作为药用产品的特异针对虫媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)＇2和/或Fab片段的浓缩物的制作方法

专利名称：作为药用产品的特异针对虫媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)＇2和/或Fab片段的浓缩物的制作方法
作为药用产品的特异针对虫媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)'2 和/或Fab片段的浓缩物本发明涉及用于治疗虫媒病毒(arboviruses)的新的药用产品，即特异 针对所述虫媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)'2和/或Fab片段的浓缩物，以及 其制备方法。前言在其循环中利用节肢动物媒介的病毒被归于通用术语上的虫媒病 毒。虫媒病毒被WHO定义为基本上或主要通过借助吸血节肢动物的易 感脊推动物宿主间的生物性传播存在于自然界的病毒；在外潜伏期之后， 它们在脊推动物体内繁殖并引发病毒血症，在节肢动物的组织内增殖并 通过叮咬昆虫被传播到另 一脊推动物。所述病毒从病毒血症宿主向成年雌蚊的传播经由叮咬发生时被吸出 的血液发生。所述病毒在蚊子体内繁殖，穿过该动物的胃屏障，在唾液 腺中^皮发现。通过刚好在蚊子叮入血管之前释i文的抗凝唾液实现对健康 人的感染。窗口期仅有几天，在此期间人是发病前的病毒血症宿主。已知的虫々某病毒属于五大病毒家族-4皮月莫病毒牙牛(Togaviridae),曱病毒属(genus Alphavirus),包4舌切昆 贡亚热(C7 汰MWgimya)、阿尼昂尼昂(O',o"g 7Vyowg)、 罗斯河(/ om i /ver)、 辛德华斯CSV"必^)和马雅罗(A/^ara)病毒的28种病毒-黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(genus F/aWvzV*—， 包括黄热病病 毒、登革热病毒、日本脑炎病毒，西尼罗病毒(环fewM/eWms)，欧亚大陆 温带地区的蜱传脑炎病毒，以及能够引起夸赛纳森林病(Kyasanur forest disease)和鄂木斯克(Omsk)出血热的病毒的68种病毒-布尼亚病毒科(Bunyaviridae)， 布尼亚病毒属(genus Bw"y謂'ms)(包 ^"布尼亚维4立病毒(^M"少a7mvera v/n^s)的138种病毒)，白虫令热病毒属 (genus i^/e6ovzW力(包括裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus)的43种病毒)， 内罗病毒属(genus A^'ravz'ms)(包括克里米亚-刚果(Crimea-Congo)出血热病毒的24种病毒)+ 41种未分类的病毒-呼肠孑瓜病毒一牛(Reoviridae)，环状病毒属(genus CW z'v/ra力(69种病毒) 和科蜱病毒属(genus Co/"'w'ms) (2种病毒)+ 6种未分类的病毒-弹讶犬病毒牙牛(Rhabdoviridae)， 7jc疱病毒属(genus ^w.cw/ov/n^) (18 种病毒)和狂犬病毒属(genus Z^w"v/ms) (16种病毒)+ 36种未分类的病 毒。下面详述在热带观察到的主要虫媒病毒。登革热在全球的所有热带、亚热带地区传播，代表了由虫媒病毒引 起的主要的公共健康问题。有四种登革热病毒血清型，被称为"登革热1、 2、 3和4",这些血清型不产生交叉保护。在临床上，有几种形式的登革 热比较著名无症状登革热；典型登革热(CD)及其严重形式，尤其是出 血形式；出血性登革热(HD)以及能导致死亡特别是在儿童的登革热休克 综合征(DSS)。这四种类型的登革热病毒都能引起CD以及HD。涉及HD 的发生的病理生理机制是未知的。