对环境胁迫具有提高的耐性和/或抗性以及增加的生物量产生的植物的制作方法

专利名称：对环境胁迫具有提高的耐性和/或抗性以及增加的生物量产生的植物的制作方法
对环境胁迫具有提高的耐性和/或抗性以及增加的生物量产生的植物本发明总地说来涉及与相应的未转化野生型植物细胞相比，对环境胁迫具有提高的耐性和/或抗性并且生物量产生增加的植物细胞，其通过在植物中增加或产生与非生物胁迫响应和非生物耐性相关的多肽的一种或多种活性。具体而言，本发明涉及适应于在水分不足条件下生长的植物。本发明还涉及制备、筛选并培养这类植物细胞 或植物的方法。在田间条件下，生长、发育、生物量积累和产量方面的植物性能依赖于对环境变化和胁迫的适应能力。如干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫和冷胁迫的非生物环境胁迫是植物生长和生产力的主要限制因子(Boyer. 1982. Science 218，443-448)。暴露于热和/或少水或干旱条件下的植物通常具有植物材料、种子、果实和其他可食用产物的低产量。由这些胁迫引起的主要作物(如稻、玉蜀黍(玉米)和小麦)的作物损失及作物产量损失表现为重要的经济和政治因素，并引起许多不发达国家的食品短缺。干旱、热、冷和盐胁迫具有对植物生长而言很重要的共同因素，即水的可用度。植物在其生命周期中通常暴露在环境水含量减少的条件下。大部分植物已进化出在少水或干燥条件下保护自身的策略。然而，如果干旱条件的强度太大、持续时间太长的话，其对植物发育、生长和大多数作物产量的影响是极大的。持续暴露于干旱引起植物代谢的较大变化。这些代谢中的巨大变化最终导致细胞死亡并因此引起产量损失。开发胁迫耐性植物和/或抗性植物是可能解决或调解至少部分这些问题的策略(McKersie 和 Leshem,1994, Stress and Stress Copingin Cultivated Plants, KluwerAcademic Publishers)。然而,开发对这些种类的胁迫表现出抗性(耐性)的新植物品系的传统植物育种策略相对缓慢，并需要特定抗性的品系与需要的品系杂交。用于胁迫耐性的有限的种质资源和关系较远的植物物种间杂交的不相容性代表常规培养中遇到的重要问题。另外，引起干旱、冷和盐耐性和/或抗性的天然细胞过程是复杂的而且涉及细胞适应的多重机制和大量代谢途径(McKersie 和 Leshem, 1994.，Stress and Stress Coping inCultivated Plants,Kluwer AcademicPublishers)。胁迫耐性和/或抗性的多成分的特性不仅使得耐性和/抗性育种很大程度上不成功，而且还限制了使用生物技术方法遗传改造胁迫耐受植物的能力。植物在其生命周期过程中还暴露于热、冷和盐胁迫中。保护策略与耐干旱的保护策略类似。由于一些土壤中的高盐含量引起细胞可吸收的水分减少，所以其影响类似于在干旱条件下所观察到的。另外，低于冰冻温度时，质外体中开始形成冰并从共质体中夺取水分而导致植物细胞损失水分(McKersie和Leshem, 1994, Stress and Stress CopinginCultivated Plants,Kluwer Academic Publishers)。这些胁迫在生理学上也相互联系，并可诱导类似的细胞损伤。例如，干旱和盐胁迫主要显示为渗透胁迫，导致细胞中内环境稳定和离子分布遭到破坏(Serrano等，1999 ；Zhu, 2001a ；ffang等,2003)。经常伴随高温、高盐或干旱胁迫的氧化胁迫可引起功能蛋白质或结构蛋白质的变性(Smirnoff, 1998)。结果，这些非生物胁迫经常激活类似的信号发放途径(Shinozaki和Ymaguchi-Shinozaki, 2000 ；Knight和Knight，2001 ；Zhu 2001b, 2002)和细胞响应，例如产生某些胁迫蛋白质、抗氧化剂和可混溶溶质(compatible solute) (Vierling 和 Kimpel, 1992 ；Zhu 等，1997 ；. Cushman和 Bohnert,2000)。目前的研究结果表明干旱耐性和/或抗性是复杂的定量特性，且目前为止没有得到真正的鉴别标记。对机制理解的缺乏使得难于设计转基因方法来提高水胁迫耐性和/或抗性。目前已知许多遗传和生物技术方法获得在低水可用度(lowwater availability)的条件下生长的植物。