专利名称：：葡萄糖敏感水凝胶的制作方法葡萄糖敏感水凝胶发明领域本发明涉及葡萄糖敏感水凝胶，其制备方法及其在胰岛素给药系统和血糖动态监测中的用途。发明背景水凝胶是一类环境敏感材料，外界环境的某些刺激信号的改变引起水凝胶结构的变化，从而改变体积或发生溶胶-凝胶相变。对不同信号敏感的水凝胶在设计智能型生物材料中有着非常广泛的应用，如开关、感应器、机械化学触发器、特殊的分离系统、生物反应器等。自调式给药系统是指自行感应人体生理/病理变化并做出反应来控制药物释放的给药系统，也是新一代给药系统的研究热点。用于自调式给药系统设计的主要有pH敏感、温度敏感水凝胶和葡萄糖敏感水凝胶。其它智能型凝胶包括酶敏感水凝胶、抗原敏感水凝胶、以及基于碱基对互补原理的核酸敏感的水凝胶系统。聚高分子电解质材料和聚N-异丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide，PNIPAAm)制备的各种pH敏感或温度敏感水凝胶广泛用于自调式给药系统的设计。葡萄糖敏感的水凝胶是胰岛素自调式给药系统和血糖动态监测仪的基础。目前，葡萄糖敏感的水凝胶的设计主要基于以下三个原理1)含有葡萄糖氧化酶(GOD)的pH敏感的水凝胶将GOD固化在pH敏感的水凝胶中，当葡萄糖在酶的作用下转化成葡萄糖酸，溶液的pH值降低，凝胶膨胀，释放胰岛素"'"。这类含有葡萄糖氧化酶的凝胶膜在低于生理葡萄糖浓度时即对葡萄糖达到最大的反应，葡萄糖浓度继续增加不会引起凝胶的进一步变化。Peppa等[3]的工作再这方面做了较大的改进，他们制备了GOD-聚(曱基丙烯酸-g-乙二醇)(poly(MAAc-g-EG))凝胶，在较高的葡萄糖浓度即高血糖情况下(200~500mg/dl)，凝胶的溶胀速率低于在较低葡萄糖浓度即正常血糖(80mg/dl)时的溶胀速率。基于此设计的给药装置，在葡萄糖浓度升高时，胰岛素被挤出释放。2)含有凝集素的水凝胶凝集素是一类糖结合蛋白，其糖结合特性使其在制备葡萄糖敏感材料中具有独特的地位，目前用来制备葡萄糖敏感的水凝胶的是有四个结合位点的伴刀豆球蛋白A(ConA)。这方面的研究最早是由Brownlee等"]和Kim等[5]完成的，其原理是合成稳定的、具有生物活性的糖基化胰岛素，与ConA生成复合物，由于葡萄糖对ConA结合位点的竟争性结合，糖基化胰岛素能够被葡萄糖竟争取代而从复合物中释放出来。Park等[6)制备了根据葡萄糖浓度变化而发生溶胶-凝胶可逆相转变的水凝胶。乙烯吡咯啉酮-丙烯基葡萄糖共聚物与ConA混合，由于共聚物的糖基与ConA形成复合物而能迅速形成凝胶，加入游离葡萄糖导致凝胶发生相变，转变成溶胶状态，游离葡萄糖的浓度必须至少达到共聚物中葡萄糖基的4倍才能引发相变，凝胶对葡萄糖浓度的变化是可逆的。以溶菌酶和胰岛素为模型药物的释放实验表明，药物释放明显依赖于葡萄糖的浓度。3)含有苯硼酸的水凝胶苯硼酸及其衍生物与多醇基化合物如葡萄糖在水溶液中生成复合物，如果有能够形成更强的复合物的多醇基化合物存在，则会发生置换，因此，苯硼酸与多醇化合物的复合物在葡萄糖敏感材料的研制中有广泛的应用。苯硼酸在溶液中存在电离平衡，不带电荷的苯硼酸与葡萄糖形成的复合物不稳定，带负电荷的苯硼酸能与葡萄糖形成稳定的复合物。葡萄糖的结合使苯硼酸的电离平衡发生移动，带负电荷的苯硼酸增多，不带电荷的苯硼酸减少，由此聚合物的水溶性发生改变，导致凝胶的溶胀率发生变化。此即这类聚合物制备葡萄糖敏感凝胶的机理，见下式。不带电的苯硼酸带负电荷的苯硼酸烯酰胺基苯硼酸在溶液中的电离平衡早期研究的这类复合物凝胶系统是聚(N-乙烯-2-吡咯啉酮)-co-3-丙烯酰胺基苯硼酸复合聚乙烯醇水凝胶(poly(NVP-co-PBA)/PVA)[7]，由于该凝胶在生理pH7.4条件下不稳定，很难用于葡萄糖敏感的胰岛素释放系统的研究。聚丙烯酰胺类是制备葡萄糖敏感的水凝胶的常用骨架材料之一。Kataota[8]等用NIPAAm和苯硼酸制备的凝胶对环境葡萄糖浓度十分敏感，胰岛素释放实验表明，葡萄糖浓度低于1g/1(5.55mM)时没有释放，但是当葡萄糖浓度达到3g/1(16.67mM)时，胰岛素释放较快。此系统随着葡萄糖浓度的变化，成功地实现了对胰岛素释放的"开关"控制。
