专利名称：异源表达和纯化人类葡萄糖转运蛋白家族成员glut1、glut2、glut3的方法
技术领域：
本发明涉及一种表达和纯化蛋白的方法，尤其涉及一种异源表达和纯化人 细胞膜上葡萄糖转运蛋白家族成员GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 (facilitated glucose transporter,GLUTs)的方法。
背景技术：
位于人类细胞膜上的葡葡糖转运载体(facilitated glucose transporter ， GLUTs)
是体内一类重要的膜蛋白，它们促进体内葡葡糖的跨膜转运，对稳定细胞能量 和维持生命活动起到至关重要作用。到目前为止已相继发现并鉴定了多种 GLUTs ，它们分别由不同基因编码，具有相似的蛋白质结构和生物功能，在基 因表达和细胞内分布受多种因素调控。人类GLUTs由429-524个氨基酸组成， 不同GLUT有39%-65%的氨基酸组成相同，相似性为50%-76%。 GLUTs除转 运葡萄糖外，还可转运去氢抗坏血酸、D-甘露醇、D-半乳糖和D-果糖等。
GLUTl 、 GLUT 2、 GLUT3结构相似，都具有12个螺旋跨膜区(M1 M12);
其氨基和羧基末端均位于细胞质一侧；在载体蛋白的胞外侧都存在1个蛋白质 糖基化位点，其中GLUT1、 2在胞外M1与M2间的外环上存在QLS模体，而 GLUT3分子的第7跨膜螺旋内存在QLS模体，该模体与底物特异性结合有关。
GLUT1分布最广，高效表达于人类红细胞、脑、目艮、周围神经及胎盘等组 织中。GLUT3则主要分布于神经组织，以脑组织中分布最多。GLUT1、 GLUT3 的主要作用是参与基础或组成性的葡萄糖转运，优先保证仅以葡萄糖为能量来 源的组织器官正常功能活动。相同组织中GLUT1、 GLUT3分布不同，其作用 也有区别。例如脑中GLUT1主要分布于血-脑屏障的毛细血管内皮细胞，其功能是将血液循环中的葡萄糖转运进入组织；GLUT3则高效表达于神经元并集中 于神经元突起，其功能是为树突和轴突的递质传导提供能量。
GLUT2是在(3细胞和一些葡萄糖浓度高的组织(如肠、肝脏、肾脏)中表达 的葡萄糖转运蛋白。GLUT2有很高的转运能力，对葡萄糖的转运特点和它所处 的周围葡萄糖的浓度相适应，伴随血糖浓度升高对葡萄糖转运能力也随之升高。 GLUT2在肝脏调节肝细胞葡萄糖的双向转运，在小肠和肾主要分布于可吸收上 皮细胞的基底膜或嗜碱性侧膜，将上皮细胞内葡萄糖通过基底膜转运进入血液 循环，参与葡萄糖的吸收和再吸收。
不同的易化葡萄糖载体对葡萄糖具有不同的亲和力和Km值，GLUT3对葡 萄糖的亲和力最高(具有两个QLS模体，分别位于第277 279和281 2S3)， Km值为1 2 mmo1/ L，这样有利于在血糖浓度较低时，将葡萄糖转运通过血 脑屏障；而GLUT2对葡萄糖的亲和力最低(无QLS模体)，Km值为11 16 mmo1/ L ,这样又有利于肝脏、胰(3细胞等在血糖浓度较高时对葡萄糖的应答 反应和葡萄糖的跨膜转运；GLUT1对葡萄糖的亲和力介于GLUT3和GLUT2 之间，Km值在2 5mmo1/ L 。
GLUTs功能状态是细胞摄取葡萄糖，调节糖代谢的关键，与许多代谢性疾 病(如糖尿病等)关系密切。因此对GLUTs在结构和功能、活性调节及其抑制 剂、GLUTs作为药物靶标，抗体生产等方面的研究在帮助我们进一步了解疾病 的发病机制及探索新的治疗途径上都有重要的作用，而这些，都需要GLUTs在 体外的高效表达。
但和绝大部分膜蛋白一样，GLUTs的结构特性决定了其在表达，分离，纯 化上存在诸多困难。主要原因在于(l)天然膜蛋白含量低，绝大多数低于微克 数量级；(2)膜蛋白难于体外表达，迄今未见膜蛋白高效表达体系的报道；(3)膜 蛋白不稳定，分离、纯化比较困难。因此，目前制约膜蛋白结构生物学及功能 研究、药物开发及膜蛋白抗体生产的主要因素是膜蛋白的高效表达及分离。所 以，建立一套全新的可以稳定、重复、高效表达和纯化各种膜蛋白的体系，表 达和纯化毫克数量级以上的膜蛋白具有非常重要的意义。
基于膜蛋白GLUTs的重要性，为了获得毫克数量级以上GLUTs，研究其高效表达和纯化的关键技术是该领域的技术发展趋势。建立一套全新的、稳定的、 重复性好的高效表达和纯化膜蛋白GLUTS的体系，表达和纯化毫克数量级以上
的GLUTs具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异源表达和纯化人类葡萄糖转运蛋白家族成员 GLUT1、 GLUT2、 GLUT3的方法，建立适合于膜蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 的表达和纯化体系，用于初步表达和纯化人类葡萄糖转运蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3蛋白，解决了膜蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3结构和功能研究、药物 开发和抗体生产中的一个关键制约因素。
该方法主要包括以下步骤
(1) 构建诱导型GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3 (谷胱甘肽-S-转移 酶-GLUTs)融合蛋白表达载体；