这些途径一般基于在植物细胞中引入并表达编码例如在W02004011888、W02006032708、 US20050097640、 US 20060037108、 US20050108791、 Serrano 等(1999;Scientia Horticulturae 78 :261-269)中公开的不同酶以及许多其他酶的基因。例如，抗氧化酶或ROS清除酶的超量表达是改变耐性的ー种可能，例如，表达Mn 超氧化物歧化酶的转基因苜蓿植物在缺水胁迫后倾向于具有减少的伤害(McKersie等，1996. Plant Physio. 111，1177-1181)。同样的转基因植物在田间试验中有增加的生物量产生(McKersie 等，1999. Plant Physiology, 119 :839-847 ；McKersie 等，1996. PlantPhysiol. 111,1177-1181)。过量产生渗压剂如甘露糖醇、果聚糖、脯氨酸或甜菜碱的转基因植物也对ー些形式的非生物胁迫表现出提高的抗性，并且认为合成的渗压剂作为ROS清除剂发挥作用(Tarczynski.等 1993Science 259, 508-510 ;Sheveleva,等 1997. PlantPhysiol. 115，1211-1219)。来自谷氧还蛋白和硫氧还蛋白家族的基因的表达赋予对环境胁迫，尤其是对盐或冷胁迫的提高耐性(EP1529112A)。这些植物比敏感性植物具有更高的种子产量、光合作用和干物质产生。对这些植物在稀疏养分耗尽(sparsly nutrient disposability)条件下的发育ー无所知。一般而言，所引用的转化的且胁迫抗性的植物由于植物发育和生理中的不平衡显示更慢的生长和减少的生物量，因此具有显著的适应性成本(Kasuga等，1999, Danby和Gehring等，2005)。尽管维持基本的代谢功能，但这也导致严重的生物量和产量损失。根/茎干重比往往随植物水胁迫发展而增长。这种增长主要是由于茎干重的相对減少。在许多环境条件下种子产量与地上干重的比例相对稳定，因此经常可在植物大小与谷粒产量之间获得强的相关性。因为大多数谷粒生物量依赖于通过植物叶和茎目前储存的光合生产力，所以这些过程内在相关联。因此甚至在发育早期阶段选择植物大小已经用作未来潜力的指示物。在一些情况下(US20060037108)，通过停止浇水6到8天进行干旱处理后观察到提
高的生物量，主要观察到更高的茎生物量。仍然需要鉴定在胁迫耐性植物中表达的基因，其具有赋予它的宿主植物和其他植物物种胁迫耐性，尤其是赋予它的宿主植物和其他植物物种对环境胁迫的提高耐性和/或抗性，优选优选在水分短缺的情况下，并赋予増加的生物量产生的能力。本发明的目的是鉴定新方法以在植物或植物细胞中赋予胁迫耐性和/或抗性。非生物胁迫现象的复杂特性使得遗传优化变得困难。然而，在几种情况下单个基因，例如转录因子或反向转运蛋白的修饰导致胁迫耐性的显著提高(Wang等，2003)。本发明的其他目的是处理植物，所述植物在水短缺下相比于相应的未转化野生型植物，抗水胁迫至少I. O天，优选I. 5天，在少水低或干燥条件下还显示出相等，优选增加的生物量产生。还需要鉴定在胁迫耐性植物中表达的基因，所述基因尤其在任何亚最适生长条件下具有赋予胁迫耐性和増加的生物量产生的能力。因此，在第一个实施方案中，本发明提供用于通过増加或产生ー种或多种活性来制备与相应的未转化野生型植物细胞相比，对环境胁迫具有提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生的转基因植物细胞的方法，所述活性选自2，3_ ニ羟基-2，3_ ニ氢丙酸苯酯脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶、酸性热休克蛋白前体、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白质、b0482-蛋白质、b0631-蛋白质、b0753_蛋白质、b0866_蛋白质、bl052-蛋白质、bll61-蛋白质、bl423-蛋白质、bl878-蛋白质、b2226-蛋白质、b2475-蛋白质、纤维ニ糖/熊果苷/水杨苷-特异性PTS酶(IIB组分/IC组分)、限制点蛋白质、CP4-57原噬菌体/RNA合酶LS、ニ氢尿嘧啶核苷合酶、DNA-结合转录ニ元调节蛋白质、D-木糖转运蛋白亚基、Y-Glu-腐胺合酶、葡糖酸转运蛋白、葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶、谷氨酰胺tRNA 