专利名称：抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原的鸡卵黄抗体及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及寄生虫的诊断技术，特别涉及曰本血B及虫
背景技术：
血吸虫是一种寄生在静脉血管中的蠕虫，可感染人和牛等家畜在内的多种哺乳动物引起 血吸虫病。血吸虫病病人若得不到及时的诊断和治疗，可引起以肝硬化和腹水为主的晚期血 吸虫病，病人完全丧失劳动能力和生活自理能力，并最终因肝昏迷或不可控制的上消化道出 血而死亡。目前，血吸虫病仍是一种严重危害人类健康和经济发展的寄生虫病，全世界有74 个国家和地区流行此病，每年感染人数仍达2亿之多，在我国流行的为日本血吸虫病。血吸 虫病在我国长江流域及以南的湖南、湖北、江西、安徽、江苏、云南、四川、浙江、广东、 广西、上海、福建等13个省、市、自治区的370个县市流行，累计感染者达1160万人，钉 螺面积为143亿m2 ，受威胁人口在1亿以上。因此，血吸虫病防治工作所面临的形势仍然 十分严峻。
人及牛、猪、鼠等多种哺乳动物是血吸虫的终宿主，当人或牛等接触含有血吸虫尾蚴的 疫水时，尾蚴钻入宿主皮肤并脱掉尾部转变成童虫，在宿主皮下组织作短暂停留后，进入血 管或淋巴管，随血流经右心到肺，再由左心进入大循环，到达肠系膜动脉的童虫可穿过毛细 血管进入肝门静脉。童虫在肝门静脉发育到性器官初步分化后，即雌、雄合抱，再移行到肠 系膜静脉及直肠静脉寄居、交配、产卵。从尾蚴钻入皮肤到虫体发育成熟并产卵，日本血吸 虫约需24天。成虫寄生于门脉一肠系膜静脉系统，雌虫产卵于肠粘膜下层静脉末梢内。 一部 分虫卵随静脉血流沉积在肝或结肠肠壁组织内，另一部分虫卵可随破溃的组织落入肠腔，并 随宿主粪便排出体外。排出体外的虫卵必需入水，在合适的温度、渗透压和光照等条件下孵 出毛呦，当毛呦遇到其中间宿主钉螺时即钻入钉螺体内，经过母胞蚴、子胞蚴的无性繁殖阶 段发育成尾呦。尾呦自螺体逸出后即可感染新的宿主，开始新一代的繁殖。
早期、正确的诊断是控制血吸虫病流行的重要环节。我国经过半个多世纪的血防工作， 目前绝大部分疫区的血吸虫病感染率和患者的感染度都有明显下降，处于轻中度感染 (5-10%)。在血吸虫病的诊断中，粪检发现虫卵是确诊血吸虫感染的依据，但由于排卵量受
4感染度和感染阶段等诸多因素的影响，在中度或低度血吸虫病流行区粪检的敏感性并不能令 人满意，漏检率高，特别是在我国，单纯依靠粪检己不能满足血吸虫病诊断的需要，因此免 疫学检査己成为血吸虫病诊断的重要手段。传统的免疫学'诊断主要是检测患者血清中抗血吸 虫抗原的特异性抗体。常用的抗体检测方法有皮内试验(intradermal test, IDT)、环卵沉淀试 验(circumoval precipitin test, COPT)、间接红细胞凝集试验(indirect haemagglutination test, IHA)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、间接荧光抗体试验 (indirect fluorescent antibody method, IFA)等。但抗体存在时间长，无法区分现症和既往感 染，对病人治疗的指导意义不大。而循环抗原(circulating antigens, CAg)是活的虫体在人 体内寄生时排泄分泌的， 一般认为,在急性血吸虫病患者血清中CAg含量高，而在慢性血吸虫 病患者血清中,由于CAg不断与血清抗体结合形成血吸虫循环免疫复合物,故CAg含量较少。 所以，CAg检测对于血吸虫病的早期诊断和区分现症感染和既往感染特别有价值，并能作为 疗效考核的指标，但因含量少，所以对检测方法的灵敏性要求更高。
在国内外研究者的共同努力下，血吸虫病的免疫学诊断取得了显著的进步，但仍然存在 一些关键的技术问题。
