专利名称：：使用高产率的半乳糖异构化来制造塔格糖的方法
技术领域：
：本发明涉及一种使用高产率的半乳糖异构化来制造塔格糖的方法,更特别涉及一种通过在最佳条件下向反应溶液中加入特定结合到塔格糖，即酮式糖，上的硼酸盐来显著提高异构化转换率的方法以及使用该方法来制造塔格糖的方法。
背景技术：
：最近，已经通过化学合成由半乳糖来制造塔格糖。根据化学合成的常规方法，半乳糖在无机盐存在下异构化，经金属氢氧化物作为催化剂进行媒接，从而形成金属氢氧化物-塔格糖复合物的中间体。该中间体经酸中和来制造塔格糖。然而，该化学合成的常规方法，即使它是成本低且能高产率的制造该产品，但是其工艺非常复杂且效率低下，并产生工艺废料。制造塔格糖的另一方法是酶媒接转化法，其中醛糖或醛糖衍生物转化为酮糖或酮糖衍生物，接着使用酶将半乳糖转化为塔格糖。已知的是，已用于L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的阿拉伯糖异构酶通过使用半乳糖作为活体外酶底物能够产生塔格糖。因此，已经报道了许多具有不同来源的阿拉伯糖异构酶以及使用半乳糖来制造塔格糖的方法。半乳糖向塔格糖的异构化是一种可逆反应，表明反应物的浓度与产物的浓度达到平衡。该酶反应的特征在于热力学上随着反应温度的增加转化率成正比增加。因此，研制在高温稳定的新型酶以及使用它异构化的方法是使用异构酶来制造塔格糖的酶媒接转化的主要因素。当在30°C进行异构化24小时时，源自大肠杆菌的常规阿拉伯糖异构酶具有较低的从半乳糖向塔格糖的为25%的转化率。经报道，源自嗜3热微生物嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的阿拉伯糖异构酶在稳定反应条件60°C下具有46%的转化率。当源自海栖热袍菌(thermotogamaritime)的超嗜热的阿拉伯糖异构酶在70QC和80GC下的异构化反应时，半乳糖向塔格糖的转化率分别为50%和56%(Oh，D.K.，Kim,H丄，Ryu，SA,Kim,P.,2001."用于生产工业用塔格糖的l-阿拉伯糖异构酶的固定化方法"(Developmentofanimmobilizationmethodof1-arabinoseisomeraseforindustrialproductionoftagatose.)Biotechnol.Lett.23，1859-1862.;Kim，H丄，Oh,D.K.，2005."用于生产d-塔格糖，来自于嗜热脱氮土壤芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶的纯化及特征"(PurificationandcharacterizationofanL-arabinoseisomerasefromanisolatedstrainofGeobacillusthermodenitrificansproducingd誦tagatose.),J.Biotech.Nov4;120(2):162-73.Epub2005Aug9.;Lee,D.W.,Jang，H丄，Choe，EA,Kim，B.C.，Lee,S丄，Kim,S.B.,Hong.Y.H.,Pyun.Y.R.，2004."一种热稳定，来自于超嗜热海栖热胞菌的1-阿拉伯糖(d-半乳糖)异构酶的特征"(Characterizationofathermostable1-arabinose(d-galactose)isomerasefromthehyperthermophiliceubacteriumThermotogamaritima.)Appl.Environ.Microbiol.70，1397-1404.)。嗜热酶的应用和高温下的反应能够逐渐增加半乳糖向塔格糖的转化率。然而，通常，在70^或以上的反应温度，糖溶液的褐色程度成正比地随着温度的上升显著增加。此外，这种高温反应产生的副产物对最终产物的纯度和提纯成本有不利影响。因此，反应温度的上升是有限的。所以，最适用的反应温度似乎是7()GC，且在此温度下异构化的最大转化率为56%。到现在为止，还没有获得更高的转化率。
