专利名称：：一种具有抗肿瘤活性的环五肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及一种从海洋生物海藻中提取的具有抗肿瘤活性的环五肽。
背景技术：
：环肽作为肽类化合物中最有特点的一类，由于其相对稳定的构象，因而在作用受体的选择性和体内代谢的稳定性方面都强于线性肽类化合物，环肽在抗真菌和杀灭肿瘤细胞等很多方面都表现出天然的优势。以往专利中环肽多来源于陆地动物、植物、微生物，资源有限，种类单一，如CN99815515.2、CN02114663.2等。海洋生物以其物种的多样性及其代谢产物的化学结构的多样性等优势，已成为生物活性物质的巨大宝库。海洋生物不同于陆地生物，海洋生物中蕴藏着大量结构新颖、化学性质特殊、生物活性极强的物质。海洋生物所含的肽类化合物，特别是环肽类化合物，在抗肿瘤、抗病毒、抗菌以及酶抑制剂活性方面现实了巨大的潜力。自1980年美国学者ChrisIreland等人(Irdand，C.;Scheuer，P.J.，J.Am.Chem.Soc.，1980,102,5688-5691)报道从海鞘中分离得到第一个具有抗肿瘤活性的环肽Ulithiacyclamide以来，从1980年到1996年底，从海洋生物中分离并鉴定了许多具有独特结构及生理活性的先导化合物，如从海兔Do/fl办eZ/"似n"/"r/"中分离得到的Dolastatin3、Dolastatin13和Dolastatin10对白血病细胞具有抑制作用，具很强的抗肿瘤生物活性；从海绵Geo^zsp.中分离得到的环肽GeodiamolideA和GeodiamolideB，他们对L-1210细胞毒活性很强，分别为0.032ug/ml和0.0026ug/ml;从加利福尼亚海域及加勒比海中群体海鞘7VW&mm/msp.中分离出的3种环肽DidemninAC,它们都具有体内和体外抗病毒和抗肿瘤活性,其中DidemninB的活性最强，对乳腺癌、卵巢癌具明显的抑制活性，同时,它还有明显的免疫抑制活性,体内活性较环孢霉素A强1000倍，并且DideminB已能够进行人工全合成，最有望成为新型抗肿瘤新药(刘云国,李八方等，中国海洋药物杂志,2006,24(3),51-57.)。海藻是海生资源的一大家族，全世界约有三万余种，我国海域辽阔，海藻资源尤为丰富，而且海藻能产生多种多样的化合物，如甾醇、萜类、脂肪族化合物等，这些化合物大多具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等多种多样的生理活性，因此从绿藻、红藻等藻类中提取环肽化合物，利用前景广阔。本发明的环五肽是首次从海洋生物海藻丝状乳节藻(Galaxaurafilamentosa)中分离得到。丝状乳节藻属红藻门乳节藻属，国内外对于乳节藻属的研究报道很少，目前尚未见有从乳节藻中提取环肽的报道。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种提取于丝状乳节藻中的新的具有抗肿瘤活性的环五肽。本发明的另一个目的在于提供上述环五肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的环五肽是环(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰)英文縮写表达式为cyclo-(Leu-N-Me-Leu-Leu-Leu-N-Me-Leu)，其中Leu为亮氨酸，Me为甲基，为白色针状晶体，分子式为C32H59N505，[M+H]+m/z:594.4，mp:208210。C，[ap=_130(C=0.1，MeOH)，和13C的核磁共振如表1所示，并通过二维核磁共振谱(TOCSY、DQCOSY、HMQC和NOESY)，确定了该环五肽所有碳原子和氢原子的归属以及该环五肽的化学结构，其结构式如式(I)所示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(I)表1环五肽(I)的和13C的核磁共振数据<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注l.该核磁共振数据是采用600MHz的核磁共振测定，样品溶解于氖代二氯甲綜o2表1中的各侧基的划分如式(II)所示。(II)本发明的环五肽是首次从海洋生物海藻丝状乳节藻(Galaxaumfilamentosa)中分离得到，其分离制备过程如下(1)用溶剂浸泡丝状乳节藻得浸提物；(2)减压浓縮上述浸提物，经有机溶剂萃取，萃取液浓縮得粗提物；(3)将上述粗提物经柱层析分离得环(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰)的粗品，再经重结晶即得环(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰)单体。上述步骤(1)中，浸泡丝状乳节藻的溶剂为普通溶剂，优选乙醇、甲醇、丙醇、丙酮中的一种或多种。上述步骤(1)中，丝状乳节藻浸泡提取时间为715天，温度为20°C40°C。上述步骤(2)中，萃取液为有机溶剂，优选乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇、氯仿、石油醚、乙醚中的一种，或采用其中一种以上溶剂分别萃取，再合并萃取液。