最常使用的理论参照了"免疫加强"的 现象因为已经感染了四种血清型中的一种的个体并不能被保护抵抗另 外三种病毒，继发的异源感染可能导致HD。传病媒介为伊蚊属(genus 」ecfes)蚊子埃及伊蚊04^Z&s aegw。是主要的传病媒介；白紋伊蚊(aetfe a/6o; z'c^s)在农村和城市边缘地区发挥重要的作用，并且能很好地适应温 带气候。目前认为西尼罗病毒是继登革热病毒之后传播范围最广的黄病毒； 它偶发地或以流行方式侵袭人类。最近描述了它第 一次出现在美洲大陆 的情景，在1999年以流行病形式发生在纽约(62例，包括7例死亡)。然 后在2003年它在美国大范围传播，在44个州侵袭了超过卯00人，包括 2866例脑炎和264例死亡。先前已经在非洲、中东、印度和欧洲等世界 上的不同地区发现了这种病毒。蚊子是西尼罗病毒的主要传病々某介，它 们大部分是库蚊(Cwfec)属。所述病毒的主要宿主是野生的和家养的(鸭子、 鹆子等)禽类。它们在病毒的传播中扮演着关键角色。西尼罗病毒感染人 类主要是经由传病媒介蚊子的途径。所述感染的特征是经过3至6天的 潜伏期后出现突发性高热。这种发热伴随着头痛、背痛、肌肉痛、咳嗽、 颈淋巴结肺大，并经常出现皮渗、恶心、腹痛、腹泻和呼吸道症状。在低于15%的病例中出现了并发症脑膜炎、脑炎、以及极少数的肝炎、 胰腺炎或心肌炎。通常患者会自发恢复，有时会留有后遗症。然而所述 疾病对老人及有时对幼儿是致命的。在撒哈拉以南非洲和热带美洲，黄热病(YF)仍然是难对付的地方病 和持续的威胁。它是由阿马里尔病毒(amaW/Wm )引起的。黄热病表现形 式为出血性肝肾炎、阿马里尔斑渗伤寒、并有初期或"红，，期、第三曰的 緩解以及淤滞期或"黄"期，伴随黄疽、呕吐、出血(主要是在胃肠道)及肾 综合症。黄热病的流行病学是复杂的，因为在自然区域，阿马里尔病毒 通过作为传病媒介的野生simiophilic蚊在猴种群中持续传播。只是偶然 地，当人类接触到这种丛林中的循环时，第一个人的病例就产生了。切昆贡亚热(缩写为CHIK)通过伊蚊属蚊子传播。所述名称来自班图 语，意思是弯曲的人、巻曲的人、或弯曲人的疾病，因为它引起非常 严重的关节疼痛并且合并僵硬，这使被感染的患者呈现出极典型的弯曲 表征。在超过950种的蚊子中，有几种能够传播切昆贡亚热，但到目前为 止只有埃及伊蚊和白紋伊蚊被确定为流行性的传病々某介，因为它们适应 人类居住的区域。这些相同的物种还与其它的虫媒病毒的传播有关登 革热、登革出血热(HDF)、黄热病等。临床特征主要表现为与登革热(登革热经常被误认为是切昆贡亚热， 反之亦然)发热近似的高热，且合并有导致失去活动能力的关节疼痛，以 及有时出现的皮瘆。然而，还有直到现在仍被忽视的一些严重形式爆 发性肝炎、心脏病发作、脑膜脑炎等。诸如罗斯河、阿尼昂尼昂和马雅 罗的几种其他的曱病毒属虫媒病毒(约30-KD衣壳，且3'端聚腺苷酸化的 RNA)与相似的症状有关。疾病的潜伏期平均持续4至7天。病毒血症延续大约5天，该阶段 病毒存在于血液中，因此可能引起传播。随后抗体产生。病毒仍存留于 血液中。因此通常是获得终生免疫。可以利用疫苗来预防黄热病。疫苗接种在暴露群体中是系统的。然 而，所述群体的60%至80%必须被免疫(自然地或通过疫苗接种)以避免疾 病流行。抗体大约在10天后出现。孕妇和不满6个月的婴儿禁忌疫苗接种。在欧洲，疫苗还被用于预防蜱传脑炎。它以TICOVAC (Baxter SA) 的名字^皮出售。在美国，针对切昆贡亚热疫苗的I期和II期研究已被美军传染病医 学研究所实施(Edelman R等。"Phase II safety and immunogenicity study of live chikungunya virus vaccine"("活切昆贡亚热病毒疫苗的II期安全和免 疫原性研究")TSI-GSD-218. Juin2000; Am J Trop Med Hyg， 62:681-5)目前没有针对虫^ 某病毒的杀病毒治疗。治疗纯粹是针对症状进行的，以减轻发热和减轻疼痛。 