专利名称：一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及基于血液代用品的血红蛋白的分离纯化技术，尤其涉 及一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法。
背景技术：
输血往往是抢救生命的重要手段之一。在我国，各大城市的医院 几乎都发生过血荒， 一些手术不得不等待血液到来才能实施。血液在
低温条件下一般只能保存21天，而且存在艾滋病、肝炎等病毒的传染 和血型的匹配问题。因此，制备一种安全有效的血液代用品对输血医 学具有十分重要的意义。
血液替代品的研究迄今已有近百年的历史，其研究方向主要有两 个氟碳化合物和血红蛋白Hb制品。氟碳化合物因存在使用不便及容 易引起免疫系统功能阻断等毒副作用，阻碍了其进一步应用；血红蛋 白制品具有天然血红蛋白的氧结合特性和正常的生理代谢途径，且去 除了具有表面抗原的红细胞膜，使输血不再需要配血型，因此血红蛋 白类血液替代品比氟碳化合物更符合人体生理需要，目前已经成为国 内外的研究热点。血液代用品用于临床输血时，溶液中残留的细胞膜、 杂蛋白、热源、内毒素等都会对患者带来致命性的损害，因此以血红蛋白为基础的血液替代品都需要纯化的血红蛋白作为原料，如何获得 高质高量的纯化血红蛋白是该课题研究的关键。
目前，血红蛋白的来源主要有三个第一，过期的人血，由于人 血红蛋白来源有限，过期人血更是远远不能满足扩大化生产，还存在 人血病原体交叉污染等问题，不可能大批量制备；第二，基因重组人 血红蛋白、人血干细胞体外培养人工红细胞等基因工程技术产物，但 这些技术在投入工业化生产时，尚存在工艺复杂、产率较低及成本过 高等问题，限制了它在血液代用品中的应用；第三，来源广泛的动物 血。如有人就曾使用牛血、猪血为原料提取了血红蛋白，并取得了好 的效果。猪血红蛋白有85%的氨基酸残基与人血红蛋白同源，经X光 晶体衍射分析显示它与人血红蛋白结构极为近似，其氧亲和力调节机 制与人血红蛋白相同，且免疫原性比牛血红蛋白低，因此猪血红蛋白 是迄今为止发现的人血红蛋白最理想的替代材料。中国是世界上第一 养猪大国，猪的数量远远超过了牛，因此采用猪血作为提纯血红蛋白 的原料，对于血液代用品的研究具有特别的意义。
目前国外提纯血红蛋白的方法应用最广泛的就是离子交换层析 法，需要用到高效液相色谱仪，对仪器设备要求高，无形中增加了成 本。而国内除了用到离子交换层析、亲和层析等方法以外，还较多采 用了加温、超滤等措施。实践证明加温后杂蛋白量依然比较大，并 且加温后会让部分血红蛋白变性沉淀，而其进一步的超滤除了增加细菌病毒污染外，还提高了生产成本，由于血红蛋白分子量较大，超滤 膜很容易被堵住，超滤膜的成本也较高，这样不易扩大生产规模。另 外，众所周知，血红蛋白溶液很不稳定，即使在低温下也容易氧化和 变性。 发明内容本发明要解决的问题是提供一种从猪血中提取高纯度血红蛋白 的方法，得到的血红蛋白无基质，无热源，能够安全有效地进行进一 步修饰以制造血液代用品，而且操作简便，成本低廉。为解决上述技术问题，本发明采用的工艺步骤是(1) 将抗凝猪全血经离心去除血浆、白细胞及血小板，用生理盐水 洗涤红细胞2 4次，低速离心后得到压积红细胞；(2) 用2 8倍于压积红细胞体积的低渗溶液溶解压积红细胞，通入 惰性气体，在溶血液中加入抗氧化剂，调节溶液pH值至7.0 7.4，再加入 保护剂至终浓度为1 5%，加入抑菌药物，充分搅拌1 4小时，高速离心 10 30分钟后取上清得到粗制血红蛋白溶液；(3) 往粗制血红蛋白溶液中加入体积是粗制血红蛋白溶液1/10 1/4 的甲苯，震荡摇匀后低温条件下萃取2 6小时，取下层血红蛋白溶液；(4) 将血红蛋白溶液装入透析袋中，在加有保护剂和抑菌药物的透析 液中透析36 72小时，中间更换1 3次透析液，去除残留甲苯和小分子 物质；(5) 将透析后的血红蛋白溶液加入保护剂，冷冻真空干燥成干粉后再 溶解成高浓度、小体积的液体，上样于葡聚糖凝胶层析柱纯化，收取分子 量均一的高纯度血红蛋白；(6) 将高纯度血红蛋白经过滤除菌去热原，加入保护剂，然后冷冻 真空干燥，得到高纯度、无基质、无热源的血红蛋白干粉。以上各步骤均在2 6'C温度条件下进行。在上述步骤(2)制备粗制血红蛋白溶液的过程中，加入抗氧化 剂和通入惰性气体，对红细胞膜裂解后游离出来的血红蛋白有保护作 用，减少无载氧活性的高铁血红蛋白metHb的生成。细胞膜上有超氧 化物歧化酶S0D、过氧化氢酶Cat、谷光甘肽等还原系统，用低渗溶 液破坏了细胞膜之后，血红蛋白就失去了还原系统的保护，很容易被 氧化为metHb。