(2) 所述GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白表达载体转化 裂殖酵母，得到裂殖酵母转化子；
(3) 筛选和鉴定裂殖酵母转化子；
(4) GST-GLUT1 、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白在裂殖酵母中的诱导 表达；
(5) 分离和纯化GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白；
(6) 检测分离纯化的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白；
(7) 鉴定分离纯化的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白；
(8) 分别从GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白中分离和纯 化得到人类GLUT1、 GLUT2、 GLUT3蛋白。
本发明的优选实施例中，在所述步骤(l)中，采用包含大肠杆菌复制起始序 列Co正l，裂殖酵母自主复制序列arsl，裂殖酵母启动子P咖u的质粒pESP-2， 及采用人类GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 cDNA序列全长分别构建所述的诱导型 GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白表达载体。本发明的优选实施例中，所述步骤(2)中，采用醋酸锂化学转化法，将所述
的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白表达载体转化裂殖酵母细 胞。
本发明的优选实施例中，所述步骤(3)中，采用亮氨酸营养缺陷型或PCR扩 增法筛选鉴定所述的裂殖酵母转化子。
本发明的优选实施例中，所述步骤(4)中包括分别采用含有硫胺素的培养基 YES、不含硫胺素的基本培养基EMM培养转化酵母细胞。根据启动子P^u表 达活性受培养基中硫胺素含量严格调控的特点，首先采用含有硫胺素的YES培 养基，抑制外源蛋白的表达的同时使裂殖酵母转化菌快速、大量生长，然后收 集和充分洗涤酵母细胞去除YES丰富培养基中所含的硫胺素，采用不含硫胺素 的基本培养基EMM培养所述的酵母细胞，从而诱导融合蛋白GST-GLUTs的异 源表达。
本发明的优选实施例中，所述的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3
融合蛋白在裂殖酵母中诱导表达的条件为在所述的YES培养基上扩大培养到 OD600二1.0，在所述的EMM培养基上继续诱导培养15-20小时。
本发明的优选实施例中，所述步骤(5)中，采用超高速离心和亲和层析的方 法分离和纯化GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白，即破碎酵母 细胞后，采用离心沉淀法首先去除细胞碎片，然后通过超高速离心机进行离心， 使酵母细胞的细胞膜及其上的膜蛋白一同沉淀，从而使膜蛋白与其它水溶性蛋 白质分开。
本发明的优选实施例中，所述的亲和层析的方法是谷胱苷肽-S-转移酶标签 亲和层析方法。即用含去垢剂的缓冲液从细胞膜中将膜蛋白溶解出来，然后分 别用GST亲和树脂结合异源表达的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3， 经过多次洗涤GST亲和树脂去除其它可能附着的酵母细胞膜蛋白，使酵母中异 源表达的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3得到纯化。最后用还原型谷 胱甘肽溶液将纯化的异源GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3从GST亲和 树脂上洗脱下来。
本发明的优选实施例中，所述步骤(6)中，采用SDS-PAGE电泳检测分离纯化的GST-GLUT 1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白。
本发明的优选实施例中，所述步骤(7)中，采用蛋白质印迹鉴定分离纯化的 GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白。
本发明的优选实施例中，所述步骤(8)中包括采用凝血蛋白酶分别切割 GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白。
本发明的优选实施例中，所述步骤(8)中还包括利用谷胱苷肽琼脂糖吸附 GST及未裂解的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白纯化外源蛋 白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3。
根据本发明的方法，异源表达的人类GLUT1、 GLUT2、 GLUT3蛋白产量 为2mg/L。
