专利名称：一种氯霉素全抗原的制备方法
技术领域：
本发明属于化学技术领域，具体涉及一种含有氯霉素的复合物，特别是 涉及一种氯霉素全抗原的制备方法。
技术背景氯霉素(Chloramphenicol, CAP),是一种有效的广谱抗生素，曾广泛 应用于临床，但由于其会引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾 病，现已在临床治疗上严格控制。但氯霉素因其廉价和有效性，目前用于各种动物疾病的控制，对畜禽疾 病的控制和治疗发挥了重要作用，但其残留在动物的肉、奶、蛋中，仍会导 致人们通过食物链摄取氯霉素，威胁着人类的健康。近几年欧美等发达国家 已相继禁止或严禁使用氯霉素，并对畜产品中CAP残留制定了限量标准。我 国农业部农牧发200124号文件规定，在马肝、鸡肉等中氯霉素的残留限 量为不得检出，对于用酶联免疫ELISA和高效液相色谱分析法HPLC检测时， 要求其检测限量为lng/g。测定食品中氯霉素含量的高效液相色谱分析方法和气相色谱等仪器分 析方法、微生物法、比色法的样品前处理及测定过程操作繁琐，费用高，不 适于大量样品筛査和在基层推广使用。而酶联免疫吸附测定法ELISA具有灵 敏度高、特异性强、仪器设备要求低和样品前处理相对简单等优点，适于现 场监控和大量样品筛查，也可以直接应用于生产实践。为了建立酶免疫分析 方法，首先必须制备出效价高特异性强的抗体。氯霉素是小分子物质(分子量〈1000道尔顿)，本身不具有诱导产生抗体的能力，为此，必须设法先将 小分子氯霉素与载体蛋白质偶联制备成全抗原，这是酶免疫分析的关键所 在。但是小分子与载体蛋白结合时，结合比并非越高越好，太低很难引起血 液的抗氯霉素免疫反应，太高则影响载体蛋白的空间结构，使其难于被T细胞识别而引起免疫反应。实验证明，结合比一般在10 40之间即可以获得较高特异性的抗体，也可以提高其酶联免疫检测的灵敏度。因此选用合适的 氯霉素全抗原合成方法很重要。目前常用的氯霉素全抗原合成方法有重氮化法、混合酸酐法、戊二醛法、DCC法、EDC法等。重氮化法合成得到的抗原中间臂间隔太短而造成免 疫原性不强；混合酸酐法操作繁复，控制条件严格，中间过程损失较大，且 涉及到剧毒药品氯甲酸异丁酯；戊二醛法往往造成合成的载体蛋白之间偶联 交联率较大；DCC法水溶性不强。现有技术中的EDC法，其结果不稳定，常 出现合成不成功的情况。中国专利申请号200610155565.2的专利申请公开 了一种氯霉素人工抗原的制备方法，是将氯霉素溶于无水吡啶中，并加入琥 珀酸酐，使氯霉素分子导入了羧基，加交联剂EDC和6-氨基己酸，使氯霉 素衍生物中的羧基与6-氨基己酸中的氨基縮合，增长了碳链，然后与载体 蛋白质进行偶联，得到氯霉素一碳链一载体蛋白复合物。但所公开的制备方 法耗时比较长，十几个小时甚至二十几个小时，过程也相对复杂。目前缺乏一种高效、低成本、少副反应、简便的方法来合成氯霉素全抗原。发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种氯霉素全抗原的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案来予以实现的 提供一种氯霉素全抗原的制备方法，包括以下步骤(1) 将琥珀酰氯霉素溶于DMF中，加入不含氨基的缓冲溶液；(2) 往(1)中加入EDC和Sulfo-丽S，反应得到甲液；(3) 称取载体蛋白质，溶于PBS溶液，配制乙液；(4) 将甲液逐滴加入到乙液中，偶联反应后纯化得到氯霉素全抗原。 步骤(I)所述缓冲溶液的pH值为4.7 6.0。步骤(1)所述琥珀酰氯霉素与DMF的比例为23mg琥珀酰氯霉素0. 4 0. 6mLDMF;所述缓冲溶液加入量为每23mg琥珀酰氯霉素加入0. 5mL缓冲溶 液。步骤(2)所述EDC和Sulfo-NHS的加入量为琥珀酰氯霉素EDC: sulfo-NHS摩尔比为l:0.8 2:0.8 2，摩尔比优选为1:1.2:1.2;所述反 应为室温反应2小时。步骤(3)所述载体蛋白质为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、 卵清白蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH))等常用载体蛋白。所述载体蛋白质为牛血清白蛋白；所述牛血清白蛋白与琥珀酰氯霉素的 摩尔比为1: 35 175。步骤(3)所述PBS溶液含有0. 15M NaCl、浓度为0. 05 0. 1M、 pH值 为7.0 7.6， 浓度优选为O. 