高效生产犬白细胞干扰素的方法

专利名称：高效生产犬白细胞干扰素的方法
技术领域：
本发明属于医药领域，特别涉及一种高效生产犬白细胞干扰素的方法。
技术背景犬病毒性疾病仍是当前严重制约养犬业健康发展的主要传染病。而传统 的传染病治疗方案临床上有时难以凑效，尤其针对病毒病办法不多。犬病毒 性疾病至今尚无有效的治疗药物和治疗方法。近年来曾经有人进行过用中草 药制剂预防和治疗犬病毒性疾病的试验，但治愈率较低。抗生素及磺胺类药 物基本无效。目前，犬干扰素是治疗犬病毒性疾病的有效药物。存在的问题是在犬白细胞干扰素的生产中使用常规用鸡新城疫病毒 (NDV)诱导犬白细胞产生干扰素含量较低。羧曱基茯苓多糖是一种具有新型免疫调节作用物质，能刺激人体免疫系 统的功能，诱生和促生干扰素产生，也是一种的白细胞调节素。羧曱基茯茶 多糖具有增强免疫力、抗肺瘤、抗病毒、抗》文射、保肝、催眠等广泛的药理 活性，能诱生与促诱生人血细胞产生干扰素-a (IFN-a),干扰素-r (IFN-r), 白细胞介素-2 (IL-2 ),白细胞介素-6 (IL-6)，肿瘤坏死因子-a (TNF-a),与 粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等多种细胞活性因子。羧曱基茯茶 多糖是一种新型的生物反应调节剂(BRM)。具有间接抗病毒、抗肿瘤作用。但有关利用鸡新城疫病毒F抹(NDV-F)和羧曱基茯茶多糖作复合干扰素 诱导剂高效制备干扰素的方法目前还未见报道。 '因此，提供一种干扰素含量高、制备成本低的高效生产犬白细胞干扰素 的方法，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。 发明内容本发明的目的在于克服上述技术中的不足之处，提供一种高效生产犬白 细胞干扰素的方法。为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下一种高效生产犬白细胞干扰素的方法，其特征在于具体实施步骤如下(1) 无菌采集犬血，加入IO lag/ml卡那霉素和适量抗凝剂，4.0。C水箱放 置；以2000-4000rpm离心犬血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉 淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1 x 105-1 x 107;(2) 白细胞悬液中加入少量干扰素，使其最终浓度为100-1000IU/ml，于 37°C水浴搅拌培养0.5-2小时；(3) 再加入羧曱基茯茶多糖，使其最终浓度为25-100昭/ml，于37。C水浴 搅拌培养l-2小时；(4) 然后在上述白细胞悬液中再加入适量诱生剂鸡新城疫病毒，使其最 终浓度为128-1280血凝单位/ml， 37。C摇床搅拌培养18-24小时；(5 )待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0， 4.0°C, 放置l-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得4且制犬白细"包干扰素。本发明的有益效果是犬基因工程干扰素具有制备成本高，在临床推广 中受到很到限制。本发明利用犬血制备犬白细胞干扰素的方法其具有很多 优点制备成本低，疗效好。常规用NDV-F诱导犬白细胞产生干扰素含量低，本发明在NDV-F林诱导白细胞干扰素过程中加入羧曱基茯茶多糖，显著 提高利用犬血制备犬白细胞干扰素的含量，显著降低了药物的成本。本产品 注入动物机体后，具有疗效好、安全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等 优点。
具体实施方式
以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式
详述如下 实施例1一种高效生产犬白细胞干扰素的方法，具体步骤如下 (1)白细胞制备无菌采集犬血，加入抗生素和抗凝剂，4.0。C水箱放置。以2000-4000rpm 离心犬血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度 稀释为每ml含1 xi06。白细胞的分离应在采血后48小时内进行。活细胞数应 达到90%以上。(2)诱生病毒采用新城鸡瘟病毒(NDV) F抹，血凝效价达到适宜滴度方可投产。 (3 )培养液采用细胞培养基RPMI-1640,内含5-10%犬血清和10 pg/ml卡那霉素或庆 大霉素，也可用其它适宜培养液。(4) 生产用原水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。