现有技术在曱型肝炎疫苗开发之前，几项研究已经证明了含有抗-甲型肝炎抗体的免疫球蛋白注射剂在有暴露于该病毒风险的个体的功效(Ohara et al., Jpn J Exp Med， 1986 Oct; 56 (5): 229-33; Conrad ME et al.， J Infect Dis, 1987 Jul; 156 (1):56誦63)。乙型肝炎特异性免疫球蛋白或抗-HB被广泛用于保护任何被已污染 的物品刺破的未接种疫苗的个体，母亲为HB抗原阳性的新生儿(在这种 状况下，必须在出生后马上进行注射，且必须伴随疫苗接种的开始)，避 免移植再感染的肝脏移植患者，以及HB抗原呈阳性的个体在等待疫苗 接种产生作用时的性伴侣。这些免疫球蛋白在暴露于危险之前或在接触 传染源(意外刺破)后的24小时内建立起一种保护。发明概述面对缺乏建立的杀病毒治疗，以及只有一种疫苗通过了上市核准， 申请人:基于特异性免疫球蛋白使快速免疫暴露的人群成为可能，寻求开 发一种药用产品以治疗或预防虫媒病毒。申请人以令人惊喜的方式表明为了使这样一种治疗有效，需要特异 针对虫媒病毒的免疫球蛋白和F(ab)'2和/或Fab片段的组合。定义术语"浓缩物"指通过去除特定成分获得的产物。免疫球蛋白浓缩物 通过去除血浆中的特定成分获得，以得到富含免疫球蛋白的血浆部分。术语"免疫球蛋白"(Ig)指天然的球蛋白，主要存在于血浆中，具有抗 体功能，其可以被用于治愈性或预防性治疗。免疫球蛋白是由通过二硫键连接的2条重链和2条轻链组成的异源 二聚体。每条链都由N端的可变结构域或区(轻链由重排的V-J基因编码， 重链由重排的V-D-J基因编码)和C端的恒定区组成，所述可变结构域或 区对抗体针对的抗原是特异的，所述恒定区由轻链的单一 CL结构域或重 链的三个结构域(CH1、 CH2和CH3)组成。重链和轻《连的可变结构域和 CH1和CL结构域的组合形成了 Fab部分，所述Fab部分由极具弹性的 铰链区连接到Fc区，所述铰链区允许每个Fab结合到其靶抗原的同时， 使介导抗体的效应特性的Fc区仍然能够接近诸如FcyR受体和Clq的效 应分子。IgG是最多的免疫球蛋白(占循环抗体的75°/。到80%)。它们保护机体 抵抗在血液和淋巴液中循环的细菌、病毒和毒素。另外，它们迅速地结 合到补体(免疫系统的一个组分)。它们还参与记忆应答，所述记忆应答是 免疫的基础，疫苗接种的机制就是建立在其上的。最后，免疫球蛋白G 穿过胎盘屏障，从而在胎儿体内建立被动免疫。IgA^皮发现主要在诸如唾液、肠液、汗液和母乳的分泌物中。免疫球 蛋白A的主要作用是阻止致病体结合到细胞上，特别是组成粘膜和表皮 的保护细胞上。IgM是人体与抗原初次接触时分泌的免疫球蛋白。它们是由浆细胞 释放的第一类免疫球蛋白。IgM在血液中的存在提示现症感染。免疫球蛋白经木瓜蛋白酶酶性蛋白水解产生2个相同的被称为Fab 片段(抗原结合片段)的片段和一个Fc片段(可结晶部分)。Fc片段提供了 免疫球蛋白的效应器功能。经胃蛋白酶蛋白水解，产生了 F(ab')2片段，其中所述两个Fab片段 仍然通过两个二辟b键连接，而所述Fc片段被裂解成几个肽。所述F(ab')2 片段从两个Fab'片段(一个Fab'片段由一个Fab和铰链区组成)形成，通过 相互悬链的二硫键连接以形成F(ab') 2。术语"色谱层析"指分离混合物组分的方法，所述方法基于它们被合 适介质的选4奪性保留。发明详述首先，本发明涉及作为药用产品的、特异针对虫媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)'2和/或Fab片段的浓缩物。自从Cohn开发了乙醇沉淀方法(Cohn et al. 1946， J. Am. Chem. Soc. 68， 459; Oncley et al. 1949， J. Am. Chem. Soc. 71， 541)，使用富含免疫球 蛋白的人类血浆部分治疗各种感染或先天性免疫缺陷已为人所知。