专利名称：番茄eil1重组蛋白的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到分子生物学和基因工程领域中的一种番茄重组蛋白质的制备及其应用。
背景技术：
植物果实是人类的重要食物来源，人们希望通过对果实成熟机理的研究，寻求提高果实 产量、品质的方法。
乙烯是五大植物激素中最简单的一种，对生长发育的许多过程，特别是果实发育、成熟有 着广泛而深远的影响。对乙烯信号通路的深入研究能使更加透彻的阐明果实的生长发育模式 和机制。EIN3/EILs蛋白家族是乙烯信号转导途径上一个重要的转录因子，该蛋白家族接受乙 烯信号而得到激活，并启动一系列调节乙烯的目标基因的表达，对乙烯反应起正调控作用。
番茄不仅是一种被广泛食用的蔬菜，同时也是一种研究果实发育成熟的重要模式植物。 Tieman于2001年从番茄克隆了 3个五/AA3-丄汰e基因丄e五/丄7、丄e五/丄2和其中Ze五/L7 基因序列与烟草r五/Z基因的同源性为79%，与拟南芥五/ V3、五/"、 和的同源性 分别为59%、 56%、 52%、和46%。长期以来对番茄基因的研究大多浅止于转录水平， 但对在植物生命活动中直接起作用的EIL1蛋白质却研究甚少。近年来现代分子生物学的研究 趋势已从基因组学转向蛋白质组学，蛋白质的功能、结构以及与其他功能因子的相互作用等 已经逐渐成为研究重点。如何获得番茄EIL1蛋白质以供研究及其他功用仍然是一项技术空 白，因此番茄EIL1重组蛋白质的制备是EIL1功能研究的重要基础，对明确其功能结构及其 调控机制具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种番茄EIL1重组蛋白质的制备方法。采用分子生物学方法克 隆得到番茄￡/丄7基因，并构建EIL1重组蛋白质表达工程菌，通过甲醇诱导培养的方式批量 获得人工表达的EIL1重组蛋白质。
通过下述方案来实现
番茄EIL1重组蛋白质的制备，包括如下步骤
(一) 番茄EIL1重组蛋白质表达工程菌的构建
采用pPIC9k为番茄五/ZJ基因的表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主细胞，构建的 番茄EIL1重组蛋白质表达工程菌，在不含组氨酸的MD培养基上筛选阳性转化子，通过G418 抗性压力筛选高表达效率的工程菌，最终筛选到能大量表达分泌型的番茄EIL1重组蛋白质的 工程菌。
(二) 重组蛋白质的诱导表达
富集培养表达工程菌后，将菌体转移到BMMY培养基中，采用0.5%的甲醇诱导表达外
源重组蛋白质。
(三) 重组蛋白质的分离纯化
将表达产物与His-bind树脂充分混匀，待重组蛋白与树脂充分结合后，采用咪唑梯度洗 脱的方式，逐步将杂蛋白洗去，最后采用高浓度咪唑溶液将目的重组蛋白质洗脱，透析过后， 经冷冻干燥最终获得番茄EIL1重组蛋白质。
本发明的再一 目的在于提供番茄EIL1重组蛋白质的应用。 制备的番茄EIL1重组蛋白质能在多个领域得到应用，例如
(一) 番茄EIN3/EILs蛋白质家族DNA结合功能域(DNA Binding Domain, DBD)及 转录活性功能域(Transcriptional Activation Domain, TAD)研究应用
人工合成DNA结合探针，与番茄EIL1重组蛋白相杂交后，经凝胶阻滞分析研番茄EIL1 蛋白质的DBD及TAD区域。
(二) 番茄EILl重组蛋白在筛选番茄乙烯应答基因上的应用
将制备的番茄EIL1重组蛋白质固定在基质上，与番茄总DNA相互杂交后，反复洗脱非 目的核酸；将EILl-核酸复合体从基质上洗脱，用蛋白酶消化EIL1重组蛋白，最终获得番茄 乙烯应答基因片段。
(三) 番茄EIL1单克隆抗体的制备方面的应用
番茄EIL1重组蛋白质能应用于番茄EIL1单克隆抗体的制备，该单克隆抗体在番茄五/ZJ 基因蛋白质表达水平的研究有极重要的作用，具体应用如下
A、 番茄EILl蛋白质作为免疫原与佐剂混合制成乳剂皮下注射BALB/c小鼠，进行免疫。
B、 番茄EIL1蛋白质作为包被原，ELISA检测免疫血清的效价。
图1为番茄EIL1重组蛋白质表达载体的结构图。
图2为工程菌诱导表达产物和分离纯化后的番茄EIL1重组蛋白质的SDS-PAGE电泳图； 其中，M:蛋白质Marker, 1:纯化的EIL1重组蛋白质，2-4:工程菌表达产物，C:对照菌 表达产物。
具体实施例方式
通过附图和实施例对本发明具体实施方式
进行说明。 实施例1番茄EIL1重组蛋白表达载体的构建
选用分泌型酵母表达载体pPIC9k作为目的基因的表达载体，该载体能表达分泌型的外源 蛋白质，有利于重组蛋白质的分离纯化。