本发明的优点是构建了人类膜蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3融合表达 载体，通过裂殖酵母表达体系，使难于从人体内大量分离纯化，并且难于通过 体外异源表达纯化的人类膜蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3，首次在体外大量表 达并获得纯化。裂殖酵母表达系统(Sc似z仍tfcc/^/WMj;ce;s;7cwi6e)是真核表达系 统，与哺乳动物细胞表达系统相似，具有细胞周期的调节，转录，染色体组成 和RNA剪接，糖基化，磷酸化和乙酰化作用等功能。近年来的研究表明，相对 于酿酒酵母系统，它的糖蛋白折叠机制也更接近于哺乳动物细胞。因此，裂殖 酵母表达系统能更好的表达真核蛋白，并保持这些蛋白的天然构象和功能。以 往用该系统己经成功表达的真核蛋白也已证实具有正确的构象和功能。本发明 采用该表达系统成功的表达了人类膜蛋白GLUT1,GLUT2,GLUT3，提示它也可 能成为一个高效真核膜蛋白表达体系，为膜蛋白的结构和功能研究奠定基础。 本发明表达的人类膜蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3对于研究其晶体结构，活 性调节及其抑制剂、高通量的药物筛选及抗体生产等方面都有重要作用，在帮 助我们进一步了解疾病的发病机制及探索新的治疗途径上都有重大意义。
为让本发明的所述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳 实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图1A,1B,1C分别为诱导型GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合
蛋白表达载体的构建；
图2为裂殖酵母转化子的PCR扩增电泳图3为GST层析纯化GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3的SDS-PAGE
电泳图4为分离纯化GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3的蛋白质印迹图； 图5为本发明的步骤示意图。
具体实施方式
材料
1. TaqDNA聚合酶、PrimeSTARHS DNA聚合酶(Takara公司产品，
中国大连)
2. pMD18-T载体克隆试剂盒(Takara公司产品，中国大连)
3. T4DNA连接酶(Takara公司产品，中国大连)
4. 去磷酸化酶CIAP，限制性内切酶&m/H (Takara公司产品，中国大连)
5. DL2000plus(北京全世公司产品，中国北京)
6. Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas公司产品，前苏联 立陶宛)
7. Rediprime II DNA Labelling system探针标记试剂盒及Hybond N尼龙膜 (Phamarcia公司产品；瑞典)
8. DNA产物纯化试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天为 时代公司产品，中国北京)
9. 凝血酶Thrombin(Sigma公司产品，美国)
10. GSTrapFF柱(GE公司产品，美国)
11. 裂殖酵母菌SP-Q01 (Invitrogen公司产品，美国)
12. 质粒载体pESP-2 (Invitrogen公司产品，美国)
13. 大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara公司产品，中国大连) 注-以下所涉及的试剂均为市售产品。
14. LB培养基 酵母提取物 5g 胰蛋白胨 10g NaCl 10g
固体培养基加入2X(W/V)琼脂粉
溶于1000ml去离子水中，并用lmol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸 汽灭菌。
15. YPD培养基 酵母提取物 10g 蛋白胨 20g 葡萄糖 20g 固体培养基加入2X(w/v)琼脂粉
溶于1000ml去离子水中，高压蒸汽灭菌。
16. YES培养基 酵母提取物 5g
30g 225mg 225mg 225mg 225mg 225mg
腺嘌呤
L-组氨酸
L-亮氨酸
尿嘧啶
L-赖氨酸
溶于1000ml去离子水中，高压蒸汽灭菌。17. EMM培养基
邻苯二甲酸氢钾(potassium hydrogen phthalate)(14.7mM)
Na2HP04(15.5mM) NH4Cl(93.5mM)
葡萄糖(2。/。w/v) 50x盐组分
维生素组分 微量元素组分
2.2g
5g 20g 20ml lml 0.1ml
溶于lOOOml去离子水中，高压蒸汽灭菌。 其中，
50x盐组分配方(每升) MgCl2.6H20 (0.26M) CaCl2'2H20 (4.99mM)
KC1 (0.67M) Na2S04(14.1mM)
维生素组分配方(每升) 泛酸(4.20 mM) 烟酸(81.2 mM) 肌醇(55.5 mM) 生物素(40.8 pM) 微量元素组分配方(每升) 硼酸(80.9 mM) 5g MnS04(23.7 mM) 4g ZnS04-7H20(13.9mM) 4g
52.5g 0.735g 50g 2g