上述步骤(2)中，萃取液的浓縮温度为20QC120°C。上述步骤(3)中，柱层析分离为硅胶层析、离子交换树脂、大孔树脂、C18反相色谱柱中的一种或一种以上。上述步骤(3)中，对粗品的重结晶可采用甲醇、乙酸乙酯、氯仿中的一种或一种以上。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)对本发明的环五肽进行体外抗肿瘤活性试验，试验结果证明，本发明的环五肽对人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株BEL-7402、人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株LOVO、人肺癌细胞株PC84045和人鼻咽癌细胞CNE具有强的抑制作用，且能使BEL-7402肝癌细胞的细胞周期阻滞在G2/M期。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.本发明从丝状乳节藻中提取到一种新的环五肽，该环五肽具有强的抗肿瘤活性，为研究开发新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，同时也对开发利用我国的海洋药物资源具有重要价值；2.本发明环五肽的提取方法是通过简单的有机溶剂分级分离制备得到的，具有制备工艺简单，生产成本低的优势。具体实施方式实施例l环五肽的制备环五肽的制备方法，其具体步骤如下(1)将丝状乳节藻于乙醇中浸泡提取，温度为2(TC，45天后将浸泡提取液减压浓缩；(2)将浓縮后的浸提物经乙酸乙酯溶液萃取后，2(TC减压浓縮得粗提物-，(3)将上述粗提物经硅胶层析得环五肽的粗品，再经甲醇重结晶即得环五肽单体。该环五肽为白色针状晶体，分子式为C32H59N505，25[M+H]+m/z:594.4，mp:208210。C，[ct〗D=—130(C-O.l，MeOH)，iH和13C的核磁共振如表1所示，并通过二维核磁共振谱(TOCSY、DQCOSY、HMQC和NOESY)，确定了该环五肽所有碳原子和氢原子的归属以及该环五肽的化学结构，其结构式如式(I)所示。实施例2体外抗肿瘤活性试验采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)，将实施例l得到的环五肽(I)与人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株BEL-7402、人结肠癌细胞株LOVO、人鼻咽癌细胞CNE和人肺癌细胞PC84045，分别作用时间72小时，结果如表2所示。表2环五肽(I)对肿瘤细胞的半数有效浓度(IC50)细胞种类HepG2MCF-7BEL-74021XDVOCNEPC84045ICso(Xl(TV)l/L)2.76.04.06.16.75.2实施例3环五肽对BEL-7402肝癌细胞周期的作用试验采用碘化丙锭(PI)染色法，将不同浓度的环五肽(实施例1制备得到的环五肽)作用BEL-7402肝癌细胞48小时后，流式细胞仪测定细胞周期结果如表3所示，其中环五肽的浓度分别为2.5Xl(y6mol/L和5.0Xl(T6mol/L。表3不同浓度作用Bel—7402细胞周期各时相比例(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从实施例2和实施例3的结果可以看出，本发明的环五肽经体外抗肿瘤活性试验表明其具有强的抗肿瘤活性，本发明为研究开发新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。权利要求1.一种环五肽，其特征在于该环五肽的分子式为C32H59N5O5，结构式如式(I)所示。id="icf0001"file="S2008100279921C00011.gif"wi="78"he="89"top="57"left="65"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、权利要求l所述环五肽在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明公开一种具有抗肿瘤活性的环五肽，该环五肽为环(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰)，其结构式如式(I)所示。本发明的环五肽是从我国南海海域的海藻丝状乳节藻中分离得到的，体外试验证明，该环五肽对人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株BEL-7402、人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株LOVO、人肺癌细胞株PC84045和人鼻咽癌细胞CNE具有强的抑制作用，且能使BEL-7402肝癌细胞的细胞周期阻滞在G2/M期。本发明为研究开发新的抗肿瘤药物提供了先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。文档编号C07K7/00GK101270154SQ20081002799公开日2008年9月24日申请日期2008年5月9日优先权日2008年5月9日发明者徐石海,许文杰申请人:暨南大学