(1) 现行的血吸虫病检测系统的疗效考核价值均不理想，主要原因是现有的大量检测试 剂都是检测抗体的，而抗体在病人治疗后的1-3年甚至十几年后仍可在血清中检测到，无法 区分现症和既往感染，因此需为疗效考核提供一种有效的以检测抗原为主的诊断系统。
(2) 循环抗原检测方法的主要困难在于患者特别是慢性期患者体内的循环抗原含量非常 少，目前的检测体系的敏感性较低，尤其是在对大量的轻度流行区的评估上还没有十分行之 有效的方法。
(3) 血吸虫病诊断试剂种类很多，水平参差不齐，试剂质量存在批间生产的差异和不稳 定的问题；诊断标准不够客观化，易导致人为误差等。
当前，寻找敏感和特异的循环抗原检测方法并推向广大的流行区是血吸虫病诊断试剂研 究与开发的主要方向。
鸡卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin, IgY)是鸡血液中的IgG抗体选择性转移 到卵黄中形成的，是普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类血清和卵黄中的典型的低分子量抗 体，不具有类似于IgG的50kDa重链Y ，且IgY的重链明显大于哺乳动物IgG的重链；在功 能上等价于哺乳动物IgG，而抗原性方面存在较大的差异，在免疫诊断方面比哺乳动物源性 的IgG更具优势。IgY由两条重链(H)和轻链(L)组成(见图1)，没有铰链结构，分子量为180KDa(7.8S)， 重链为67—70KDa，轻链为25Kda，有一个小体积副本，120KDa (5.7S)，存在于野鸭和某 些龟类中。较小的IgY的H链缺乏C3、 C4区，由于使用了特异的未端外显子(位于C2和 C3恒定区外显子间的内含子中)，5.7S IgY与F (ab) 2片段十分相似，因此正确名称为IgY (AFc)，其H链为u (AFc)。 7.8S IgY和5.7S IgY (AFc)可共存于同一种动物或单独存 在。IgY抗体仅在脊椎动物中发现，其分子结构存在多样性，与抗原结合位点构成组分相关， 其编码基因是可变基因(V)、多样化基因(D)和结合基因(J)，通过V、 D和J基因的随 机选择重组产生所有多样性初级抗体。低等脊椎动物对抗原应答所产生的抗体呈现较窄的、 受限制的多样性。鸡的抗体L和H基因座位仅有一个V基因和一个J基因，只有D基因成 簇存在(16个基因)。因此鸡的Ig基因多样性是以基因转变的形式通过同源重组产生，缺乏 选择高亲和性的体细胞突变的机制。
IgY和IgY (AFc)都含有2个抗原结合位点，原则上来说，可以与多个抗原发生沉淀或 凝集反应现象，但事实并非如此。大多数鸡的抗体能牢固地结合抗原却只有在高盐浓度下(如 1.5MNaCI)才能引起沉淀或凝集反应。鸭的抗体经常不能表现有效地沉淀或凝集作用，那些 没有发生凝集的抗体即使在提高盐的浓度下仍不能获得凝集抗原的能力。这是因为两个Fab 片段的距离太近，由于空间位阻的原因，阻碍了它们与大分子抗原的结合。在高盐或低pH 情况下，IgY释放Fab间的距离以允许它们各自独立地结合抗原分子。Ig的许多效应器功能 是通过Fc区介导的，故而IgY (AFc)不能激活哺乳动物的补体系统、不与RF因子、类风 湿因子结合和SPA、 SPG结合等功能。从系统进化角度来说，AFcIgs的存在是具有一定的 选择优势。
用母鸡作为免疫动物和把鸡蛋作为抗体的来源有很多优势。(1)由于种系发生之间距离 大，母鸡可对哺乳动物的抗原产生更强的免疫应答。(2)母鸡可以持续的产生高亲和力的抗 体。20—30mg的高度保守的哺乳动物抗原可引起高效价的IgY长时间的分泌。(3)无损伤的 抗体收集。只需收集免疫母鸡的鸡蛋即可获得IgY。 (4)高产。 一只母鸡一年可产下约280 只蛋，每只蛋含有100—150mg的IgY，这样每只鸡每年可生产28—42g的IgY。 (5)不和类 风湿因子结合。在检测中应用IgY可避免假阳性结果。(6)与补体不发生反应。哺乳动物的 IgG可激活补体，导致假阴性的产生。IgY不和补体发生反应，在检测哺乳动物的血清时，可 减少由补体造成的干扰。