lg 10g
10g 10mgFeCl3-6H20(7.4 mM) 2g
钼酸铰(2.47 mM) 0.4g
KI(6.02mM) lg
CuS04.5H20(l .6 mM) 0.4g
柠檬酸(47.6 mM) 10g
实施例l 人类GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 cDNA的克隆
购买健康人外周血组织，胰岛P细胞及脑组织cDNA，分别采用高保真酶 PrimeSTARTM进行PCR扩增获得GLUT 1、 GLUT2、 GLUT3基因全长。根据 Gen bank中GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 cDNA序列设计PCR引物Gl-1和Gl-2, G2-l和G2-2， G3-l和G3-2。这六条引物的5'端分别有保护碱基和5"wH I酶切 位点，上游引物Gl-1/ G2-l/ G3-l和下游引物Gl-2/ G2-2/ G3-2分别为SEQ ID NO: 6.9,12和SEQ ID NO: 7， 10， 13。
PCR反应体系中含上游引物和下游引物各20pmol， 200,ol的dNTP， 2ul cDNA， 5xPrimeSTARTM反应缓冲液lOul,高保真的PrimeSTAR HS DNA聚 合酶2U，反应体系总体积为50ul， PCR的反应条件为98"C变性10秒，68°C 延伸1分钟30秒，循环35次。所得PCR产物经1%琼脂糖电泳检测均可见约 1500bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化后加入dATP， TaqDNA聚合酶， 10xPCR反应缓冲液，72匸反应30分钟，DNA纯化试剂盒过柱纯化PCR产物， 取适量纯化PCR产物与pMD18-T载体连接。连接产物通过CaCl2转化法转化 JM109大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素和蓝白筛选后，挑取LB平板上的白 色菌落于LB液体培养基中37t:振荡过夜，次日提取质粒DNA，用^mif I进 行酶切鉴定，对于有1500bp大小DNA片段出现的重组质粒进行测序，测序结 果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是完整的人类GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 cDNA (SEQ ID NO: 5，8，11)，重组质粒分别命名为pMD18-GLUT1、 pMD18-GLUT2、 p謡18陽GLUT3。
实施例2 GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白表达载体的构建 采用包含大肠杆菌复制起始序列ColEl (SEQIDNO: 1)、裂殖酵母自主复制序列arsl(SEQ ID NO: 2)、裂殖酵母中严格受硫胺素浓度调控的启动子Pnmtl 全长序列(SEQIDNO: 3)、 GST全长序列(SEQIDNO: 4)以及具有Thrombin 识别位点的质粒pESP-2和重组质粒PMD18-GLUT1、 PMD18-GLUT2、 PMD18-GLUT3构建诱导型GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白 表达载体。具体构建过程如下(图l-l，l-2，l-3):
分另lj用BcwH I酶切质粒PMD18-GLUT1 、 PMD18-GLUT2 、 PMD18-GLUT3，回收纯化GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 cDNA片段，同时用SawH I酶切质粒pESP-2并去磷酸化处理，将GLUT1、 GLUT2、 GLUT3cDNA片段分 别与去磷酸化的质粒pESP-2连接，连接产物通过CaC12法转化JM109大肠杆菌 感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的转化菌进行PCR筛选， PCR引物分别为Gl-l和Gl陽2， G2-l和G2-2， G3-l和G3画2， PCR的反应体系 中含上下游引物各lOpmol， 200pmo1的dNTP， 1 pl菌液，10xPCR反应缓冲液 2.5^1， TaqDNA聚合酶lU，反应总体积为25 (J。 PCR的反应条件为第一阶 段95"C预变性5分钟；第二阶段94'C变性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸1 分钟，循环35次；第三阶段72。C延伸5分钟。挑取能够PCR扩增出约1500bp 的菌落进行测序。测序结果表明阳性重组质粒中分别插入了GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 cDNA片段并且方向正确，重组质粒分别命名为pESP-GLUTl 、 pESP-GLUT2、 pESP-GLUT3。
实施例3 GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白表达载体转化裂 殖酵母