这种包含抗体结合部位的F(ab)'2或Fab片段可能已经失去了衍生它 们的完整抗体的若干特性，例如结合到Fcy受体的能力。能够用本发明提及的浓缩物治疗的所述虫媒病毒可以是，例如，登 革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、切昆贡亚热病毒、罗斯河病毒、阿 尼昂尼昂病毒或马雅罗病毒中的一种。在如本发明所述的浓缩物中，特异性针对虫媒病毒的免疫球蛋白A、 G和/或M的混合物与Ig A、 G和/或M的F(ab)'2和/或Fab片段之间的 所有组合都是可能的。特别地，本发明所述的浓缩物是特异性针对虫媒病毒的免疫球蛋白 A、 G和M与F(ab)'2和/或Fab片段的浓缩物。优选地，本发明所述的浓缩物是特异性针对虫媒病毒的只有免疫球 蛋白G或只有免疫球蛋白M，以及F(ab)'2和/或Fab片段的浓缩物。特别优选地，本发明所述的浓缩物是由特异性针对虫媒病毒的只有 免疫球蛋白G以及Ig G和Ig M的F(ab)'2和/或Fab片段组成的。优选地，本发明所述的浓缩物包含至少50%的IgG免疫球蛋白，90% 至98%的与特异针对人体免疫球蛋白的抗体进行反应的蛋白，特别包含 5%至50°/。的F(ab)'2和/或Fab，特别包含至少50至60 g/L的Ig和片段用 于药物制备。根据本发明，1至10 mmol的4美和/或锌可以添加到浓缩物中。 本发明的另 一个主题在于使用本发明所述的浓缩物制备用于治疗所 述虫媒病毒的药用产品。这种治疗是预防性和/或治愈性的。它用于向在传染病地区未被感染 的人提供被动免疫，或者用于治疗已经被病毒感染的患者。所述药用产品可以通过局部、口服、粘膜、肌内或静脉内途径给予。这种给药在几周内有效，大约是21天。超过了这个时间，如果传染 病或症状仍存在，必须重复给药。本发明还涉及制备本发明所述的浓缩物的方法。本方法包括将特异针对虫媒病毒的免疫球蛋白的浓缩物与特异针对同一虫媒病毒，且经蛋白水解获得了特异性针对该虫J;某病毒的F(ab)'2和 Fab片段的免疫球蛋白的浓缩物混合。本方法因此需要制备至少一种免疫 球蛋白的浓缩物。本发明从建立至少由1000份捐献的血浆组成的血浆库开始，每份捐 献的血浆都包含针对所述虫媒病毒的足够滴度的Ig。当通过诸如酶联免 疫吸附测定方法测定滴度时，包含足够滴度的血清相当于，例如，被稀 释到1/1000后抗-切昆贡亚热的抗体检测仍呈现阳性的血清。这些捐献的血浆来自于已经接触疾病的人或已经产生疾病的患者。可以按照C. van de Water et al.， Journal of Immunological Methods, 166 (1993)， 157-164进行滴定。为了使血浆库富含免疫球蛋白，被称为"脂类和蛋白污染物"的血浆 的其他组分以一步法^皮沉淀。这种通过一步法沉淀的纯化可以通过在如 Steinbuch (Steinbuch M.， Archiv. Biochem. Biophys., 134， 279画284)戶斤述^J 沉淀条件下稀释血浆并加入辛酸进行。它还可以通过在存在诸如例如磷 酸三钓和皂粘土等吸附剂的条件下加入诸如，例如利凡诺、氯化铝、西 吡氯4妄、辛酸、多聚^l酸盐的沉淀剂来获得。由沉淀产生的上清液可以构成免疫球蛋白浓缩物。因此，它包含IgG、 IgA和IgM的混合物。这种上清液被回收，例如通过过滤，任选地通过 力口入至少 一种过滤添加剂。将由离心或过滤产生的上清进行病毒灭活处理，诸如，例如利用溶 剂/去污剂(TritonX100)进行常规的病毒灭活处理。如果实施的沉淀是如上所述的"辛酸"型沉淀，上清中的辛酸残留物 用P04钓去除。为了得到IgG、 IgA或IgM的浓缩物，可以应用专利EP1385886中 描述的方法，特别是涉及pH值调节、吸附到预载柱、将包含免疫球蛋白 和伴随蛋白的上清吸附到柱、洗柱以及例如IgG、 IgA或IgM的各种免疫 球蛋白类型的连续洗脱的方法。病毒灭活步骤之后，上清经过在碱性pH 下进行的通过阴离子交换器色谱层析的附加纯化步骤。