发明内容
本发明的任务是提供一种抗日本血吸虫虫卵可 性抗原(soluble egg antigens, SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin, IgY)。
本发明的另 一任务是提供一种体外检测血吸虫循环抗原的方法。 本发明的又一任务是提供一种检测血吸虫抗原的试剂盒。
实现本发明第一个任务的技术方案是
本发明提供的抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原(soluble egg antigens, SEA)的鸡卵黄免疫球 蛋白(Egg yolk immunoglobulin, IgY)，是用血吸虫的特异性抗原以注射的方法免疫母鸡后， 从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取的特异性IgY，制备抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵 黄免疫球蛋白的方法，包括以下步骤
(1) 制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA;
(2) 用日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA免疫母鸡，并收集鸡蛋； G)从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取、纯化特异性IgY。
上述步骤(1)所述的制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的具体方法是将感染日本 血吸虫的钉螺在25°C，光照充分的情况下逸出尾呦，将至少20只钉螺逸出的尾蚴混合，经 皮肤感染清洁级新西兰大白兔，感染量为800条尾蚴/兔，感染45天后麻醉感染的兔，生理 盐水心脏灌注，然后剖杀并取出肝脏，分离并收集肝脏虫卵。将收集的虫卵在冰浴中反复匀 桨后，4。C沉淀48h,10 000xg离心lh，吸取上清，收集分装，即为虫卵可溶性抗原SEA。
上述步骤(2)所述的用日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA免疫母鸡和收集鸡蛋的具体方 法是将60ug/ml的SEA0.5ml与等体积的完全福氏佐剂混合，充分乳化后经翅膀下静脉免 疫。首次免疫后10d，改用抗原加不完全福氏佐剂经鸡背部皮下加强免疫3次，免疫剂量为 30ygSEA/只，每次间隔10天，自首次免疫后7天起收集鸡蛋，做好标记于4°C冰箱保存。
上述步骤(3)所述的从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取、纯化特异性IgY的具体方法是 取初次免疫后60天的鸡蛋，去除蛋壳，用去离子水洗去卵黄外面的蛋清，去掉卵黄衣膜，将 卵黄与两倍体积的0.01mol/LpH7.6的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS)混合， 并充分搅拌，加聚乙二醇6 000 (PEG 6 000)至最终浓度为5%，并搅拌至PEG完全溶解， 4420xg室温离心20min，将上清液过滤，继续加PEG至其浓度为20%，充分搅拌溶解后12, OOOxg室温离心10min，去掉上清液，用1/6的原卵黄体积的PBS重新溶解沉淀，蒸馏水中4 。C透析2h，其间换水3 4次，最后置PEG中浓縮至原体积的1/10，收集浓縮后的IgY，分 装后置一20T保存备用。
实现本发明第二个任务体外检测血吸虫循环抗原的技术方案是以抗日本血吸虫可溶性 虫卵抗原的鸡卵黄抗体接触待测血清。实现本发明第三个任务的技术方案是本发明提供的检测血吸虫抗原的试剂盒包括