(5) 粗制干扰素的制备工艺 (5.1 )诱生病毒的制备采用9-10日龄健康鸡胚，于每胚的尿嚢腔内接种适量NDV-F, 37。C培养 48-72小时，鸡胚发育良好，病毒达到适宜滴度后，收集尿嚢液，并做无菌试 验，检验合格后合并，抽样做效价测定，放-20。C待用；(5.2) 白细月包悬液用离心法分离血浆，吸取白细胞层，然后用步骤(3)中配置的培养液稀 释，以每ml含5xl()6为宜;(5.3) 起动与诱生白细胞悬液中加入少许白细胞干扰素，使其最终浓度为600IU/ml，于37。C 水浴搅拌培养0.5小时，再加入羧曱基茯苍多糖，使其最终浓度为100吗/ml， 于37。C水浴搅拌培养1.5小时；(5.4 )再加入1024血凝单位/ml NDV-F林进行诱生，待干扰素达到高峰值 时，收集上清，将上清经酸化和中性化后灭活病毒，即为粗制犬白细胞干扰 素；(5.5) 待干扰素'达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0, 4.0°C，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制犬白细胞干扰素；(5.6) 离心收集上清即得粗制白细胞干扰素，放-20。C保存；(5.7) 留样分别作无菌试验、余毒试验及安全;^验，并以微量法滴定干 扰素效价。通过此法制备的犬粗制干扰素共l次，2个批号，获得了高产量干扰 素，平均效价为23800 IU/ml。不加入羧曱基茯苓多糖的常规诱生组干扰素平均效价低于9450 IU/ml。干扰素效价测定采用CPE (细胞致病效应)抑制为基础的抑制微量测定 法，以每ml干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞人羊膜细胞Wish细胞 (50)免受水泡性口腔炎病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位。以国际 单位(IU)表示，并用国家标准品校正结果。实施例2一种高效生产犬白细胞干扰素的方法，具体步骤如下(1) 无菌采集犬血，加入10ng/ml青霉素、链霉素和适量抗凝剂，4.0°C 冰箱放置。以4000rpm离心犬血，收集灰黄层，用配置好的1640培养基稀释 细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1 xio7。(2) 在白细胞悬液中加入8。/。犬血清或血浆，混匀。(3) 在上述白细胞悬液中加入少许干扰素，使其最终浓度为200-300 IU/ml，于37。C水浴搅拌培养1小时。(4) 再加入羧曱基茯苍多糖，使其最终浓度为25吗/ml;于37。C水浴搅拌 培养2小时。(5 )在启动的白细胞悬液中再加入512血凝单位/ml NDV-F抹进行诱生， 37。C摇床搅拌培养12-24小时。(6)待干扰素达到高峰值时，以3000rpm离心，离心收集上清，加入盐 酸调至pH2.0， 4.0°C,》文置4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制 犬细胞干扰素。留样测定干扰素效价，通过此法制备的犬粗制干扰素共2次，4 个批号，获得了高产量干扰素，平均效价为25600IU/ml。不加入羧曱基茯茶多 糖的常规诱生组干扰素平均效价为12560 IU/ml。 实施例3一种高效生产犬白细胞干扰素的方法，具体步骤如下(1) 无菌采集犬血，加入IO (ig/ml卡那霉素和适量抗凝剂，4.0。C冰箱放 置。以々000rpm离心犬血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物， 使白细胞浓度稀释为每ml含1 xio5。(2) 白细胞悬液中加入少许干扰素，使其最终浓度为800IU/ml，于37。C水浴搅拌培养2小时。(3)再加入羧曱基茯苓多糖，使其最终浓度为50 pg/ml，于37。C水浴搅 拌培养2小时。(4 )在启动的白细胞悬液中再加入256-1280血凝单位/mlNDV-F株进行诱 生，同时在白细胞悬液中加入含5。/o犬血清或血浆的DMEM培养基，37。C摇床 搅拌培养12-24小时。(5)待干扰素达到高峰值时，以3000rpm离心，收集上清即得粗制犬白 细胞干扰素。留样测定干扰素效加，通过此法制备的犬粗制千扰素共2次，3个 批号，平均效价为278900IU/ml。不加入羧曱基茯苍多糖的常规诱生组干扰素 平均效《介为11500 IU/ml。使用该制备方法生产的干扰素含量高，显著降低了生产成本。