发明内容本发明目的是寻找新的葡萄糖敏感水凝胶。本发明人在研究中发现具有下面结构的水凝胶具有优良的葡萄糖敏感性质。本发明因此第一方面涉及下式的水凝胶A-B-C其中A为未与B或C结合前的下式的烯酰氨苯硼酸<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>R产H或-(CH丄CH3，n-0~10R2-H或-(CH丄CH3，n-0~10R3=(CH2)n，n-0~10R4=-N02,-CI,-Br，-F,-CH3，-CF"-CBr3，—CCl"一H，B为选自二曱胺基丙基曱基丙烯酰胺，丙烯酰胺，N，N-二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯，2-羟丙基甲基丙烯酸酯或N-异丙基丙烯酰胺；C为选自二甲基丙烯酸乙二醇酯或N，N'-亚曱酸丙烯酰胺；并且A、B、C之间可以是任意排列结合。本发明还涉及制备式A-B-C水凝胶的方法，其包括将A、B和C在甲醇与水的混合物中进行反应。本发明还涉及式A-B-C水凝胶在胰岛素自调式给药系统或血糖监测中用途。根据本发明，A与B的比例为1:99至99:1。图1为不同pH条件下葡萄糖浓度对实施例2凝胶溶胀率的影响，--pH4.57,-pH5.4,-A-pH6.4,-x-pH7-4，-※-pH8.4，^119.4，图2为实施例2凝胶在不同pH磷酸盐緩沖液中的溶胀率变化,一令一pH5.4,-園一pH6.4,-A-pH7.4，一x-pH9.4。图3为实施例2凝胶在不同pH值的果糖溶液中的溶胀率变化。图4，5和6分别为甲基丙烯酰氨基苯硼酸，戊烯酰氨基苯硼酸和庚烯酰氨基苯硼酸的NMR图。具体实施方案实施例1甲基丙烯酰氨基苯硼酸的制备3-氨基苯硼酸(3-Arainophenylboronicacidhemisulfate,PBA+)26.9mmo1混悬于20ml水，用INNaOH溶液(约25ml)调节至pH5.0。溶液总体积约45ml。曱基丙烯酸(Methacrylacid,MAA)30mmol溶于20mlINNaOH溶液中，INNaOH溶液调节溶液pH4.8.溶液总体积约25ml。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(l-ethyl-3-(3-diraethylaminopropyl)carbodiimide，EDAC)30mmol溶于10ml水，加入0.INHCl调节pH至4.90,溶液总体积约15ml。上述PBA+悬液和EDAC溶液混合，搅拌，冰浴(<10°C),通入N2，维持pH4.9。30min后，在相同条件下将MAA溶液緩慢滴加入该混合液中，完成后反应混合物继续通&冰浴lhr。将反应混合物转移至分液漏斗，用100ml干燥乙醚分次提取产物，收集乙醚层，合并，减压蒸发去除乙醚，所的残渣在热水中重结晶，得甲基丙烯酰氨基苯硼酸白色结晶。洗涤，真空干燥，收率40_50%.其NMR图见图4同法制备戊烯酰氨基苯硼酸(其NMR图见图5)、庚烯酰氨基苯硼酸(其丽R图见图6)。实施例2凝胶的制备曱基丙烯酰氨基苯硼酸Q.2mM,二甲胺基丙基甲基丙烯酰胺(N，N—Dimethylaminopropylmethylacrylamide，DMAPMA)0.8mM，EG腿(Ethyleneglycoldimethacrylate)6.4pl，N，N，N，，N，-四甲基乙二胺(N，N,N，，N，-tet濯ethylethylenediamine，TEMED)2pi,溶解于1ml甲醇水(l:l)中，加入10%过硫酸铵(Ammoniumpersulfate，APS)溶液30ja1,将该混合液放入适宜的容器中成型(室温12~24h)。所制得凝胶结构MeMeMeMe实施例3实施例2凝胶在葡萄糖溶液、不同pH緩沖液及果糖溶液中的溶胀改变实施例2凝胶对葡萄糖敏感，以相同pH条件下葡萄糖浓度为0时凝胶直径为初始值(100%)计算凝胶直径的变化率作为溶胀率，凝胶在葡萄糖溶液中溶胀率发生改变，在一定范围内随葡萄糖浓度增加溶胀率变化程度增大，见图1。具体如下1)当pH为4.57时，加入2.5mM葡萄糖，凝胶溶胀率明显升高(直径增大约10%)，在2.5mM后葡萄糖浓度继续增加，凝胶溶胀率不再随葡萄糖浓度的增大而改变；2)当pH为5.4时，随葡萄糖浓度增加，凝胶溶胀率逐渐升高；3)当pH为6.4时，凝胶溶胀率不随葡萄糖浓度变化而变化；4)当pH为7.4时，在葡萄糖浓度0~10.OmM范围内，凝胶溶胀率逐渐降低(直径减小约6%)，在10.OmM后葡萄糖浓度继续增加，凝胶溶胀率不再随葡萄糖浓度的增大而改变；5)在pH为8.4和9.4时，在葡萄糖浓度0~5.OmM范围内，凝胶溶胀率逐渐降低(直径分别减小约10%和12%)，在5.OmM后葡萄糖浓度继续增加，凝胶溶胀率不再随葡萄糖浓度的增大而改变。实施例2凝胶对pH敏感，在磷酸盐緩冲液中随pH的变化溶胀率发生改变，以pH7.4时凝胶直径为初始值(100%)计算凝胶直径的变化率作为溶胀率，pH降低，凝胶溶胀率显著升高，pH升高，凝胶溶胀率变化不显著，见图2。实施例2凝胶对果糖不敏感，以pH7.4、糖浓度为0时凝胶直径为初始值(100%)计算凝胶直径的变化率作为溶胀率，果糖溶液中凝胶溶胀率不随果糖浓度的变化而变化，同时，果糖对实施例2凝胶的pH敏感性没有影响，见图3。