特别地，上清的 pH值;故预先调整到8.9至9.1，且用pH为8.9至9.1的M^冲液装载所述 柱。色谱层析步骤使免疫球蛋白吸附到柱上并使未被截留蛋白进入流出 液。色谱层析可以在例如结合了 DEAE、 TMAE或QAE基团的网状多糖 或乙烯聚合物凝胶上进行。用与装载緩冲液相同的緩沖液洗柱去除未截留蛋白后，免疫球蛋白G 被用pH值为4至7，优选pH 6.2的磷酸盐緩冲液洗脱。用pH值为6至6.3,补充有100至175 mM，优选为150 mM的氯化 钠的相同磷酸盐緩冲液进行的可任选的后续洗脱可以被用于收集IgA。用pH值^皮调整到6至7且补充有250至350 mM，优选为300 mM 氯化钠的相同磷酸盐緩冲液进行的可任选的后续洗脱可以被用于收集 IgM。通过混合如上所述的浓缩物，可以得到IgA、 IgG和IgM间的任何类 型混合物。如此洗脱和收集的免疫球蛋白可以通过超滤方法浓缩，例如先通过 常规的灭菌过滤，然后通过孔隙从100降至15纳米的纳米过滤器过滤。向经过浓缩和过滤的免疫球蛋白溶液中加入药学上可接受的稳定 剂，例如在专利申请WO2004/091656中描述的那些，然后将这一溶液包 装为无菌溶液并且任选地将其冷冻和/或冻干。纳米过滤技术的应用使去除那些抵抗病毒灭活溶剂/去垢剂处理的病 毒成为可能。由此获得的免疫球蛋白浓缩物的部分，或通过上述方式获得的免疫 球蛋白另 一浓缩物，经受蛋白水解得到F(ab)'2或Fab片段。然后将蛋白 水解产生的Ig浓缩物和片段的混合物混合。因此，通过如下步骤获得IgG及IgG和IgM的F(ab)'2和/或Fab的 浓缩物(1) 制备上述的IgG浓缩物，(2) 制备上述的IgM浓缩物，(3) 将一部分IgG浓缩物和一部分IgM浓缩物混合并消化，以获得 IgG和IgM的F(ab)'2和/或Fab片段的混合物，(4) 混合(1)和(3)。为了得到F(ab)'2片段，在pH4.0、 35。C条件下用1%的胃蛋白酶进 行蛋白水解，所述百分比对应于胃蛋白酶与浓缩物中蛋白重量的总重的 重量比(IGLOO操作)。为了得到Fab片段，用1%的木瓜蛋白酶进行蛋白水解，该百分比对 应于木瓜蛋白酶与浓缩物中蛋白重量的总重的重量比。免疫球蛋白G、 A和/或M的蛋白水解还可以通过使用纤溶酶和/或 胰蛋白酶进行，这些蛋白酶的实际应用为本领域的技术人员所熟知。下面公开的实施例描述了本发明的特定实施方案，但并不应该被认 为限定其范围。实施例1:抗-切昆贡亚热病毒的免疫球蛋白浓缩物的制备 1-1.血浆库的建立从近期被切昆贡亚热病毒感染且被从疾病征状中治愈的志愿捐献者 中采集1升富含抗-切昆贡亚热病毒抗体的血浆。抗体滴度通过酶联免疫 吸附测定方法测定，所述方法在于将病毒抗原固定于微量滴定板上，然 后通过针对免疫球蛋白的辣根过氧化物酶标记试剂显示特异抗体。为建 立所述的血浆库，在使用"特异的"酶联免疫吸附测定方法的情况下，至 少1/1000稀释的阳性测定样本才能被保留。1-2.免疫球蛋白的制备经1-1步骤得到的血浆库被冷却到-3。C,并且在冷却过程中加入一定 体积的乙醇，所述乙醇体积足以得到8%的终乙醇浓度。弃除由此形成的 沉淀。然后将上清的pH值调整到5.9，如通过加入乙酸緩冲液，冷却到-5。C， 最后加入一定体积的乙醇，所述体积足以得到19°/。的终乙醇浓度。由此形成的沉淀通过例如离心法被收集，且重悬于例如乙酸缓沖液中以获得4.7至4.9的终pH值。然后在20°C下加入辛酸，强烈搅拌，以获得20 g/1的终辛酸浓度。由此形成的沉淀通过离心法或沖积过滤被分离并弃除。将磷酸三4丐 或活性炭加入到上清中，然后通过深床过滤澄清混合物。将包含从澄清步骤得到的上清的免疫球蛋白的pH值通过例如添加 氢氧化钠/甘氨酸缓沖液调整到pH 9,并将上清应用到阴离子交换柱(例如 Fractogel TMAE),所述阴离子交换柱在pH为9的条件下用pH为9的甘 氨酸/氯化钠緩冲液装载。