(1) 设计上游引物PEIL^coRI : 5'-TTTGAATTCCATCATCATCATCATCATATGA TGATGTTTGAGGAAATGGGGTTCAG-3，，下游引物PEIL-iVofl: 5，-TTCGCGGCCCTAGTAC CAAATAGGAGCATC-3'，以番茄果实cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因(94°C， 3 min， 94°C， 1 min， 68°C, 2min， 35个循环，72°C， 10min)。
(2) 采用EcoRI和ATon限制性内切酶双酶切目的基因片段和pPIC9K载体，在T4连接 酶的催化下，16'C连接反应12h。
(3) 将连接产物与100;/L的大肠杆菌JM109感受态细胞混合，采用热激法将重组质粒 转化进入JM109宿主细胞，在含有Amp抗生素的LB培养基平板上筛选阳性转化子，经PCR 检测阳性克隆，并基因测序。表达载体结构图如图l所示。
实施例2番茄EIL1重组蛋白质表达工程菌的构建
(1) 重组质粒pPIC9k-EILl经I酶切后，呈线性化。
(2) 将线性化后的重组质粒与80 #1山梨醇悬浮的毕赤酵母KM71感受态细胞混匀， 转入预冷的电转化杯中，冰浴5min。
(3) 将电转化杯放于电脉冲仪的两极间电击2次，电击条件为电压1400 V，电阻 200 0，电功率25;/F，电击时间2-4ms，温度0。C。
(4) 加入lmL预冷的lmM山梨醇，混匀后以200/d每平板的量涂布于MD培养基 平板上。
(5) 28。C培养4 6d，待单菌落长出后，挑单菌落接种于lmLYPD液体培养基中，富 集培养12h，超声裂解细胞，以重组酵母的总DNA为模板，进行PCR检测阳性转化菌株。
(6) G418梯度抗性压力筛选高效表达菌株。
实施例3重组蛋白质的诱导表达
(1) 将筛选到的高效表达的酵母菌株接种于5mLYPD培养液中，28°C， 220rpm，培 养16 h。
(2) 取100/^L上述菌液，接种于lOmLBMGY培养基中，28°C， 220rpm，富集培养
24 h。
(3) 将上述菌液4。C， 3500rpm离心5min，收集菌体，弃上清，将细胞重悬于20mL BMMY培养液中，加入终浓度为0.5%的甲醇，28°C， 220rpm诱导培养。
(4) 每24h补充一次甲醇，连续诱导培养4d后，4'C， 12000 rpm离心15 min，弃 沉淀，收集表达产物，加入PMSF后保存于-2(TC备用。见图2中2、 3、 4泳道。
实施例4重组蛋白质的分离纯化
(1) 将100 mL表达产物移入规格为D50 mm，分子量为5000的透析袋内，4°C， 50 倍产物体积的无菌水透析16 h，每隔4 h换水一次。
(2) 将透析后的蛋白溶液4°C， 12000 rpm离心弃沉淀，缓慢搅拌下加入150 mL PEG6000 (50%， w/v溶于无菌水)使其终浓度达到30%。
(3) 冰上操作，继续搅拌混合溶液lh，使蛋白质完全沉淀。4'C， 10000rpm离心10 min，收集蛋白质沉淀。
(4) 冰上操作，采用2倍沉淀体积的pH7.5的Tris-HCl溶解蛋白沉淀，将蛋白质浓 縮液-2(TC保存备用。
(5) 取lmL蛋白质浓縮液，与200/zL His-bind树脂充分混匀，室温孕孵1 h，使目 的重组蛋白质充分与树脂结合。
(6) 采用漂洗缓冲液(pH7.9， 0.5MNaCl， 20mMTris-HCl， 0.2M咪唑)反复漂洗 树脂，充分洗脱杂蛋白
(7) 采用洗脱缓冲液(pH7.5， 0.5mMNaCl， 20 mMTris-HCl， 1M咪唑)洗脱目的 重组蛋白质。见图2中l泳道。
(8) 4°C，在去离子水中透析上述的纯化蛋白，时间为16h;然后冷冻干燥，最终获 得番茄EIL1重组蛋白质干粉。
实施例5番茄EILl重组蛋白质在EIN3/EILs蛋白质结构和功能研究的应用
A. 取制备的番茄EIL1重组蛋白质进行晶体衍射试验，预测EIL1蛋白的三级结构。
B. 取2^L番茄EILl重组蛋白质与l/iL标记好的核酸探针、2^L凝胶阻滞5倍结 合缓冲液、5 ^L无核酸酶的水混匀，室温反应20min后，可进行凝胶阻滞实验， 根据结果分析EIL1蛋白的的DBD和TAD结构及区域。
实施例6番茄EIL1重组蛋白质在番茄乙烯应答基因筛选中的应用
(1) 取10〃L番茄EIL1重组蛋白质与20//LHis-bind树脂充分混匀，室温孕孵30min。
(2) 往上述树脂中加入10 //L的超声破碎过的番茄总DNA和10 /iL凝胶阻滞5倍结 合缓冲液，室温反应20min，每5min混匀一次。
(3) 使用pH7.9， 0.5mMNaCl， 20 mMTris-HCl的漂洗缓冲液，反复漂洗上述树脂。