(1) 已用抗SEA的IgY包被的96孔酶联板两块；
(2) 冻干标准品，为非血吸虫疫区健康人血清，l瓶0.5mg，临用前以双蒸水稀释至 lml，临用前15分钟内配制；
(3) 样品稀释液，为0.01mol/lpH7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶15ml;
(4) 检测用抗体，为辣根过氧化酶标记抗SEA单克隆抗体，l瓶25ml;
(5) 洗涤液，为0.05。/。pH7.4的磷酸盐缓冲液-吐温20， 1瓶500ml;
(6) 底物溶液，为四甲基联苯胺，l瓶20ml;
(7) 终止液，为2mol/l硫酸，l瓶:20ml;
(8) 操作说明书每板均设标准孔2孔和待测样品孔，分别加稀释的标准品或待测样品 lOOpl，轻轻混匀，37°C， 120分钟，弃去液体，甩干，洗涤液洗板5次，350)al/每孔，甩干； 每孔加检测用抗体100pl， 37°C， 60分钟，洗涤液洗板5次，350pl/每孔，甩干；每孔加底物 溶液90^1， 37'C避光显色30分钟；每孔加终止溶液5(^1，终止反应。用ELISA读数仪在450nm 波长测量各孔的吸光度值，待见样品的吸光度值与标准品的吸光度值的比值大于2.1即为阳 性。操作注意事项①各试剂在使用前应平衡至室温；②每次洗涤时间不应少于1分钟；③ 试剂盒4'C保存，拆封后请尽量于12个月内使用完毕。
本发明利用血吸虫的特异性抗原皮下多点注射的方法免疫母鸡，从鸡蛋黄中提取、纯化 并鉴定特异性IgY，并结合单克隆抗体技术，建立ELISA诊断体系(IgY-ELISA)，建立了一种 新的高效、敏感和特异的，同时具有疗效考核作用的检测血吸虫循环抗原的方法。同时也为 其它众多的病原体的检测和感染性疾病的诊断开创新的技术和手段。 实验资料
1.日本血吸虫SEA的制备
本实验室传代的感染日本血吸虫的湖北钉螺(大陆株)在25。C，光照充分的情况下逸出 尾蚴，将至少20只钉螺逸出的尾蚴混合，经皮肤感染新西兰大白兔(同济医学院实验动物中 心提供，清洁级)，感染量为800条尾蚴/兔，感染45天后麻醉感染的兔，生理盐水心脏灌注， 然后剖杀并取出肝脏，分离并收集肝脏虫卵。将收集的虫卵在冰浴中反复匀浆后，4。C沉淀 48h后，10 OOOxg离心lh。吸取上清，收集分装，即为虫卵可溶性抗原(soluble egg antigens, SEA)。
SEA蛋白含量的测定采用BCA法(BCA Protein Assay Kit,美国BIPEC)。将浓度为0、 0.1mg/ml、 0.2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.6mg/ml、 0.8mg/ml、 lmg/ml的标准品20pl分别加到96孔酶标板的标准品孔中，再将样品20^il加到样品孔中,各孔加入20(^l的BCA工作液，37°C反应30min， 562nm处读取吸光度值。绘制标准曲线，计算样品的蛋白含量。BCA法测得SEA的蛋白质含量》5mg/ml。
2. 免疫及鸡蛋收集
将60y g/ml的SEA 0.5ml与等体积的完全福氏佐剂混合，充分乳化后经翅膀下静脉免疫。首次免疫后10d，改用抗原加不完全福氏佐剂经鸡背部皮下加强免疫3次，免疫剂量为30ygSEA/只，每次间隔10天。自首次免疫后7d起收集鸡蛋，做好标记于4"冰箱保存。
3. 聚乙二醇法提取和纯化IgY