具体方法 如下首先取犬新鲜抗凝全血，无菌留取灰黄层，使用NDV-F和羧曱基茯苓多 糖作为复合诱生剂诱导健康犬白细胞干扰素，其包括有白细胞悬液、启动干 扰素、病毒液和培养液，经原料制备~>混和—水浴搅拌、诱导培养—离心收获—灭活病毒—解冻除菌—分装—成品包装工序制成，制成的犬白细胞干扰 素。留样分别作无菌试验、余毒试验及安全检验。通过此法制备的犬粗制干 扰素共3次，4个批号，获得了高产量干扰素，平均效价大于30720IU/ml，无菌 试验、余毒试验均阴性，动物体内注射后均健康存活，无不良反应。本发明制备的犬干扰素具有治疗犬病毒性疾病等病毒病作用，同时对细 菌性疾病也有治疗作用。用于防治犬疾病。如犬细小病毒病、犬瘟热、犬传 染性肝炎等疾病。用法与用量小犬2万-10万IU/头/天，育犬3万-50万IU/ 头/天。每日注射1次， 一个疗程3次，病重用量略加。通过本发明获得了高产量干扰素，通过此法制备的犬粗制干扰素共7次， 6个批号，其中4个批号效价在24200IU/ml以上(最高达40960IU/ml);其余效 价在19480IU/ml以上。平均效价约为24230IU/ml，使用该制备方法生产的干 扰素含量高，显著降低了生产成本。留样干扰素无菌试验、余毒试验均阴性，动物体内注射后均健康存活，无 不良反应。副作用，对犬病毒性传染性疾病有良好治疗效果。本发明是一种广谱抗病毒制剂，主要治疗犬病毒性疾病，例如犬细小病毒病、犬瘟热、犬传 染性肝炎和犬轮状病毒病等。通过注射该制剂，使其与周围细胞发生反应， 诱导细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的繁殖，起到抗病毒作用。临床实验证明利用本发明研制的犬白细胞干扰素治疗犬细小病毒病、犬瘋热、犬传染 性肝炎和犬轮状病毒病等犬疾病共285头，治愈237头，治愈率达83.2%;其中 特别是治疗犬细小病毒病有效率达95.4%,治愈率高达84.6%,效果非常显著。 病毒性腹泻患犬用干^l尤素单独治疗后的痊愈率明显高于用干扰素治疗的对照 组。上述参照实施例对该高效生产犬白细胞干扰素的方法进行的详细描述， 是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此 在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
1. 一种高效生产犬白细胞干扰素的方法，其特征在于具体实施步骤如下(1)无菌采集犬血，加入10μg/ml卡那霉素和适量抗凝剂，4.0℃冰箱放置；以2000-4000rpm离心犬血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1×105-1×107；(2)白细胞悬液中加入少量干扰素，使其最终浓度为100-1000IU/ml，于37℃水浴搅拌培养0.5-2小时；(3)再加入羧甲基茯苓多糖，使其最终浓度为25-100μg/ml，于37℃水浴搅拌培养1-2小时；(4)然后在上述白细胞悬液中再加入适量诱生剂鸡新城疫病毒，使其最终浓度为128-1280血凝单位/ml，37℃摇床搅拌培养18-24小时；(5)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH 2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH 7.0，即得粗制犬白细胞干扰素。
全文摘要
本发明公开了一种高效生产犬白细胞干扰素的方法，实施步骤如下(1)无菌采集犬血，加入抗生素和抗凝剂，4.0℃冰箱放置；以2000-4000rpm离心犬血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1×10⁵-1×10⁷；(2)白细胞悬液中加入100-1000IU/ml干扰素，于37℃水浴搅拌培养2-3小时；(3)再加入羧甲基茯苓多糖，使其最终浓度为25-100μg/ml，于37℃水浴搅拌培养1-2小时；(4)在启动的白细胞悬液中再加入适量诱生剂鸡新城疫病毒，使其最终浓度为128-1280血凝单位/ml，37℃摇床搅拌培养18-24小时；(5)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH 2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制犬白细胞干扰素。该方法生产的干扰素含量高，生产成本明显降低。
文档编号C07K14/435GK101260143SQ200810052898
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者古长庆 申请人:天津生机集团股份有限公司