1M， pH值优选为7.4。步骤(4)所述偶联反应为滴加完甲液后反应4小时步骤(4)所述纯化是将偶联反应产物过S印hadex G-25层析柱脱盐， 收集第一峰。本发明的有益效果是本发明提供的氯霉素全抗原的制备方法过程简 单、少副反应、耗时较少；使用的原料无毒或低毒；本发明提供了精确的制 备反应条件尤其是反应体系的pH值，可达到理想的偶联效果。采用本发明 得到的氯霉素全抗原适合应用于氯霉素的酶免疫分析，为相关的酶免疫分析 的检测快速、操作简便、降低成本提供技术基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。 实施例1按照以下步骤制备氯霉素全抗原(1) 将琥珀酰氯霉素溶于DMF中，加入不含氨基的缓冲溶液；(2) 往(1)中加入EDC和Sulfo-NHS，反应得到甲液；(3) 称取载体蛋白质，溶于PBS溶液，配制乙液；(4) 将甲液逐滴加入到乙液中，偶联反应后纯化得到氯霉素全抗原。实验仪器核酸蛋白分离纯化系统GE Pharmacia AKTA pH/C basic 10; TS型脱色 摇床，海门市麒麟医用仪器厂试剂氯霉素琥珀酸酯广东药学院实验室自制，参照现有的制备方法Sigma 氯霉素半琥珀酸钠盐(C3787) lg/ml溶解于水中，加入1M HC1调节pH至2， 离心取沉淀冻干而成；EDC(ICN) 、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)(上海延长生化科技发展 有限公司)、BSA (Sigma) 、 DMF(Fluka)，市购实验室常规使用试剂。 具体操作过程如下称取23.0mg氯霉素琥珀酸酯溶解于0.5mLDMF中，再加入0. 5mL、 0.1 M MES，含0. 15M NaCl，调pH值为5. 0，混匀。称取12. 5mg EDC和14. 2mg sulfo-NHS，摇匀，室温反应2小时，得到甲液。称取50mg BSA用3mL 0. 1M 、含0. 15M NaCl的PBS， pH7. 4，溶解，得 乙液。将甲液逐滴加入乙液中，混匀后，避光反应4小时，按照实验室常规方 法过S印hadex G25层析柱层析，收集第一峰为合成的CAP-BSA全抗原。 实施例2:实验步骤、仪器和试剂要求同实施例l。具体操作过程如下称取23. Omg氯霉素琥珀酸酯溶解于0. 5mL DMF中，再加入0. 5mL， 0. 1 MMES， p朋.O， 0. 15MNaCl，混匀。称取12. 5mg EDC和14. 2mg sulfo-NHS， 摇匀，室温反应2小时，得到甲液。称取50mg HSA用3mL 0. 1M PBS， pH7. 4， 0. 15M NaCl溶解，得乙液。将甲液逐滴加入乙液中，混匀后，避光反应4小时，按照实验室常规方 法过S印hadex G25层析柱层析，收集第一峰为合成的CAP-BSA全抗原，可 采用现有的氯霉素全抗原使用方法使用于氯霉素的酶免疫分析。 实施例3:实验步骤、仪器和试剂要求同实施例1。具体操作过程如下称取23. Omg氯霉素琥珀酸酯溶解于0. 5mL DMF中，再加入0. 5raL， 0. 1M MES， pH4. 7， 0. 15M NaCl，混匀。称取12. 5mg EDC和14. 2mg sulfo-NHS，摇匀，室温反应2小时，得到甲液。称取50mg BSA用3mL 0. 1M PBS， pH7. 6， 0. 15M NaCl溶解，得乙液。 将甲液逐滴加入乙液中，混匀后，避光反应4小时，过S印hadex G25层析柱层析，收集第一峰为合成的CAP-BSA全抗原。实施例4:实验步骤、仪器和试剂要求同实施例1。 具体操作过程如下称取23. 0mg氯霉素琥珀酸酯溶解于0. 5mL DMF中，再加入0. 5mL， 0. 1 M MES， pH5. 0， 0. 15M NaCl，混匀。称取12. 5mg EDC和14. 2mg sulfo-NHS， 摇匀，室温反应2小时，得到甲液。称取50mg BSA用3mL 0. 1M PBS, pH7. 0， 0. 15M NaCl溶解，得乙液。将甲液逐滴加入乙液中，混匀后，避光反应4小时，过S印hadex G25 层析柱层析，收集第一峰为合成的CAP-BSA全抗原。 实施例5: 实验步骤、仪器和试剂要求同实施例1。具体操作过程如下称取23. 0mg氯霉素琥珀酸酯溶解于0. 5mL DMF中，再加入0. 5mL， 0. 1M MES， pH5. 0， 0. 15M NaCl，混匀。称取20. 8mg EDC和23. 7mg sulfo-NHS，摇匀，室温反应2小时，得到甲液。