取初次免疫后60天的鸡蛋，去除蛋壳，用去离子水洗去卵黄外面的蛋清。去掉卵黄衣膜，将卵黄与两倍体积的0.01mol/LpH 7.6的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS)混合，并充分搅拌。加5。/。的PEG并搅拌至PEG完全溶解。室温离心(4420xg， 20min)。将上清液过滤，继续加PEG至20。/。，充分搅拌溶解后室温离心(12， OOOxg， 10min)。去掉上清液，用1/6的原卵黄体积的PBS重新溶解沉淀。置常规处理过的透析袋中,蒸馏水中4°C透析2小时，其间换水3 4次。最后置聚乙二醇6 000 (PEG 6 000)中浓縮至原体积的1/10,收集分装后置一20。C保存备用。提纯后IgY的蛋白浓度约为6mg/ml。每只鸡蛋经盐析、透析、浓縮后可以得到61mg的IgY。
4. IgY的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)分析
非还原型SDS-PAGE检测相对分子质量(脸)及纯化程度，其浓縮胶浓度为5%，分离胶浓度为7%。还原型SDS-PSGE鉴定特异性，其浓縮胶浓度为5%，分离胶浓度为15%;每孔的上样量为7y g。 Western blotting是将SEA进行SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，用1%的脱脂奶粉4。C封闭过夜。一抗为免疫后的IgY(浓度为1:1 000)，未免疫的IgY作为对照；二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY (浓度为1:100 000)。 4一氯一1一萘酚十3%&02显色。
纯化后的完整的IgY有一条主带，其相对分子质量iWr约为130 000。还原型SDS-PAGE的结果显示裂解后的IgY共七条带，其中含有Mr为66 000和35 000的两条主带和五条次带见图2。 Western blotting结果显示,SEA可被免疫后的IgY识别结合，而与未免疫的IgY不发生反应，见图3。
5. IgY敏感性的检测
ELISA板每孔包被30y g的IgY， 10%牛血清白蛋白(BSA) 4°C封闭过夜，0.05% pH 7.4的PBS-吐温(Tween) 20 (PBST)洗涤3次；加连续稀释的SEA37°C温育lh;同上用PBST洗涤3次后加入抗SEA的IgG， 37°C温育lh后，同上法洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG (工作浓度为1:100 000) 37。C温育lh，加底物OPD显色15min，在酶标仪(Multiskan Ascent 354,芬兰Labsystems公司)上读取吸光度。双抗体夹心ELISA法测得结果表明将抗原SEA稀释到2.4ng/ml，其j值为0.4546,阴性对照的X值为0.2132， S/N
大于2.1，结果仍为阳性。
稀释度 d j1u t i on免疫C卵黄^白A值 Absorbance of immunized IgYS/N、阴忡对照 空白对照 Negative control Blank control
1: 100. 65773.080. 2132 0. 1117
1:1000.51712. 43
1:1 0000. 46072. 16
1:10 0000. 45462, 13
1:100 0000. 42481.99
6. 抗日本血吸虫SEA的单抗NP28-5B的制备及标记
4周龄BALB/C小鼠，感染8条R本血吸虫尾蚴，感染后4个月取小鼠脾细胞作为杂交瘤供体细胞。将供体细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，加入PEG4000使其融合。将细胞培养上清与日本血吸虫SEA进行ELISA，阳性孔细胞经反复亚克隆，直至所有杂交瘤细胞生长孔的培养上清均能与SEA产生阳性反应为止。此时确认单克隆抗体细胞系建立。
传代培养后收集培养细胞上清，用50%饱和硫酸铵沉淀后，溶解于0.01M, pH7.4的PBS，充分透析后放置-7(fC冰箱备用。经免疫双扩散鉴定，NP28-5B的同型为IgGl，其靶抗原分子量为140KD。采用简易过碘酸钠法，将辣根过氧化物酶(HRP, RZ^3.0)结合至NP28/5B上，经滴定确定其工作浓度。