膜分离过程中，血红蛋白溶液受搅拌剪切力的影响， 会产生局部升温和氧传递速度与溶氧量的增加，容易导致蛋白质变性 失活。因此，通入惰性气体可以使血红蛋白处于脱氧状态，再加入抗 氧化剂如还原型谷光甘肽GSH、半胱氨酸Cys、维生素C、亚硫酸钠等， 保护剂如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇等，使血红蛋白在破膜的过 程中不易发生氧化和变性。这样就使得延长破膜时间成为可能，从而 让血红蛋白充分释放出来。其次，高速离心去除细胞膜碎片的过程中， 离心时间对于样品纯度有影响，因此我们选用高速离心10 30分钟， 然后取上清得到粗制血红蛋白溶液。步骤(3)中，采用有机溶剂甲苯萃取血红蛋白，可以有效除去 溶液中未除干净的膜脂和其它杂蛋白。经比较多种有机溶剂萃取及加 温法纯化血红蛋白，发现用甲苯萃取的效果较好，得到的SDS-聚丙烯 酰胺电泳条带更加单一，萃取后产生的乳化层也较少，血红蛋白损失 量减小，是一种比较理想的纯化溶剂。而甲苯带来的安全隐患可以通 过延长萃取时间、透析以及后面的凝胶层析得到解决。透析时间与透 析液的保护措施是经过实验得出的，这对于残留甲苯和小分子的去除 比较重要。步骤(5)将透析后的血红蛋白冷冻之前加入适量保护剂，在一 定温度下冷冻后真空干燥，不会影响血红蛋白的活性，使产品具有疏 松、溶解度好等优点。然后溶解成高浓度、小体积液体通过葡聚糖凝 胶柱层析进一步分离纯化。葡聚糖凝胶的优点在于它在水、盐溶液、 有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，且不溶于一切溶剂，可重 复使用。它除了可用于制备性色谱过程，也可用于批量工艺，可在较 低的压力下获得较高的流速，不需要高压液相色谱仪等昂贵设备。葡 聚糖凝胶作为一种分子筛，大分子物质只能在胶粒空隙间流动，所受 胶粒的胆力小，流速快，首先被洗脱下来；小分子物质直径小于胶粒 网孔，可以在胶粒内外流动，受到的阻力大，流速慢而与前者分离开。 因此我们可以选取其中分子量均一的部分进行收集，血红蛋白的颜色 明显，且具有紫外光谱特征，很容易收集到纯度高的血红蛋白溶液。步骤(6)通过滤膜一次性除菌去热源，不再经过透析、超滤等 增加污染的步骤。最后与前述条件一样冷冻真空干燥成血红蛋白干 粉，它比血红蛋白溶液稳定得多，更有利于血红蛋白的保存和进一步 的修饰，即取即用，这样就可以把血红蛋白的纯化与修饰两个环节分 开来。本发明与传统方法相比，具有如下优点1、 保证了血红蛋白的pH值在纯化的整个过程中处于生理状态， 减少了其变性失活的几率；2、 裂解红细胞及以后的保护措施得当、简便、价廉；3、 首次采用了一定量的有机溶剂甲苯萃取血红蛋白，并在后来 纯化的同时去除了残余甲苯，达到了高效安全的目的；4、 葡聚糖凝胶可重复利用，不用高效液相等昂贵设备及复杂操 作，节约了成本；5、 不需要常规超滤，最后得到的是血红蛋白干粉，性质稳定， 易于保存，纯度达到99%以上，内毒素等其它指标检测均合格。
图1是本发明方法的工艺流程图。图2是猪血红蛋白标准品及纯化样品的SDS-PAGE电泳图谱，其 中N为标准品(2g/dL)， 1、 2、 3为纯化样品(2g/dL)。图3是猪血红蛋白标准品及纯化样品的紫外光谱图，其中A为标准品(lg/dL)， B为纯化样品(lg/dL)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明从活猪全血中提取高纯度血红蛋白，具体步骤按图l所示工艺流 程进行，整个过程在2 6'C条件下进行1、 将加入了抗凝剂如肝素的猪动脉血离心去除血浆、白细胞、血小板，用生理盐水洗涤红细胞2 4次，低速离心后得到压积红细 胞；2、 用2 8倍压积红细胞体积的低渗溶液如0.01M NaCl或低渗 PBS溶解压积红细胞，通入氮气或氩气等惰性气体，在溶血液中加入 pH值为7. 0 7. 4的维生素C至溶液pH值达到7. 0 7. 4，再加入保 护剂如葡萄糖至终浓度为1 5%,加入青霉素和链霉素等常规抑菌药 物，充分搅拌1 4小时，高速离心10 30分钟后得到粗制血红蛋白 溶液；3、 往粗制血红蛋白溶液中加入体积是粗制血红蛋白溶液1/10 1/4 的甲苯，震荡摇匀后低温条件下萃取2 6小时，取下层血红蛋白溶 液进行透析；4、 将血红蛋白溶液装入透析袋中，在加有抗氧化保护和抑菌药 物的透析液中透析36 72小时，中间更换1 3次透析液，去除残留 甲苯和小分子物质；5、 将透析后的血红蛋白溶液加入适量保护剂冷冻真空干燥成干 粉后，溶解成高浓度、小体积的液体，上样于葡聚糖凝胶层析柱纯化, 收取分子量均一的高纯度血红蛋白；6、 经0.22um滤膜过滤除菌去热原，然后冷冻干燥成高纯度无 基质无热源的血红蛋白干粉保存于2 8°C。