合酶、谷胱甘肽依赖性氧化还原酶、甜菜碱转运蛋白亚基蛋白质、糖原合酶、GTP环化水解酶I、热休克蛋白、热休克蛋白HtpX、血红素裂解酶(CcmH亚基)、己糖醒酸(hexuronate)转运蛋白、组氨酸/赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸转运蛋白亚基蛋白质、HyaA/HyaB-加工蛋白质、内膜蛋白质、L-阿拉伯糖转运蛋白亚基、Lsm(类似于Sm)蛋白质、L-苏氨酸3-脱氢酶、甲基こニ醛合酶、多药运出系统(B亚基)、PTS的N，N' - ニこ酰基壳ニ糖-特异性酶IIA组分、NADH脱氢酶(N亚基)、中性氨基酸运出系统、烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶、鸟氨酸脱羧酶、泛酸激酶、肽酰基-脯氨酸顺反式异构酶A(旋转异构酶A)、磷酸转运蛋白、磷脂酰基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、钾转运ATP酶(B亚基)、预测的抗微生物肽转运蛋白亚基、预测的精氨酸/鸟氨酸转运蛋白、预测的水解酶、预测的激酶、预测的连接酶、预测的外膜脂蛋白、预测的氧化还原酶(黄素=NADH组分)、预测的孔蛋白、预测的PTS酶(IIB组分/IIC组分)、预测的丝氨酸转运蛋白蛋白质、预测的转运蛋白蛋白质、小(40S)核糖体亚基的蛋白质组分、脂多糖链的0抗原组分的长度调节物、核糖核酸酶活性调节蛋白质RraA、具有NarP(NarL)的两组分调节系统中的感受器组氨酸激酶(sensory histidinekinase)、钠/质子反向转运蛋白、剪接因子、苏氨酸和高丝氨酸运出系统、转录调节蛋白质、转录抑制蛋白质MetJ、ABC超家族的转运蛋白亚基/周质结合组分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特异性腺苷脱氨酶、通用应急蛋白质UP12、Yal049c-蛋白质、YCR059C-蛋白质、YEL005C-蛋白质、YER156C-蛋白质、Yfr042w-蛋白质、YGL045W-蛋白质和Y0R024w_蛋白质。在本发明ー个实施方案中，所述蛋白质具有选自以下的活性2，3_ ニ羟基-2，3_ニ氢丙酸苯酯脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶、酸性热休克蛋白前体、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白质、b0482-蛋白质、b0631-蛋白质、b0753-蛋白质、b0866-蛋白质、bl052-蛋白质、bll61-蛋白质、bl423-蛋白质、bl878-蛋白质、b2226-蛋白质、b2475-蛋白质、纤维ニ糖/熊果苷/水杨苷-特异性PTS酶(IIB组分/IC组分)、限制点蛋白质、CP4-57原噬菌体/RNA合酶LS、ニ氢尿嘧啶核苷合酶、DNA-结合转录ニ元调节蛋白质、D-木糖转运蛋白亚基、Y-Glu-腐胺合酶、葡糖酸转运蛋白、葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶、谷氨酰胺tRNA合酶、谷胱甘肽依赖性氧化还原酶、甜菜碱转运蛋白亚基蛋白质、糖原合酶、GTP环化水解酶I、热休克蛋白、热休克蛋白HtpX、血红素裂解酶(CcmH亚基)、己糖醒酸转运蛋白、组氨酸/赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸转运蛋白亚基蛋白质、HyaA/HyaB-加工蛋白质、内膜蛋白质、L-阿拉伯糖转运蛋白亚基、Lsm(类似于Sm)蛋白质、L-苏氨酸3-脱氢酶、甲基乙二醒合酶、多药运出系统(B亚基)、PTS的N，N' - 二乙酰基壳二糖-特异性酶IIA组分、NADH脱氢酶(N亚基)、中性氨基酸运出系统、烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶、鸟氨酸脱羧酶、泛酸激酶、肽酰基-脯氨酸顺反式异构酶A (旋转异构酶A)、磷酸转运蛋白、磷脂酰基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、钾转运ATP酶(B亚基)、预测的抗微生物肽转运蛋白亚基、预测的精氨酸/鸟氨酸转运蛋白、预测的水解酶、预测的激酶、预测的连接酶、预测的外膜脂蛋白、预测的氧化还原酶(黄素=NADH组分)、预测的孔蛋白、预测的PTS酶(IIB组分/IIC组分)、预测的丝氨酸转运蛋白蛋白质、预测的转运蛋白蛋白质、小(40S)核糖体亚基的蛋白质组分、脂多糖链的O抗原组分的长度调节物、核糖核酸酶活性调节蛋白质RraA、具有NarP(NarL)的两组分调节系统中的感受器组氨酸激酶、钠/质子反向转运蛋白、剪接因子、苏氨酸和高丝氨酸运出系统、转录调节蛋白质、转录抑制蛋白质MetJ、ABC超家族的转运蛋白亚基/周质结合组分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特异性腺苷脱氨酶、通用应急蛋白质UP12、Yal049c-蛋白质、 YCR059C-蛋白质、YEL005C-蛋白质、YER156C-蛋白质、Yfr042w_蛋白质、YGL045W-蛋白质和Y0R024W-蛋白质，并将表II，5和7列中所述的多肽命名为“胁迫相关蛋白质” SRP。