7. IgY-夹心ELISA (Sandwich-ELISA)诊断技术7.1动物分组，感染及血清采集
20-25g雌性BALB/C小鼠40只，随机分成2组， 一组经皮感染日本血吸虫尾蚴40条/鼠(本领域常规感染方法)，另一组做正常对照，不感染血吸虫。两组小鼠饲养条件、饮食饮水等均相同。
感染45天后，2组小鼠均采集外周静脉血并分离血清，-2(fC保存备用。小鼠采血后麻醉，经肝门静脉生理盐水灌注冲虫，并做肝组织压片，镜检虫卵，以证实小鼠感染成功。冲虫后，感染组每只小鼠均可冲出成虫，肝组织压片可见大量虫卵结节，证明血吸虫感染是成 功的。未感染的对照组小鼠则既未见虫卵也未见成虫。 7.2 IgY陽sandwich-ELISA
(1 )取上述制备鉴定好的IgY30吗/ml每孔包被96孔ELISA板，4°C过夜后，用0.1% pH 7.4的PBST洗涤3次。
(2) 10%牛血清BSA200ial/孔37°C封闭lh，同上法洗3次。
G)加入1:10稀释的待检感染血吸虫的鼠血清，37。C温育2h，用PBST代替待检血清 作空白对照，同种健康未感染鼠血清作阴性对照。温育后同上法洗3次。
(4) 加入HRP标记的1:6000稀释的脂8， 37°C温育30min，同上法洗3次
(5) 底物TMB10(^l/孔37。C显色25min。
(6) 2mol/l硫酸50pl/孔终止反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度值 结果显示感染组所有感染血吸虫小鼠的血清^值与阴性对照小鼠的比值均大于2.1，平
均爿值为1.48，阴性对照组平均爿值为0.36， S/N比值达到4.0，远超出ELISA检测中阳性 与阴性比值需达到2.1的要求。本实验每份血清样本至少重复2次，稳定性好。
综上所述，本发明研究结果显示，本发明技术能够制备稳定、特异的抗日本血吸虫SEA 的IgY抗体，并提供了基于这种IgY的sandwich-ELISA诊断血吸虫感染的技术，实验室检测 感染动物的敏感性达100%。
当前血吸虫抗体诊断方法虽然R趋成熟，但关键性的问题是抗体阳性区分不了被检者是 现症感染还是既往感染，因为抗体在患者治愈3-4年，甚至更长时间后仍可存在血清中，故 而无法对药物治疗提供有价值的指导，会让一些已经治愈的血吸虫病患者无辜服药。而抗原 检测阳性则意味着患者为急性感染，因为体内有活的虫体存在，才会向血液中释放抗原物质。 目前还未报道有敏感性高的血吸虫抗原检测试剂。本发明基于IgY的sandwich ELISA技术用 IgY作为扑获抗体，单抗NP28为检测抗体，既能用I gY扑获更多抗原，从而提高敏感性， 又能用单抗提高检测的特异性，从而达到免疫学诊断中所要求的敏感与特异的高度结合和协 调。并且，IgY抗体是无创性地从鸡蛋中提取，来源丰富，得率高，均一性好，不与哺乳动 物发生交叉反应，这些都是常规用哺乳动物抗体做检测所没有的优势。
图1为IgY与IgG结构模式图2为IgY的SDS-PAGE分析，A图为非还原型SDS-PAGE分析，1处为免疫后经过提纯的 IgY， 2处为免疫后未提纯的IgY; B图为还原型SDS-PAGE分析，1处为未免疫卵黄提纯的IgY，2处为免疫后卵黄提纯的IgY;
图3为IgY的Western blotting分析，1处为与未免疫卵黄提纯的IgY反应，2处为与 免疫后卵黄提纯的IgY反应。
具体实施例方式
实施例1
日本血吸虫SEA的制备
本实验室传代的感染日本血吸虫的湖北钉螺(大陆株)在25。C，光照充分的情况下逸出 尾蚴，将至少20只钉螺逸出的尾蚴混合，经皮肤感染新西兰大白兔(同济医学院实验动物中 心提供，清洁级)，感染量为800条尾蚴/兔，感染45天后麻醉感染的兔，生理盐水心脏灌注， 然后剖杀并取出肝脏，分离并收集肝脏虫卵。将收集的虫卵在冰浴中反复匀浆后，4°(:沉淀 48h后,10 OOOxg离心lh。吸取上清，收集分装，即为虫卵可溶性抗原(soluble egg antigens, SEA)。