由上述方法制备的血红蛋白主要指标检测结果如下表所示:检测项目结果血红蛋白(Hb)干粉MetHb生成量〈1%血红蛋白(Hb)纯度〉99%血红蛋白得率〉80%PH值7. 0 7. 4紫外特征吸收光谱正常内毒素合格细菌合格热原阴性猪血红蛋白标准品及本发明纯化样品的SDS-PAGE电泳图谱对比 如图2所示，可以看出，本发明分离纯化的猪血红蛋白电泳谱带优于标准品，无大分子杂带，分子量一致。猪血红蛋白标准品及本发明纯化样品的紫外光谱图对比如图3所示，可以看出，本发明分离纯化的猪血红蛋白紫外最高吸收峰在410nm,与标准品一致，且样品血红蛋白在540nm和580nm处各有一 个小峰，而标准品没有，这说明本发明纯化的血红蛋白样品正确，其 氧合特性还优于标准品，适合作为血液代用品的原料。
权利要求
1. 一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤，各步骤均在2～6℃温度条件下进行(1)将抗凝猪全血经离心去除血浆、白细胞及血小板，用生理盐水洗涤红细胞2～4次，低速离心后得到压积红细胞；(2)用2～8倍于压积红细胞体积的低渗溶液溶解压积红细胞，通入惰性气体，在溶血液中加入抗氧化剂，调节溶液pH值至7.0～7.4，再加入保护剂至终浓度为1～5％，加入抑菌药物，充分搅拌1～4小时，高速离心10～30分钟后取上清得到粗制血红蛋白溶液；(3)往粗制血红蛋白溶液中加入体积是粗制血红蛋白溶液1/10～1/4的甲苯，震荡摇匀后低温条件下萃取2～6小时，取下层血红蛋白溶液；(4)将血红蛋白溶液装入透析袋中，在加有保护剂和抑菌药物的透析液中透析36～72小时，中间更换1～3次透析液，去除残留甲苯和小分子物质；(5)将透析后的血红蛋白溶液加入保护剂，冷冻真空干燥成干粉后再溶解成高浓度、小体积的液体，上样于葡聚糖凝胶层析柱纯化，收取分子量均一的高纯度血红蛋白；(6)将高纯度血红蛋白经过滤除菌去热原，加入保护剂，然后冷冻真空干燥，得到高纯度、无基质、无热源的血红蛋白干粉。
2、 根据权利要求1所述的一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法，其特征在于步骤(1)中所取猪全血为活猪动脉血，生理盐水是浓度为0. 9Q/。的NaCl溶液。
3、 根据权利要求1所述的一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方 法，其特征在于步骤(2)中所述低渗溶液为0.01mol/L的NaCl溶液或 低渗PBS溶液，所述惰性气体为氮气或氩气。
4、 根据权利要求1所述的一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方 法，其特征在于步骤(2)中所述抗氧化剂是pH值为7.0 7.4的维生素 C，步骤(2)和步骤(4)中所述的抑菌药物是100U/ml的青霉素或/和 链霉素。
5、 根据权利要求1所述的一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方 法，其特征在于步骤(2)中所述的保护剂是葡萄糖。
6、 根据权利要求1所述的一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方 法，其特征在于步骤(5)和步骤(6)中所述的保护剂是蔗糖。
全文摘要
一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法，在2～6℃条件下依次进行如下操作首先用抗凝猪全血制备得压积红细胞；用低渗溶液溶解压积红细胞并通入惰性气体，加入抗氧化剂并调节溶液pH值，加入保护剂和抑菌药物，高速离心后得粗制血红蛋白溶液；往粗制血红蛋白溶液中加入甲苯，低温下萃取后取下层血红蛋白溶液进行透析；透析后的血红蛋白溶液冷冻干燥后再溶解成高浓度小体积的液体并上样于葡聚糖凝胶层析柱纯化，收取分子量均一的高纯度血红蛋白经过滤除菌去热原，然后冷冻真空干燥，得高纯度无基质无热源的血红蛋白干粉。用本发明方法得到的血红蛋白无基质无热源，能安全有效地进行进一步修饰以制造血液代用品，操作简便，成本低廉。
文档编号C07K1/34GK101289493SQ20081006957
公开日2008年10月22日 申请日期2008年4月22日 优先权日2008年4月22日
发明者刘建仓, 刘良明, 涛 李, 李东红, 婷 胥 申请人:中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所