挑选3个裂殖酵母SP-Q01单菌落，接入到10 ml培养基YPD中，28°C ， 200 rpm过夜培养。取2 ml过夜培养液加入到50 ml新鲜培养基YPD， 28°C ， 200 rpm培养至OD6Q()=0.5左右(约5个小时)，用50 ml的离心管在室温下3000 rpm 离心5分钟，去除上清，收集酵母细胞沉淀，将沉淀悬浮于6 ml lxTE中，再 室温下3000 rpm离心5分钟，去除上清，最后沉淀悬浮于0.5-1.0 ml TE/LiAC(0.1MLiAC, lxTE)中，制备成酵母感受态细胞。取lOOpl酵母感受态细 胞用于表达质粒的转化。
分别取5ul含GLUTl、GLUT2、GLUT3基因的裂殖酵母表达载体质粒DNA和lOpl浓度为lOpg/pl的鲑鱼精DNA(鲑鱼精DNA先煮沸2分钟，然后在冰上 迅速冷却)，加入到上述制备的ioopi酵母感受态细胞中，充分混匀，然后加入 600^1 PEG/LiAC/TE缓冲液(8 ml 50% PEG4000，1 ml 1M LiAC, 1 ml 10xTE )，并 经过窝旋充分混匀，将混匀的酵母感受态细胞30。C， 200rpm振荡培养30~50分 钟。然后再向酵母感受态细胞中加入7(HilDMS0并轻轻颠倒充分混匀(禁止窝 旋)，将混匀后的酵母细胞放置在42'C水浴锅中水浴培养15-20分钟，再将酵母 细胞放置在冰上冷却2分钟。然后以13000rpm的转速离心5-10秒，去除上清 液，用150(^1的lxTE重悬酵母细胞沉淀，接着以13000rpm的转速离心5-10 秒，用150jxl的lxTE重悬沉淀酵母细胞，从其中取50pl酵母细胞铺EMM培养 基+25^M硫胺素的平板。用石蜡封口膜密封平板，倒置在28i:的培养箱中培养 4-5天，平板上生长出的酵母单菌落即为含GLUT1、 GLUT2、 GLUT3基因表达 载体的酵母转化子SP-GLUT1、 SP-GLUT2、 SP-GLUT3。
实施例4裂殖酵母转化子的筛选和鉴定
1) 亮氨酸营养缺陷型筛选
用GLUT1、 GLUT2、 GLUT3表达载体转化裂殖酵母感受态细胞后，将 50-100nl酵母转化产物均匀涂在含1.2M琼脂的培养基EMM+25pM硫胺素平板 上，用石蜡封口膜密封平板，于28'C培养4-5天。由于表达载体pESP-GLUTs 上含有LEU2-d基因，可以互补SP-Q01菌株中亮氨酸营养缺陷，包含有表达载 体pESP-GLUTs的裂殖酵母菌才能在EMM培养基上生长。
2) PCR扩增法鉴定裂殖酵母转化子
在平板上出现酵母转化子SP-GLUT1、 SP-GLUT2、 SP-GLUT3后，用接种 针挑选单克隆在含1.2%琼脂的培养基EMM+25pM硫胺素平板上进行划线培 养，同时利用裂殖酵母表达载体上的特异性引物YF和YR (SEQIDNO: 14和 SEQIDNO: 15)进行PCR鉴定，鉴定结果如图2所示，其中分子量标记物是 DL2000plus (分子量从大到小为5000bp， 3000bp, 2000 bp， 1000 bp， 750 bp， 500bp,250bp,100bp)，从图2中可以看出，扩增鉴定得到的片段分子量大小与预 计大小基本相同，酵母转化子中含有异源基因，证明GLUT1、 GLUT2、 GLUT3 表达载体成功转化至裂殖酵母细胞中。实施例5 GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白在裂殖酵母中诱 导表达
将经过划线培养鉴定出的转化子接种到10ml液体培养基YES中，2S。C， 200rpm振荡培养16小时。取3ml过夜培养的液体培养物接种至100ml新鲜的 液体培养基YES中，28°C， 200rpm振荡培养至OD600-1.0 (约5-7小时)，用 灭菌离心管以室温下5000rpm离心5分钟，收集酵母培养物，用100ml无菌水 重悬细胞，室温下5000rpm离心5分钟，去上清液，加入100ml无菌水再次重 悬细胞，室温下5000rpm离心5分钟，去上清液。用200ml液体培养基EMM 重悬沉淀的细胞，并将细胞悬液转移至无菌的1000ml三角瓶中，28。C，以200rpm 的转速振荡培养15-20小时。无菌水的两次洗涤，洗去了残留的YES培养基及 硫胺素，而培养基EMM中不含硫胺素，解除了硫胺素对启动子Pnmtl的阻遏 作用，使得由启动子Pnmtl驱动的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融 合蛋白获得诱导表达。
实施例6酵母异源表达的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3分离和
纯化体系的建立
本发明采用超高速离心和亲和层析的方法建立裂殖酵母异源表达的 GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3分离和纯化体系，具体如下