用加载緩冲液进行沖洗直至柱流出液在280nm处的OD接近在确立 基线时被测量的OD28Q。然后用pH值为6.2的第一磷酸钠緩冲液进行IgG洗脱。用补充有300 mM氯化钠的磷酸盐緩沖液进行第二次洗脱。相应的洗脱物包含IgA、 IgM和部分IgG4。在EP 1385886中公开了 纯化的具体操作过程。1-3.抗切昆贡亚热的活性浓缩物的制备回收包含IgG的第一洗脱物的25%,并将其加入到包含IgG4、 IgA 和IgM的洗脱物。这种免疫球蛋白的混合物通过在膜上进行超滤，；波浓 缩到50g/1，所述膜的截留阈值等于或小于30kD。通过针对pH值为3.8至4.2的柠檬酸盐缓冲液的透析过滤调整所述 浓缩混合物的pH值，以获得包含在这一范围内的酸性PH值。所述溶液 中加入胃蛋白酶(10000 FlP/mg)，以使胃蛋白酶的量达到浓缩混合物中包 含的蛋白总量的1%。然后将所述溶液在无菌条件下于0.2 (am处过滤， 并在37。C下孵育20小时。孵育后，中和蛋白水解液，例如通过添加pH值为6.2+/-0.2的氢氧 化钠。中和的蛋白水解液被针对pH值为6.2+/-0.2的甘氨酸緩冲液进行 透析过滤，直到OD280达到约0.005 ，所述OD280在30kD截留阈值膜的过 滤线上被测量。经胃蛋白酶水解产生的大小等于或小于30 kD的肽在经过截留阈值膜时被弃除。由此得到的蛋白水解物包含Fab片段、F(ab)'2片段，但缺 少Fc片段。然后将得到的蛋白水解物与包含IgG的第 一洗脱物的剩余75%混合。 接着将所述混合物通过超滤方法浓缩，依赖于所选择的给药途径，达到 范围在50至160 g/1的终浓度。浓缩物的滴度依照在Edelman， R等 (American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 62(6)， 2000， 681-685) 中描述的方法被测量。由此得到的浓缩物中抗-切昆贡亚热特异性抗体的 滴度至少高于初始血浆的3至10倍。1-4.制备物的用途经1-3步得到的浓缩物通过与包含药学上可接受的赋形剂的制剂混 合被稳定，所述赋形剂是诸如例如终浓度为0.22M,的甘氨酸，或诸如在 专利申请WO 2004/091 656中描述的那些。加到浓缩物中的制剂的pH值 与获得液体混合物是一致的，所述pH值范围为4.2至5.6。依赖于接受者的静脉状态，可以通过例如静脉内、皮下或肌内的途 径给药得到的液体混合物。给予的剂量对应于0.2至0.8ml/kg，在流行病的情况下，作为预防措 施可以每3周一次给予特殊暴露的患者，如老人、孕妇或新生儿。
权利要求
1.作为药用产品的特异针对虫媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)′2和/或Fab片段的浓缩物。
2. 如权利要求1所述的浓缩物，其中所述虫媒病毒是登革热病毒、 黄热病病毒、西尼罗病毒、切昆贡亚热病毒、罗斯河病毒、阿尼昂尼昂 病毒或马雅罗病毒中的一种。
3. 如权利要求1或2所述的浓缩物，其中所述免疫球蛋白是免疫球 蛋白A、 G和M。
4. 如权利要求1或2所述的浓缩物，其中所述免疫球蛋白是免疫球 蛋白G。
5. 如权利要求1或2中所述的浓缩物，其中所述免疫球蛋白是免疫 球蛋白M。
6. 如权利要求1至5中任一项所述的浓缩物，其中包含90%至98% 的免疫球蛋白及F(ab)'2和/或Fab。
7. 如权利要求1至6中任一项所述的浓缩物，其中包含5°/。至50% 的F(ab)'2和/或Fab。
8. 如权利要求1至7中任一项所述的浓缩物，其中所述的F(ab)'2和 /或Fab片段是IgG和/或IgM的F(ab)'2和/或Fab片段。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的浓缩物，其中将1至10 mmol 的镁加入其中。
10. 如4又利要求1至9中任一项所述的浓缩物，其中将1至lOmmol 的辞力口入其中。
11. 权利要求1至10中任一项所定义的浓缩物用于制备治疗所述虫 媒病毒的药用产品的用途。