称取50mg BSA用3mL 0. 08M PBS， pH7.0， 0. 15M NaCl溶解，得乙液。 将甲液逐滴加入乙液中，混匀后，避光反应4小时，过S印hadex G25层析柱层析，收集第一峰为合成的CAP-BSA全抗原。实施例6: 实验步骤、仪器和试剂要求同实施例1。具体操作过程如下称取23. 0mg氯霉素琥珀酸酯溶解于0. 5mL DMF中，再加入0. 5mL， 0. 1 M MES， pH5.0， 0. 15M NaCl，混匀。称取8. 3mg EDC和9. 4mg sulfo-NHS， 摇匀，室温反应2小时，得到甲液。称取50mg OVA用3mL 0. 05M PBS， pH7. 2， 0. 15M NaCl溶解，得乙液。 将甲液逐滴加入乙液中，混匀后，避光反应4小时，过S印hadex G25 层析柱层析，收集第一峰为合成的CAP-BSA全抗原。
权利要求
1、一种氯霉素全抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将琥珀酰氯霉素溶于DMF中，加入不含氨基的缓冲溶液；(2)往(1)中加入EDC和Sulfo-NHS，反应得到甲液；(3)称取载体蛋白质，溶于PBS溶液，配制乙液；(4)将甲液逐滴加入到乙液中，偶联反应后纯化得到氯霉素全抗原。
2、 根据权利要求1所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征在于 步骤(1)所述缓冲溶液的pH值为4.7 6.0。
3、 根据权利要求1所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征在于 步骤(1 )所述琥珀酰氯霉素与DMF的比例为23mg琥珀酰氯霉素:0. 4 0. 6mLDMF;所述缓冲溶液加入量为每23mg琥珀酰氯霉素加入0. 5mL 缓冲溶液。
4、 根据权利要求1所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征在于 步骤(2)所述EDC和Sulfo-NHS的加入量为琥珀酰氯霉素EDC: sulfo-NHS摩尔比为1:0. 8 2:0. 8 2，摩尔比优选为1:1.2:1.2; 所述反应为室温反应2小时。
5、 根据权利要求1所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征在于 步骤(3)所述载体蛋白质为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清白 蛋白或血兰蛋白。
6、 根据权利要求1或5所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征 在于所述载体蛋白质为牛血清白蛋白；所述牛血清白蛋白与琥珀酰氯霉素的摩尔比为1: 35 175。
7、 根据权利要求1所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征在于 步骤(3)所述PBS溶液含有0. 15M NaCl、浓度为0. 05 0. 1M、 pH 值为7. 0 7. 6。
8、 根据权利要求1或7所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征 在于所述PBS溶液pH值为7. 4。
9、 根据权利要求1所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征在于 步骤(4)所述偶联反应为滴加完甲液后反应4小时。
10、 根据权利要求1所述氯霉素全抗原的制备方法，其特征在于 步骤(4)所述纯化是将偶联反应产物过S印hadexG-25层析柱脱盐， 收集第一峰。
全文摘要
本发明公开了一种氯霉素全抗原的制备方法，是将琥珀酰氯霉素溶于DMF中，加入缓冲溶液，加入EDC和Sulfo-NHS，然后与蛋白质偶联反应后纯化得到氯霉素全抗原。本发明提供的氯霉素全抗原的制备方法过程简单、少副反应、耗时较少；使用的原料无毒或低毒；精确控制反应条件尤其是反应体系pH值获得理想的偶联效果。采用本发明得到的氯霉素全抗原适合应用于氯霉素的酶免疫分析，为相关的酶免疫分析的检测快速、操作简便、降低成本提供技术基础。
文档编号C07K14/795GK101250225SQ20081002729
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者孟民杰, 林月霞, 涛 段, 田素娟, 罗利琼, 斌 董, 茵 袁, 黄树林 申请人:广东药学院