分别将经过诱导表达的裂殖酵母转化子SP-GLUT1、 SP-GLUT2、 SP-GLUT3 培养物以5000rpm的转速在4'C下进行离心收集，去上清液后，细胞沉淀用50ml 细胞裂解液重悬(细胞裂解液组成如下50 mM Tris-Cl， pH7.4; 5 mM EDTA; 300 mM NaCl; 0.5°/。 IGEPAL; 100 mM NaF; 1 mM EGTA; 1 mM Na3V04),将细胞悬液 转移至高压均质机(NS1001LPanda2K)的上样杯中，在1300Mpa下循环3次，进 行细胞破碎(50ml细胞悬液约破碎5分钟)，于冰上收集细胞匀衆液。4°C， 10000rpm离心20分钟，弃沉淀，取上清液，4°C， 45,000rpm超高速离心1.5小 时，使酵母细胞的细胞膜及膜上的膜蛋白一同沉淀从而使膜蛋白与其它水溶性 蛋白质分开，小心去除上清液(内含细胞中水溶性蛋白质)，收集沉淀。然后用5ml 含1% triton X-100的细胞裂解液溶解沉淀，将膜蛋白从细胞膜中溶解出来，然 后于4。C， 45,000rpm超高速离心30分钟，取上清液，用GST亲和树脂预装柱(GSTrapFF)进行亲和层析，纯化异源表达的融合蛋白(GST-GLUTs蛋白)。 GSTrap FF亲和层析过程如下
1. 将GSTrap FF柱安装到Bio-Rad的Biologic LP层析系统上；
2. 用3倍样品体积的PBS缓冲液(140 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 10 mM Na2HP04, 1.8 mM KH2P04, pH 7.3)以1.0 ml/分钟的流速进行平衡GSTrap FF柱；
3. 以0.2 ml/分钟的流速进行上样；
4. 用3倍样品体积的PBS缓冲液，以1.0 ml/分钟的流速洗涤GSTrap FF柱， 去除其它可能附着的酵母细胞膜蛋白，使在酵母中异源表达的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3蛋白得到纯化；
5. 用2倍样品体积的洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl, 10 mM还原型谷胱甘肽, pH 8.0)以0.2 ml/分钟的流速，将纯化的异源GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3蛋白从GST亲和树脂上洗脱下来，同时收集洗脱成分；
6. 将收集到的异源表达GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3蛋白溶液 进行低温抽真空浓缩，将浓縮的膜蛋白用于SDS-PAGE检测和-8(TC低温保存。
实施例7 SDS-PAGE电泳检测分离纯化的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3蛋白
将浓缩的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3蛋白分别溶于400(il含 P/otritonX-100的PBS缓冲液中，取15pl蛋白溶液(不予煮沸加热处理)，加入 15^1的2x蛋白质上样缓冲液(3.55 ml去离子水，1.25 ml 0.5 M Tris-HCl， pH 6.8， 2.5 ml甘油，2.0 ml 10% (w/v)SDS， 0.2 ml 0.5%(w/v)溴酚蓝，0.5ml巯基乙醇)， 用12%的SDS-PAGE进行电泳，然后用考马斯亮蓝R-250染色液(50%甲醇， 10%乙酸，0.05%考马斯亮蓝R-250)进行染色。经过脱色后，融合蛋白电泳分 离结果如图3，其中分子量标记物是Unstained Protein Molecular Weight Marker (分子量从大到小为116.0kDa， 66.2 kDa， 45.0 kDa, 35.0 kDa， 25.0 kDa， 18.4 kDa， 14.4 kDa)。从图3可以看出，经过GST亲和层析纯化的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3蛋白有明显的条带，其分子量大小比理论值偏小，这 与膜蛋白的结构有关。实施例8蛋白质印迹鉴定分离纯化的GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3
蛋白
分离纯化的GST-GLUT 1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3蛋白经过SDS-PAGE 电泳后，通过电转移将PAGE胶上的蛋白质转移至尼龙膜上。尼龙膜用高浓度 蛋白质进行封闭，然后用GST抗体进行结合反应，用洗液漂洗尼龙膜，加显色 试剂进行显色。蛋白质印迹结果如图4所示。从蛋白质印迹结果可以看出，纯 化出的蛋白质分别为含GST的GLUT1、 GLUT2、 GLUT3蛋白。
实施例9 人类膜蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3分别从GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白中的分离和纯化
根据分离纯化出来的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白具 有Thrombin识别位点的特点，在已纯化的融合蛋白溶液中加入1/500 1/100 凝血蛋白酶(Thrombin),于25。C下温育1 h，切割释放出GST成分，酶切反应 液再流经GSTrap FF柱，利用柱中谷胱苷肽琼脂糖的吸附作用，吸附掉GST及 未裂解的融合蛋白，纯化出异源表达蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3。
