛋白转导结构域功能。实施例ll: BDNF突变体(与BDNF的氨基酸有70。/。同源性)蛋白的促细胞增殖活性随机突变编码BDNF蛋白的核苷酸，用实施例2中的PCR方法克隆了该突变体的基因，用
实施例3及实施例4中的方法，制备BDNF突变体(与BDNF70n/。同源性)蛋白。用实施例5的 方法对BDNF突变体(与BDNF70。/。同源性)蛋白的生物学活性进行了检测。在嗜铬细胞瘤 细胞系PC12/trkB的培养液中，加入复性后基因重组BDNF-PTD突变体蛋白(与BDNF70。/。同 源性)和阳性对照的基因重组蛋白BDNF，与阴性对照(不加神经营养因子)相比，加入不 同浓度基因重组BDNF-PTD突变体蛋白和阳性对照基因重组BDNF,均能促进细胞的增生，经 统计学分析具有显著的差异，说明与BDNF7(P/。同源性的突变体蛋白同样具有BDNF的生物活 性。在另一个实施例中，所述BDNF突变体与BDNF的氨基酸有85M的同源性，经实验证实， 同样具有BDNF的生物活性。实施例12: BDNF (突变体)-/01中/ 丁0突变体融合蛋白的生物学活性按实施例IO及实施例11的方法，制备BDNF (突变体)-AntpZPTD突变体融合蛋白， 其中BDNF突变体与BDNF有70%氨基酸同源性，Antp/PTD突变体与Antp/PTD有70%氨 基酸同源性。实验结果表明，所制备的BDNF (突变体)-Antp/PTD突变体融合蛋白能够逆 转神经元的缺血性死亡，保护程度与缺血前后不同时间点给药密切相关。该结果说明BDNF (突变体)-Antp/PTD突变体融合蛋白同样具有治疗临床上脑中风后神经元功能恢复的应用 前景。在另一个实施例中，其中BDNF突变体与BDNF有85y。氨基酸同源性，Antp/PTD突 变体与Antp/PTD有85y。氨基酸同源性，得到的融合蛋白，经实验证实，同样具有治疗临床 上脑中风后祌经元功能恢复的应用前景。
序列表<110>南方医科大学珠江医院<120>—种携带神经营养因子穿过血脑屏障的融合蛋白及其编码基因与用途<150>CN200610122393.9<151>2006-09-25<160>4<210> 1 <211> 138 <212> PRT<213>大肠杆菌种(E. coli) <400> 1Met His Ser Asp Pro Arg Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser15 10 15lie Ser Glu Tip Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met1 5 10 15Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly15 10 15Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr15 10 15Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly lie Asp Lys Arg His Tip Asn Ser Gin1 5 10 15Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys1 5 10 15Lys Arg He Gly Trp Arg Phe lie Arg lie Asp Thr Ser Cys Val Cys15 10 15Thr Leu Thr lie Lys Arg Gly Ser Gly Arg Gin He Lys lie Trp Phe15 10 15Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Cys1 5 10<210>2 <211>417 <212> DNA<213>大肠杆菌种(E. coli) <400> 2 atgcactctg accctgcccg ccgaggggag ctgagcgtgt gtgacagUt tagtgagtgg 60gtaacggcgg cagacaaaaa gactgcagtg gacatgtcgg gcgggacggt cacagtcctt 120gaaaaggtcc ctgtatcaaa aggccaactg aagcaatact tctacgagac caagtgcaat 180cccatgggtt acacaaaaga aggctgcagg ggcatagaca aaaggcattg gaactcccag 240tgccgaacta cccagtcgta cgtgcgggcc cttaccatgg atagcaaaaa gagaattggc 300tggcgattca taaggataga cacttcttgt gtatgtacat tgaccattaa aaggggatcc 360ggcagacaaa tctggttcca attccaaaac aggaggatga agtggaaaaa atgctag 417<210>3 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根据核苷酸序列设计，用作扩增融和蛋白基因的引物 <400> 3gccatatgca ctctgaccct gcccgccga<210>4 <211>95 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根据核苷酸序列设计，用作扩增融和蛋白基因的引物 <400> 4gcctcgagct agcatttttt ccacttcatc ctcctgtttt ggaattggaa ccagatttgt 60 ctgccggatc cccttttaat ggtcaatgta catac 9权利要求
1.一种携带神经营养因子穿过血脑屏障的融合蛋白，包括与神经营养因子成熟区蛋白的氨基酸序列有至少75％同源性的第一区；与蛋白转导结构域的氨基酸序列有至少70％同源性的第二区；其中，所述第二区位于所述第一区的羧基末端。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一区与神经营养因子成熟区蛋白的氨基酸 序列有至少85%的同源性；所述第二区与蛋白转导结构域的氨基酸序列有至少85%的同源 性。
3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一区为人神经生长因子、脑源性神经营 养因子、神经营养蛋白3或神经营养蛋白4/5。
4. 权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二区为来源于果蝇的同源异型蛋白Antp、 来源于小鼠血管内皮细胞I型膜蛋白Cadherin中的pVEC或来源于人类I型免疫缺陷病毒的 转录激活蛋白Tat。
5. 权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二区紧邻所述第一区或通过间隔氨基酸与所 述第一区相连。
6. 权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一区为人脑源性神经营养因子；所述第二 区为来源于果蝇的同源异型蛋白Antp，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。
7.—种编码权利要求6所述融合蛋白的核苷酸序列，其碱基序列如SEQIDNO: 2所示或其互补序列。
8.—种表达载体，其含有权利要求7所述的核苷酸序列。
9.一种宿主表达系统，其含有权利要求8所述的表达载体。
10.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗神经营养因子相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了含蛋白质转导域的神经营养因子融合蛋白基因的克隆，蛋白质的表达和纯化，融合蛋白的生物学活性，及其生物体内穿过细胞膜，特别是血脑屏障的功效。该融合蛋白包括与神经营养因子至少75％序列同源的第一区，和与蛋白转导结构域的氨基酸序列至少75％同源的第二区，所述第二区位于所述第一区的羧基端；可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行氨基酸残基的取代、缺失或加入。该融合蛋白可用作药物，经外周途径给药治疗多种中枢神经系统神经退行性疾病和周围神经病变。
文档编号C07K19/00GK101157730SQ20071014739
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月7日 优先权日2006年9月25日
发明者靓 孙, 季爱民, 张忠义, 李晓东, 王秉钧, 丹 苏, 瓯 车, 马翰章, 马蕾蕾 申请人:南方医科大学珠江医院