(4) 使用pH7.5， 0.5mMNaCl， 20 mM Tris-HCl的洗脱缓冲液，将蛋白陽核酸复合体 从树脂上洗脱下来。
(5) 加入等体积的苯酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)，反复抽提2次，4°C， 12000 rpm 离心10min，取上清。
(6) 加入2倍体积的预冷无水乙醇，冰上放置lh， 4'C， 12000 rpm离心10 min，弃 上清，室温放置，待乙醇完全挥发，加入20^L去离子水。
(7) 将获取的DNA片段插入Ti质粒，并进行测序分析。
实施例7重组蛋白质在番茄EIL1单克隆抗体制备方面的应用
(1) 将番茄EIL1重组蛋白质与弗氏完全佐剂等体积混匀，腹腔注射BALB/c小鼠，进 行第一次免疫，剂量50^g/只。
(2) 3周后，将EIL1重组蛋白质与弗氏不完全佐剂等体积混匀，腹腔注射以上小鼠， 进行第二次免疫，剂量50/ig/只。
(3) 再3周后，将EIL1重组蛋白质不加佐剂，腹腔注射以上老鼠，进行第三次免疫， 剂量50^g/只。
(4) 第三次免疫10天后，取小鼠尾部血清，釆用间接ELISA法，与EIL1重组蛋白质
进行免疫反应，检测抗体效价。 对实施例中的一些名词解释 JM109: —种大肠杆菌宿主菌； KM71: —种毕赤酵母宿主菌； Amp:氨苄青霉素， 一种光谱杀菌抗生素；
G418: —种氨基糖苷类抗生素，与庆大霉素和卡那霉素相似；
YPD、 MD、 BMGY、 BMMY:培养基，配方参照《分子克隆实验指南》;
PMSF:苯甲基磺酰氟，是一种蛋白酶抑制剂；
His-bind树脂能与聚组氨酸肽链特异性结合的树脂。
序列表
〈110>重庆大学
<120〉番茄EIL1重组蛋白的制备及其应用
〈130〉
<160> 4
〈170> Patentln version 3.5
〈210> 1
〈211〉 56 〈212〉腿 <213>人工序列
<220>
〈221〉 misc—feature 〈222〉 (1)..(56)
〈223〉用于番茄EIL1基因扩增的前引物PEIL-EcoR I
〈400〉 1
tttgaattcc atcatcatca tcatcatatg atgatgtttg gigga威ggg gttcag 56
〈210〉 2
<211> 30
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220>
〈221〉 misc—feature 〈222〉 (1)..(30)
<223>用于番茄EIL1基因扩增的后引物PEIL-Not I
〈400〉 2
ttcgcggccc tagtaccaaa taggagcatc 30
<210> 3
〈211〉 610
〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
<221> misc一feature
<222> (1)..(610)
<223>番茄EIL1重组蛋白质的氨基酸残基序列
〈400〉 3
Met Met Met Phe Glu Glu Met Gly Phe Cys Gly A印Leu Asp Phe Phe
15 10 15
Pro Ala Pro Leu Lys Glu Val Glu Val Ser Ala Pro Gin Ser Gin Thr
20 25 30
Glu Pro Asp Ser Val Val Asp Asp Asp Tyr Ser Asp Glu Glu Glu lie
35 40 45
Glu Val Asp Glu Leu Glu Arg Arg Met Trp Arg Asp Lys Met Lys Leu
50 55 60
Lys Arg Leu Lys Glu Met Ser Lys Ser Lys Glu Gly Val Asp Pro Ala
65 70 75 80
Lys Gin Arg Gin Ser Gin Glu Gin Ala Arg Arg Lys Lys Met Ser Arg
85 90 95
Ala Gin Asp Gly lie Leu Lys Tyr Met Leu Lys Met Met Glu Val Cys
100
Lys Ala Gin Gly 115
Val Ser Gly Ala 130
Arg Phe Asp Arg 145
His Ala lie Pro
Pro His Thr Leu 180
Ser Ala Leu Met 195
Glu Lys Gly Val 210
Trp Pro Gin Leu 225
Lys Pro His Asp