12. 如权利要求11中所述的用于制备药用产品的用途，所述药用产 品以通过局部、皮下、口月良、肌内或静脉内途径给药的形式存在。
13. 制备如权利要求1至3中任一项所述的浓缩物的方法，其中所述 方法包括下述步骤-建立至少由1000份捐献的血浆组成的库，每份捐献血浆包含针对 所述虫媒病毒的足够滴度的Ig，画以一步法沉淀脂类和蛋白污染物， -在上清(l)中回收Ig浓缩物，-将一部分较初期浓缩物经受蛋白水解，以获得F(ab)'2和/或Fab片 段(2)，-混合组分(1)和(2)。
14. 制备如权利要求1-5中任一项所述的浓缩物的方法，其中所述方 法包括下述步骤-建立至少由1000份捐献的血浆组成的库，每份捐献血浆包含足够 滴度的抗-切昆贡亚热的Ig,-以一步法沉淀脂类和蛋白污染物，-在碱性pH条件下于阴离子交换器上对上清进行色谱层析，-用pH值为4至7的磷酸盐緩冲液洗脱IgG,以获得IgG浓缩物(l),-任选地，随后用添加了 100至175mM,优选为150mM的氯化钠的相同磷酸盐緩沖液在pH值为6至6.3的条件下洗脱IgA(l),-任选地，随后用PH值为6至7且添加了 250至350 mM氯化钠的相同磷酸盐緩冲液洗脱IgM(l),-任择地，混合IgG、 IgA和IgM浓缩物(l),-将一部分较初期浓缩物进行蛋白水解，以获得F(ab)'2和/或Fab片 段(2)，-混合组分(1)和组分(2)。
15. 如权利要求14中所述的方法，其中将上清的pH值调整到8.9至 9.1，并且在色谱层析之前将色谱层析柱用pH值为8.9至9.1的緩沖液装 载。
16. 制备如权利要求4和8中所述的浓缩物的方法，其中所述方法包 括下述步骤(1) 制备如权利要求14或15中所述的IgG的浓缩物，(2) 制备如权利要求14或15中所述的IgM的浓缩物，(3) 将所述IgG浓缩物的一部分和所述IgM浓缩物的一部分混合并 进行蛋白水解，以获得IgG和IgM的F(ab)'2和/或Fab片段，(4) 混合(1)和(3)。
17. 如权利要求13至16中任一项所述的方法，其中获得F(ab)'2片 段的蛋白水解在胃蛋白酶占蛋白重量的1%、 pH值为4、 35。C的条件下 发生。
18. 如权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述的获得Fab 片段的蛋白水解发生在木瓜蛋白酶存在时。
19. 如权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述沉淀是辛酸 的沉淀，并且其中通过P04钙去除上清中的辛酸残留物。
20. 如;K利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述沉淀物在加 入至少 一种过滤添加剂后^皮过滤分离。
21. 如权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述上清通过溶 剂/去垢剂处理。
22. 如权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述洗脱的免疫 球蛋白通过超滤方法浓缩，先进行常规的灭菌过滤法，然后再通过孔隙 从100纳米缩小至15纳米的纳米过滤器过滤。
23. 如权利要求13至22中任一项所述的方法，其中将药学上可接受 的稳定剂添加到经浓缩和过滤的免疫球蛋白的溶液中，然后将所述溶液 包装成无菌溶液并且可任选地将其冷冻和冻干。
全文摘要
本发明涉及用于治疗虫媒病毒的新的药用产品，即特异针对所述虫媒病毒的免疫球蛋白及F(ab)′2和/或Fab片段的浓缩物，以及其制备方法。
文档编号C07K16/10GK101410136SQ200780011078
公开日2009年4月15日 申请日期2007年4月2日 优先权日2006年3月31日
发明者罗兰·施米特赫斯勒尔 申请人:分馏及生物技术法国实验室股份公司