发明内容因此，本发明人通过证实使用半乳糖的异构化制造塔格糖的方法比常规方法产生了更高的产率而实现了本发明，该方法包括添加特定结合到塔格糖上的硼酸盐的步骤。本发明的目的之一是提供一种使用嗜热异构酶和包含其的宿主细胞来通过半乳糖异构化制造塔格糖的方法，更特别是提供一种通过添加特定结合到塔格糖上的硼酸盐来提高异构化转化率的方法以及提供一种使用该方法高产率地制造塔格糖的方法。本发明的另一目的是提供一种通过添加适当量的硼酸盐并在诱导硼酸盐选择性结合到塔格糖的条件下进行高温异构化来人工提高异构化转化率的方法。为了达到上述目的，本发明人通过添加特定结合到塔格糖上的硼酸盐显著增加了转化率以便通过使用源自嗜热的或超嗜热的微生物由阿拉伯糖异构酶来制造塔格糖，并进一步证实了通过使用该方法能够高产率地由半乳糖制造塔格糖。下文对本发明进行详细说明。本文中的阿拉伯糖异构酶可源自多种嗜热微生物，该嗜热微生物包括土芽孢杆菌属、极端嗜热菌、栖热菌属(Thermussp.)微生物等，但不总是限制于此。源自不同菌种的阿拉伯糖异构酶能够在不同反应条件下使用，只要该条件在它们自己的最佳反应条件(温度，pH)范围内即可。因此，在这些条件下进行每种异构化都包括在本发明的规范内。本发明中能够特定结合到塔格糖上的盐为硼酸盐。本发明中使用的硼酸盐特定结合到塔格糖上而非半乳糖上(图1)。硼酸盐的加入导致比不使用硼酸盐的常规方法更加有效的使半乳糖异构化，从而改变了酶底物和反应物之间的相平衡。本发明的盐的效果并不局限于硼酸盐，能够使用任何特定结合到塔格糖上的其他盐，也就是说，本发明的效果能够由不同条件下的不同盐实现。因此，添加塔格糖的特定盐来提高转化率的所有机理都包括在本发明的规范中。参照附图对本发明的优选实施方式的实施可以达到最好地理解，其中图1图示了在不同条件下半乳糖和塔格糖与硼酸盐反应后进行的TLC(薄层色谱法)结果。通道l、塔格糖通道2、半乳糖通道3、半乳糖+硼酸盐通道4、塔格糖+半乳糖+硼酸盐通道5、塔格糖+半乳糖图2是添加或不添加硼酸盐时以pH为参数的半乳糖向塔格糖的转化率图示，其中最高转化率被认为是100，并计算相对值。參表示在20mM硼酸盐存在下的反应结果，O表示硼酸盐不存在下的的反应结果。图3是是添加或不添加硼酸盐时以温度为参数的半乳糖向塔格糖的转化率图示，其中最高转化率被认为是100，并计算相对值。《表示在20mM硼酸盐存在下的反应结果，O表示硼酸盐不存在下的反应结果。图4是根据不同条件的转化率图示，其中以不同的摩尔比向高浓度酶底物中加入硼酸盐(100g/L、200g/L和300g/L)图5是硼酸盐存在和不存在时于含300g/L半乳糖的酶底物溶液(酶底物硼酸盐=100:40，摩尔比)中生成的塔格糖的异构化反应的结果图示。參表示在640mM硼酸盐存在下的反应结果，O表示不存在硼酸盐时的反应结果。國和口分别表示消耗的半乳糖和产生的塔格糖。实施本发明的最佳实施方式本发明的实际实施方式和目前优选的实施方式是示例性，如以下实施例中所示。然而，本领域的技术人员将会明白，在考虑本
发明内容时，能够在本发明的实质和保护范围内进行修改和改进。实施例1:硼酸盐与酶底物和产物的结合能力6为了研究在与硼酸盐异构化的产物中存在的两种糖源，半乳糖和塔格糖的相互作用，将每种糖源加入到硼酸盐缓冲液中，然后对比。半乳糖、塔格糖和它们的混合物(1:1)，每个都制成100mM。lml的糖源与lml的100mM的硼酸盐缓冲液(pH9.5)混合，混合物在室温下保持30分钟，然后进行TLC(薄层色谱法)。50^1的每种反应产物装在TLC片上，干燥然后在85%的乙腈溶液中显影。进行显色以分析结果，此时，着色剂用95%甲烷、5%硫酸和0.3%的N-l-萘基乙二胺制成。结果，硼酸盐特定结合到塔格糖上，该结果显示在图l中。实施例2:嗜热的阿拉伯糖异构酶的表达为了进行半乳糖异构化以在高温下由半乳糖制造塔格糖，使用了源自嗜热微生物嗜热脱氮土壤芽孢杆菌(geobacillustheimodenitrificans)的阿拉伯糖异构酶基因。根据以前的数据，将其中450th(半胱氨酸)和475th(天冬酰胺酸)氨基酸用丝氨酸和赖氨酸替换的突变基因插入载体pTrc99A中，为了转染将其引入大肠杆菌属BL21(DE3invitrogen,美国)。转化细胞用作制造菌株。重组细胞菌株以006。。=0.1的起始浓度接种在含有5(Hig/ml的氨苄青霉素的LB培养基(细菌用胰化胨10g/L，酵母提取物5g/L,NaCl10g/L)中，随后在37。C培育2小时。然后，通过加入IPTG(异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷)诱导酶表达，最终浓度为lmM。