SEA蛋白含量的测定采用BCA法(BCA Protein Assay Kit,美国BIPEC)。将浓度为0、 0.1mg/ml、 0.2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.6mg/ml、 0.8mg/ml、 lmg/ml的标准品20|ul分别加到96 孔酶标板的标准品孔中，再将样品20Ml加到样品孔中,各孔加入200)il的BCA工作液，37°C 反应30min， 562nm处读取吸光度值。绘制标准曲线，计算样品的蛋白含量。BCA法测得SEA 的蛋白质含量^5mg/ml。
实施例2
免疫及鸡蛋收集
将60ug/ml的SEA 0.5ml与等体积的完全福氏佐剂混合，充分乳化后经翅膀下静脉免 疫。首次免疫后10d，改用抗原加不完全福氏佐剂经鸡背部皮下加强免疫3次，免疫剂量为 30ygSEA/只，每次间隔10天，自首次免疫后7d起收集鸡蛋，做好标记于4°C冰箱保存。
实施例3
聚乙二醇法提取和纯化IgY
取初次免疫后60天的鸡蛋，去除蛋壳，用去离子水洗去卵黄外面的蛋清，去掉卵黄衣膜， 将卵黄与两倍体积的0.01mol/LpH7.6的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS)混 合，并充分搅拌。加5。/。的PEG并搅拌至PEG完全溶解。室温离心(4420xg， 20min)。将上清 液过滤，继续加PEG至20。/。，充分搅拌溶解后室温离心(12， OOOxg， 10min)。去掉上清液， 用1/6的原卵黄体积的PBS重新溶解沉淀。置常规处理过的透析袋中,蒸馏水中4°C透析2小 时，其间换水3 4次。最后置聚乙二醇6 000 (PEG6 000)中浓縮至原体积的1/10，收集分
12装后置一20。C保存备用。提纯后IgY的蛋白浓度约为6mg/ml。每只鸡蛋经盐析、透析、浓 縮后可以得到61mg的IgY。 实施例4
抗日本血吸虫SEA的单抗NP28-5B的制备及标记
4周龄BALB/C小鼠，感染8条日本血吸虫尾蚴，感染后4个月取小鼠脾细胞作为杂交 瘤供体细胞。将供体细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，加入PEG4000使其融合。将细 胞培养上清与日本血吸虫SEA进行ELISA，阳性孔细胞经反复亚克隆，直至所有杂交瘤细胞 生长孔的培养上清均能与SEA产生阳性反应为止。此时确认单克隆抗体细胞系建立。
传代培养后收集培养细胞上清，用50%饱和硫酸铵沉淀后，溶解于O.OIM， pH7.4的PBS， 充分透析后放置-70。C冰箱备用。经免疫双扩散鉴定，NP28-5B的同型为IgGl，其靶抗原分 子量为140KD。采用简易过碘酸钠法，将辣根过氧化物酶(HRP, RZ^3.0)结合至NP28/5B 上，经滴定确定其工作浓度。
权利要求
1.一种抗日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄抗体，其特征在于，它是用血吸虫的特异性抗原以注射的方法免疫母鸡后，从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取的特异性免疫球蛋白免疫球蛋白IgY。
2. 制备抗闩本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的方法，包括以下 步骤(1 )制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA;(2) 用日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA免疫母鸡，并收集鸡蛋；(3) 从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取、纯化特异性IgY。