Val lie Lys His 260
Arg Gin Ser Lys 275
105 110 Phe Val Tyr Gly lie lie Pro Glu Lys Gly Lys Pro
120 125 Ser Asp Asn Leu Arg Glu Trp Trp Lys Asp Lys Val
135 140 Asn Gly Pro Ala Ala lie Ala Lys Tyr Gin Ala Asp 150 155 160
Gly Met Asn Glu Gly Ser Asn Pro Val Gly Pro Thr 165 170 175
Gin Glu Leu Gin Asp Thr Thr Leu Gly Ser Leu Leu
185 190 Gin His Cys Asp Pro Pro Gin Arg Arg Phe Pro Leu
200 205 Pro Pro Pro Trp Trp Pro Thr Gly Lys Glu Asp Trp
215 220 Gly Leu Gin Lys Asp Gin Gly Ser Leu Pro Tyr Lys 230 235 240
Leu Lys Lys Ala Trp Lys Val Gly Val Uu Thr Ala 245 250 255
Met Phe Pro Asp lie Ala Lys lie Arg Lys Leu VaJ
265 270 Cys Leu Gin Asp Lys Met Thr Ala Lys Glu Ser Ala 280 285
Thr Trp Leu Ala lie lie Ser Gin Glu Glu Ala Leu Ala Arg Glu Uu
290 295 300
Tyr Pro Asp Arg Cys Pro Pro Leu Ser Ser Ala Gly Val Ser Gly Asn
305 310 315 320
Phe Met Leu Asn Asp Ser Ser Glu Tyr Asp Val Glu Gly Ala Gin Asp
325 330 335
Glu Pro Asn Phe Asp Val His Glu Gin Lys Pro Asn His Leu Asn Leu
340 345 350Leu Asn lie Ser Ala Glu Arg Phe Lys Glu Thr Met Pro Leu Gin Gin 355
His Pro Asn Lys
Gin Ser 370
Leu Lys Arg Lys Gin 385
lie Tyr Thr Cys
Phe 360
Glu Leu Val Thr
Asp Glu Leu Val Thr Asn 375 380 Asn Glu Pro Thr Val Met
Pro 365 Leu
Ala Asn Glu Pro Thr Val Met Met 390 395 Phe Leu Gin Cys Pro His Asn Glu Leu
Asp Phe Ser Asp
Gly Phe Gin Asp 420
Ser Thr Cys Phe
Glu Phe Leu Gin Cys Pro 405 410 Arg Ser Ser Arg Asp Asn His Gin Phe
Tyr Arg Ser 435
Pro Val Val Phe Pro Gin Gin Tyr Val
Gly 440 Gin
Asp 425
Val Ser Asn Phe
Gin Lys 400 Arg His 415
Cys Leu
Ala 430
lie Asn Glu
Val Lys 450
Ala Leu Pro Val Asn Gin 465 470 Gly Val Pro Glu Asp Gly Gin Arg Met
Pro 455
Gly Pro Pro Ser
Gin 460
Phe Asp Leu Ser 475
Asn Glu Leu Met
Gin 445
Pro Lys Ser Ser
Tyr Asp Ser Asp 500
Lys Glu Gin Pro
Asp Gly Gin Arg Met lie 485 490 Val Gin Gly Ser Lys Arg Gin Asn Arg
Ala Leu Thr 515
Asn Tyr Leu Leu Ser Gin 530
Thr Asn lie Ser Thr Thr 545 550 Asp Gin Ser Lys Ala Phe
Lys 505
His Gin Gin Pro Arg 520
lie Met Asp Gly
Gly lie 480 Ser lie 495 Gly Asn lie 510
His Gin Asp