为了测量表达的阿拉伯糖异构酶的酶活性，通过用培养液在8000xg下离心10分钟恢复细胞。将细胞再悬浮在50mM的三-HCl缓冲液(pH7.0)中，通过超声处理细胞溶解。溶胞产物用作未加工的酶溶液来催化半乳糖异构化。半乳糖异构化的活性用含有40mM的半乳糖酶底物和lml的反应缓冲液(50mM的三-HCl，pH7.0)的100^1酶溶液混合物进行测量。同时，在反应溶液中也加入MnCl2(最终浓度为5mM)andMgCl2(最终浓度为1mM)实施例3:酶反应条件的最优化为了确定在硼酸盐存在下酶反应的最佳pH，通过混合半乳糖和具有不同pH值的硼酸盐缓冲液(pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)来制备反应酶底物溶液。反应酶底物原液的最终成分平衡为100mM的半乳糖和20mM的硼酸盐。纯化的酶加入到反应底物溶液(4mg/ml)中，随后在60'C下反应，直到它达到平衡。分析到达平衡的底物的转化率并与相对值比较(图2)。结果，通过加入硼酸盐使半乳糖向塔格糖的转化率增加。在中性pH到pH8.0的碱性条件下，转化率逐渐增加，然后在pH8.5或以上趋于固定。总的来说，在pH9.0或以上的条件下，化学合成相比酶反应要占主导地位。因此，酶活性最高并转化率最大程度增加的pH8.5被确定为反应的最佳pH值。4mg/ml的粗酶溶液加入到最佳的反应条件下的酶底物(100mM半乳糖，20mM硼酸盐，pH8.5)中。以反应温度为变化参数测量了转化率。通过将最大产量生成塔格糖处的点作为100来获得相对值(图3)。结果，当在6(TC加入硼酸盐时，获得了最高的转化率。实施例4:根据硼酸盐的摩尔比，最优化来自高浓度酶底物的转化至为了研究是否通过向高浓度的酶底物中加入硼酸盐能增加半乳糖向塔格糖的转化率并且为了最优化反应条件，在不同浓度下(100g/L、200g/L和300g/L)制备了半乳糖酶底物溶液。每个酶底物溶液中半乳糖与硼酸盐的摩尔比分别为100:20、100:40、100:60和100:80，且反应同样在pH为8.5、在60'C下进行(图4)。结果证实，半乳糖异构化中硼酸盐对塔格糖的作用与酶底物的浓度、半乳糖无关，该转化率随着硼酸盐摩尔比的增加成比例地增加。半乳糖与硼酸盐的最佳摩尔比证实为100:40。实施例5:在最佳反应条件下生成塔格糖对以实施例1-4中最优化的摩尔比添加硼酸盐所进行的试验结果与不添加硼酸盐所进行的试验结果进行比较。更特别地，制备了包含300g/L的半乳糖和640mM的硼酸盐(pH8.5)的酶底物溶液。其中加入30mg/L的粗酶溶液，接着在6(TC下进行异构化反应(图5)。8添加硼酸盐时，转化率显著增加。经证实，当不添加硼酸盐时，反应20小时后在300g/L的半乳糖底物中塔格糖产量为158g/L，当加入硼酸盐时塔格糖产量为232g/L，表明每组的转化率分别是52.7%和77.3%。工业实用性如上所述，当向半乳糖异构化反应中选择性地加入不影响最佳酶反应条件的硼酸盐以制造通过阿拉伯糖异构酶媒接的塔格糖时，转化率显著增加。热动力学上，随着温度的增加异构化的转化率增加。因此，在高温反应下能够增加半乳糖向塔格糖的转化率。然而，通常，糖的处理过程在60-7(TC或以上的反应中有困难，因为糖在高温是很容易转变成褐色的特性。因此，在本发明中使用阿拉伯糖异构酶的半乳糖向塔格糖的最大可能转化率在70。C下为55%。然而，根据本发明的特征在于添加硼酸盐的方法，相同条件下能够显著地增加转化率，并降低了生产成本。权利要求1、一种通过半乳糖异构化生产塔格糖的方法，其特征在于，包括添加硼酸盐的步骤。2、根据权利要求1所述的制造塔格糖的方法，其特征在于，向每lOOmol的半乳糖中加入l-80mo1的硼酸盐。3、根据权利要求1所述的生产塔格糖的方法，其特征在于，异构化在8.5-9的pH范围内进行。4、根据权利要求l所述的制造塔格糖的方法，其特征在于，异构化在60'C-7(TC的温度范围内进行。全文摘要本发明涉及一种使用高产率的半乳糖异构化来制造塔格糖的方法，更特别涉及一种通过加入可特定结合到塔格糖上的硼酸盐来提高异构化转换率的方法以及使用该方法制造塔格糖的方法。文档编号C07H7/06GK101558077SQ200780045683公开日2009年10月14日申请日期2007年12月10日优先权日2006年12月11日发明者吴德根,宋相勋,朴承源,李康杓,林昞哲,金慧贞,金成俌申请人:Cj第一制糖株式会社