根据本发明的方法，异源表达GLUT1、 GLUT2、 GLUT3蛋白产量为2mg/L。
本发明提供的上述在裂殖酵母中进行异源表达和纯化膜蛋白——人类葡萄 糖转运蛋白GLUTs的方法步骤示意图如图5所示，本发明的实验结果表明，通 过将GLUTs基因连接到酵母中严格受硫胺素浓度调控的启动子Pnmtl及GST 后，构建GST-GLUTs融合蛋白表达载体，将该表达载体转化到裂殖酵母感受态 细胞中后，异源融合蛋白GST-GLUTs在酵母中获得了表达。采用超高速离心和 亲和层析等方法，使在酵母中获得异源表达的GLUTs蛋白质得到了分离和纯化。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所 属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动 与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表
<110>重庆大学
〈120> —种异源表达和纯化人类葡萄糖转运蛋白的方法
〈130〉
〈160〉 9
〈170> Patentln version 3.2
〈210〉 1
〈211〉 668
〈212〉 DNA
〈213>大肠杆菌复制起始序列ColEl的核苷酸序列
〈400〉 1
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<210〉 2
〈211〉 1206
<212〉 DNA
〈213〉裂殖酵母自主复制序列arsl的核苷酸序列
〈400〉 2
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〈211〉 1174
〈212〉 ■
〈213〉裂殖酵母启动子Pnmtl的核苷酸序列
〈400〉 3
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〈210〉 4
〈211〉 651
〈212〉 DNA
〈213〉全长GST(谷胱苷肽-S-转移酶)基因cDNA的核苷酸序列
〈400〉 4
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〈210> 5
〈211> 1479
〈212〉 DNA
〈213〉人葡萄糖转运载体GLUT1基因cDNA的核苷酸序列
〈400〉 5
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<212> DNA
〈213>根据人葡萄糖转运载体GLUT1基因cDNA设计合成的上游引物序列
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32
〈210〉 7
<211〉 32
〈212> DNA
〈213>根据人葡萄糖转运载体GLUT1基因cDNA设计合成的下游引物序列
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〈213〉人葡萄糖转运载体GLUT2基因cDNA的核苷酸序列
32
〈400〉 8
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<212> DNA
〈213〉根据人葡萄糖转运载体GLUT2基因cDNA设计合成的上游引物序列
<400> 9
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<210> 10
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〈213>根据人葡萄糖转运载体GLUT2基因cDNA设计合成的下游引物序列
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〈213〉人葡萄糖转运载体GLUT3基因cDNA的核苷酸序列
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<210> 12
〈211〉 32
〈212〉 DNA
〈213>根据人葡萄糖转运载体GLUT3基因cDNA设计合成的上游引物序列
<400> 12
gcgcggatcc atggggacac agaaggtcac cc
32
〈210> 13 <211〉 32 〈212〉 腿
〈213〉根据人葡萄糖转运载体GLUT3基因cDNA设计合成的下游引物序列 〈400〉 13
gcgcggatcc ttagacattg gtggtggtct cc
32
〈210〉 14 <211〉 27 〈212〉 腿
〈213〉根据裂殖酵母表达载体多克隆位点两端的核苷酸序列设计合成的上游引物序列 〈400〉 14
gtacttgaaa tccagcaagt atatagc 27
<210〉 15 〈211〉 33 〈212〉 DNA
〈213〉根据裂殖酵母表达载体多克隆位点两端的核苷酸序列设计合成的下游引物序列 〈400〉 15
caaaatcgta atatgcagct tgaatgggct tec 3权利要求