参考文献1.IshiharaK，KobayashiM，IshimaruN，etal.glucoseinducedpermationcontrolofinsulinthroughacomplexmembraneconsistingofimmobilizedglucoseoxidaseandapoly(amine).PolymJ1984，16:625-631.2，CartierS，HorbettTA，TantnerBD.Glucose-sensitivehydraulicpermeabilityandinsulindeliveryfromapressurizedreservoir.JMembrSci1995，106:17-24.3.HassanCM，DoyleIIIFj，PeppasNA,Dynamicbehaviorofglucose-responsivepoly(methacrylicacid-g-ethyleneglycol)hydrogels.Maceomolecules1997，30:6166-6173.4.Brownlee，CeramiA.aglucose-controlledinsulindeliverysystem:semisyntheticinsulinboundtolectin.Science1979，206:1190-1191.5.KimSW，PaiCM,MakinoK，etaLself-regulatedglycosylatedinsulindelivery.JControlledRelease1990,11:193-201.6.LeeSJ，ParkK.synthesisandcharacterizationofgel-solphase—reversiblehydrogelsensitivetoglucose，JMolRecogn1996，9:549-557.7.Kitano,Y，Koyama，Kataoka，T.Okano，Y,Sakurai,AnoveldrugdeliverysystemutilizingaglucoseresponsivepoJymercomplexbetweenpoly(vinylalcohol)andpoly(N-vinyl-2-pyrrolidone)withaphenylboronicacidmoiety.JControlledRelease1992，19:162-170,8.KataokaK，MiyazakiH，BunyaM,etal.Totallysyntheticpolymergelsrespondingtoexternalglucoseconcentration:Theirpreparationandapplicationtoon-offregulationofi腿lin-rde跳JAmChemSoc1998,120(48):12694-12695.权利要求1下式的水凝胶A-B-C其中A为未与B或C结合前的下式的烯酰氨苯硼酸<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>R1＝H或-(CH2)nCH3，n＝0～10R2＝H或-(CH2)nCH3，n＝0～10R3＝(CH2)n，n＝0～10R4＝NO2，-Cl，-Br，-F，-CH3，-CF3，-CBr3，-CCl3，-H，B为选自二甲胺基丙基甲基丙烯酰胺，丙烯酰胺，N，N-二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯，2-羟丙基甲基丙烯酸酯或N-异丙基丙烯酰胺；C为选自二甲基丙烯酸乙二醇酯或N，N′-亚甲酸丙烯酰胺；并且A、B、C之间可以是任意排列结合。2权利要求1中凝胶，A与B的比例为1%:99%~99%:1%;3权利要求1中凝胶，A选自下述结构(4-羧基-2-硝基苯基)-硼酸；3-羧基-5-硝基苯基)-硼酸。4权利要求1中凝胶，其中b为可以由二甲胺基丙基甲基丙烯酰胺。5权利要求l中凝胶，其中c为N，N，-亚曱酸丙烯酰胺。6.权利要求1的凝胶，其为下式凝胶<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>7权利要求1-6中凝胶的制备方法，其包括在曱醇和水混合物中将a、b与c进行反应，甲醇水体积比为100%:0~0:100%。8胰岛素自调式给药系统，其包括胰岛素和权利要求1-6中任一凝胶。9权利要求1-6凝胶在制备胰岛素自调式给药系统或血糖监测系统中的用途。全文摘要本发明涉及葡萄糖敏感水凝胶，其制备方法及其在胰岛素给药系统和血糖动态监测中的用途。其中所述葡萄糖敏感水凝胶及其方法的技术特征在于A、B、C之间的任意排列结合和A与B之间的比例。文档编号C07F5/00GK101273961SQ200710146250公开日2008年10月1日申请日期2007年8月30日优先权日2007年3月30日发明者徐风华申请人:中国人民解放军总医院