Gly 535
Gin Ser Met Leu
Val 525
lie Phe Lys Asn
Asn 540
Gin Val Asp
Pro 555
Asn Ala Gly Ser Asn Asp Asn Phe
Met Phe Gly Ser 580 lie
Ala Phe Asn Ala Gly Ser 565 570 Pro Phe Asn lie Gin Ser Thr Asn Tyr
Pro Phe 560 His Phe 575
Gly Asn
Gin Ser Thr Asn Tyr Asn 585 590 Leu Pro Ser lie Gly Tyr Asp Thr Thr Pro Lys Gin Asp Ala Pro lie
595 600 605
Trp Tyr 610
<210> 4
<211〉 13
<212> PRT <213〉人工序列
〈220>
<221> misc一feature
〈222> (8).. (13)
<223>重组蛋白N端的聚组氨酸标签，用于重组蛋白质的分离和鉴定
<400> 4
Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu His His His His His His 1 5 10
权利要求
1.一种番茄EIL1重组蛋白质的制备方法及其应用，其特征在于一种制备番茄EIL1重组蛋白的方法及重组蛋白相关的应用。
2. 权利要求l所述的重组蛋白的制备方法，包括(1) 融合基因的克隆设计引物上游引物PEIL-五coRI : 5，-TTTGAATTCCATCATCATCATCATCATATGATG ATGTTTGAGGAAATGGGGTTCAG-3 ，，下游引物PEIL-iVof 1: 5 ， -TTCGCGGCCCTAGTACC AAATAGGAGCATC-3'，以番茄cDNA为模板，PCR扩增融合基因。(2) 酵母表达工程菌的构建采用￡COR I和iVW I限制性内切酶双酶切目的基因片段和pPIC9K载体，在丁4连接酶的 催化下，16t连接反应12h。将连接产物与100//L的大肠杆菌JM109感受态细胞混合，采 用热激法将重组质粒转化进入JM109宿主细胞，在含有Amp抗生素的LB培养基平板上筛选 阳性转化子，进行PCR鉴定，并进行基因测序。重组质粒pPIC9k-EILl经S"cI酶切后，电 转化进入毕赤酵母KM71，涂布于缺乏组氨酸的MD培养基中，挑单菌落进行PCR鉴定，G418 梯度抗性压力筛选高表达菌株。(4) 重组蛋白质的诱导表达将酵母表达工程菌富集培养后，转移至BMMY培养基中，保持终浓度为0.5%的甲醇连续诱导培养4天。(5) 重组蛋白质的分离纯化使用PEG6000对表达产物进行浓縮，取1 mL蛋白质浓縮液，与200 //L His-bind树脂 充分混匀，室温孕孵lh，使目的重组蛋白质充分与树脂结合。采用漂洗缓冲液(pH7.9， 0.5 MNaCl， 20mMTris-HCl， 0.2M咪唑)反复漂洗树脂，充分洗脱杂蛋白采用洗脱缓冲液(pH 7.5， 0.5mMNaCl， 20 mM Tris-HCl， 1 M咪唑)洗脱目的蛋白质。4°C,在去离子水中透析 洗脱的重组蛋白质16h，冷冻干燥后，获得番茄EIL1重组蛋白质干粉。
3. 权利要求1所述的番茄EIL1重组蛋白的应用，例如(1) 重组蛋白质在番茄EIN3/EILs蛋白质在DBD和TAD研究领域的应用，其特征在于重 组蛋白具有完整的生物活性。(2) 重组蛋白在筛选番茄乙烯应答基因研究领域的应用，其特征在于重组蛋白具有聚组 氨酸标签，能吸附于His-Bind树脂，同时具有DNA结合活性，能与乙烯应答基因结合。(3) 重组蛋白在番茄EIL1单克隆抗体制备过程中的应用，其特征在于重组蛋白具有抗 原活性。
4.权利要求2中所制备的番茄EIL1重组蛋白，其特征在于一种带有聚组氨酸标签的番茄EIL1 重组蛋白质，是由(a)和(b)所组成的蛋白质-(a) 其氨基酸序列如SEQIDNO: 3所示；(b) 其氨基酸序列如SEQIDNO: 4所示，处于(a)肽链的N-端。
全文摘要
本发明提供了一种番茄EIL1重组蛋白质的制备方法，该方法包括表达重组蛋白的基因工程菌的构建；重组蛋白的诱导表达；重组蛋白的分离纯化。本发明还提供了上述番茄EIL1重组蛋白质的一些应用，包括番茄EIN3/EILs蛋白家族的结构、功能研究应用；番茄乙烯应答基因的筛选；番茄EIL1单克隆抗体的制备等。
文档编号C07K16/16GK101368183SQ20081006971
公开日2009年2月18日 申请日期2008年5月22日 优先权日2008年5月22日
发明者季 李, 李正国, 杨迎伍, 罗安才, 伟 邓 申请人:重庆大学