1. 一种异源表达和纯化人类葡萄糖转运蛋白家族成员GLUT1、GLUT2、GLUT3的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)构建诱导型融合蛋白表达载体GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3；(2)所述GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3融合蛋白表达载体转化裂殖酵母，得到裂殖酵母转化子；(3)筛选和鉴定裂殖酵母转化子；(4)GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3融合蛋白在裂殖酵母中的诱导表达；(5)分离和纯化GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3融合蛋白；(6)检测分离纯化的GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3融合蛋白；(7)鉴定分离纯化的GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3融合蛋白；(8)分别从GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3融合蛋白中分离和纯化得到人类GLUT1、GLUT2、GLUT3蛋白。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(l)中，采用包含大肠 杆菌复制起始序列ColEl，裂殖酵母自主复制序列arsl，裂殖酵母启动子Pnmtl 的质粒pESP-2，及分别采用人类GLUT1、 GLUT2、 GLUT3cDNA序列全长构建 诱导型谷胱苷肽-S-转移酶(GST) -GLUTs融合蛋白表达载体。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，采用醋酸锂化 学转化法，将构建的融合蛋白表达载体转化到裂殖酵母细胞中。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，利用亮氨酸营 养缺陷型筛选、用PCR扩增法鉴定裂殖酵母转化子。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中包括先后采用含 有硫胺素的培养基YES与不含硫胺素的基本培养基EMM培养转化酵母细胞并 诱导融合蛋白GST-GLUTs的异源表达。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的诱导融合蛋白 GST-GLUTs的异源表达的条件为在YES培养基上扩大培养到OD600二1.0, 在EMM培养基上继续诱导培养15-20小时。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中采用超高速离心 和亲和层析的方法分离和纯化GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋 白，所述的亲和层析的方法是谷胱甘肽-S-转移酶标签亲和层析方法。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(6)中采用SDS-PAGE 电泳检测分离纯化的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(7)中采用蛋白质印迹 鉴定分离纯化的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白。
10. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述步骤(8)中采用凝血蛋白酶 分别切割GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白，用谷胱苷肽琼脂 糖吸附GST及未裂解的GST-GLUT1、 GST-GLUT2、 GST-GLUT3融合蛋白，纯 化外源蛋白GLUT1、 GLUT2、 GLUT3。
全文摘要
本发明公开了一种异源表达和纯化人细胞膜上葡萄糖转运蛋白家族成员GLUT1、GLUT2、GLUT3的方法，其步骤为构建诱导型融合蛋白表达载体GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3并转化裂殖酵母；鉴定裂殖酵母转化子；GST-GLUT1、GST-GLUT2、GST-GLUT3三种融合蛋白在裂殖酵母中的诱导表达；确认GLUT1、GLUT2、GLUT3基因在裂殖酵母中得到表达；分离和纯化上述三种融合蛋白；检测和鉴定分离纯化的上述三种融合蛋白；从上述三种融合蛋白中的分别分离和纯化人类GLUT1、GLUT2、GLUT3蛋白。本发明的方法可以应用于在裂殖酵母中表达高等动植物的膜蛋白，并且获得的蛋白质具有翻译后的修饰作用和生物活性。
文档编号C07K1/00GK101285066SQ20081006972
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月22日 优先权日2008年5月22日
发明者刘志昭, 杨妤欣, 翊 王, 胡宗利, 陈国平, 陈绪清 申请人:重庆大学