3. 根据权利要求2所述的制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白IgY 的方法，其特征在于所述的日本血吸虫虫卵nj溶性抗原SEA的制备方法是将感染日本血吸 虫的钉螺在25。C，光照充分的情况下逸出尾呦，将至少20只钉螺逸出的尾呦混合，经皮肤 感染清洁级新西兰大白兔，感染量为800条尾蚴/兔，感染45天后麻醉感染的兔，生理盐水 心脏灌注，然后剖杀并取出肝脏，分离并收集肝脏虫卵。将收集的虫卵在冰浴中反复匀浆后， 4。C沉淀48h,10 000xg离心lh，吸取上清，收集分装，即为虫卵可溶性抗原SEA。
4. 根据权利要求2所述的制备日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白1gY 的方法，其特征在于所述的用日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA免疫母鸡的方法是将60ii g/ml的SEA0.5ml与等体积的完全福氏佐剂混合，充分乳化后经翅膀下静脉免疫。首次免疫 后10 d，改用抗原加不完全福氏佐剂经鸡背部皮下加强免疫3次，免疫剂量为30" g SEA / 只，每次间隔10d。自首次免疫后7d起收集鸡蛋，做好标记于4。C冰箱保存。
5. 根据权利要求2所述的制备闩本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA的鸡卵黄免疫球蛋白IgY 的方法，其特征在于所述的从被免疫母鸡的鸡蛋黄中提取、纯化特异性IgY的方法是取初 次免疫后60d的鸡蛋，去除蛋壳，用去离子水洗去卵黄外面的蛋清。去掉卵黄衣膜，将卵黄 与两倍体积的0.01mol/L pH 7.6的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS)混合，并 充分搅拌。加聚乙二醇6 000 (PEG 6 000)至最终浓度为5%，并搅拌至PEG完全溶解。4420xg 室温离心20min，将上清液过滤，继续加PEG至其浓度为20%,充分搅拌溶解后12， OOOxg 室温离心10min。去掉上清液，用1/6的原卵黄体积的PBS重新溶解沉淀，蒸馏水中4 °C透 析2h,其间换水3 4次。最后置PEG中浓縮至原体积的1/10，收集浓縮后的IgY，分装后 置一20。C保存备用。
6. —种体外检测血吸虫循环抗原的方法，其特征在于，以权利要求l所述的抗日本血吸 虫可溶性虫卵抗原的鸡卵黄抗体接触待测血清。
7. —种检测血吸虫抗原的试剂盒，包括(1) 已用抗SEA的IgY包被的96孔酶联板两块；(2) 以非血吸虫疫区健康人血清制备的冻干标准品1瓶0.5mg;(3) 样品稀释液0.01mol/l pH 7.4的磷酸盐缓冲液1瓶15ml;(4) 检测用抗体辣根过氧化酶标记抗SEA单克隆抗体1瓶25ml(5) 洗涤液0.05%pH7.4的磷酸盐缓冲液-吐温20 1瓶500ml(6) 底物溶液四甲基联苯胺l瓶20ml(7) 终止液2mol/l硫酸 l瓶20ml(8) 操作说明书。
全文摘要
本发明利用血吸虫的特异性抗原皮下多点注射的方法免疫母鸡，从鸡蛋黄中提取、纯化并鉴定特异性IgY，并结合单克隆抗体技术，建立ELISA诊断体系IgY-ELISA。建立了一种新型的，高效、敏感和特异的，同时具有疗效考核作用的检测血吸虫循环抗原的方法。同时也为其它众多的病原体的检测和感染性疾病的诊断开创新的技术和手段。
文档编号C07K16/18GK101643507SQ200810048728
公开日2010年2月10日 申请日期2008年8月7日 优先权日2008年8月7日
发明者刘文琪 申请人:华中科技大学