本文使用的术语“环境胁迫”指任何亚最适生长条件，包括但不限于与干旱、冷或盐度或其组合相关的亚最适条件。在优选的实施方案中，环境胁迫是干旱和低含水量。其中干旱胁迫指任何导致植物缺水或减少植物水供应的任何环境胁迫。在本发明一个实施方案中，术语“对环境胁迫的提高耐性和/或抗性”涉及对水胁迫的提高抗性，其产生为冷和盐的次级胁迫，当然产生为干旱过程中的初级胁迫。本文使用的术语“亚最适生长条件”也指有限的养分利用度和亚最适耗尽(disposability)。在一个实施方案中，有限的养分利用度是干旱和低水含量。在一个实施方案中，有限的养分利用度是选自磷、钾和氮的养分中的亚最适耗尽。在一个实施方案中，有限的养分利用度是氮的亚最适耗尽。在一个实施方案中，本发明转基因植物的生物量通过提闻的养分利用率(NUE)得以提闻。可以通过提闻植物养分同化的总效率(例如在提闻总养分吸收和/或运输方面改善植物总的运输机制、同化途径改善等)，和/或通过提高包括，但不限于磷、钾和氮的养分物的特定养分利用率来显示植物养分利用率的改善或提高。植物养分对植物生长和发育至关重要，并因此也对植物产品的数量和质量至关重要。由于养分吸收以及养分利用的效率对植物产量和产品质量的强大影响，所以向土壤倾倒大量的肥料以优化植物生长和质量。在本发明中，例如并优选通过以下方法确定对有限养分可用度的增强耐性为了高流通量目的，在具有有限氮供应的琼脂平板上筛选植物的生物量产生(改编自Estelle和Somerville, 1987)。该筛选流水线由两个等级组成。如果与野生型植物相比生物量产生显著提高，转基因植物进行后续等级的筛选。对于每一等级，重复数量和统计严紧性增加。为了播种，在牙签的帮助下从Eppendorf管中取出在冰箱(_20°C)中储存的种子，并将其转移到上述具有有限氮供应(0.05mM KN03)的琼脂平板上。将种子播种后，平板在黑暗中4°C进行分层2-4天。分层后，试验植物在16小时光照，8小时黑暗周期中于20°C，60%的大气湿度和大约400ppm的CO2浓度中生长22到25天。所用的光源产生了与太阳层析相似的光，其具有大约IOOil EAi2S的光強度。10到11天后，所述植物个体化。在20-25天生长后，通过转基因植物的茎和根生物量产生与野生型对照植物相比，来评估在氮限制条件下的提高生长。与野生型植物相比显示生物量产生显著提高的转基因品系进行后续等级的以下实验在拟南芥(Arabidopsis thaliana)的情况下,在含养分耗竭土(nutrientdep leted soil, ^ Einheitserde Typ 0”，30% 泥土，Tantau, Wansdorf 德国)和沙I Kv v)的混合物的盆中播种种子。通过在4°C下黑暗中4天的周期诱导萌发。随后植物在标准生长条件(16小时光照和8小时黑暗的光周期，20°C，60%相对湿度，和200 ii E的光子通量密度)下生长。栽培并培养植物，尤其是每隔一天用N耗竭的养分液浇水。所述N耗竭的养分液例如含有beneath water。
权利要求
1.通过增加或产生选自以下的一种或多种活性来制备转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述转基因植物细胞、植物或其部分与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生2，3- 二羟基-2，3- 二氢丙酸苯酯脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶、酸性热休克蛋白前体、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白质、b0482-蛋白质、b0631-蛋白质、b0753-蛋白质、b0866-蛋白质、bl052-蛋白质、bll61-蛋白质、bl423-蛋白质、bl878-蛋白质、b2226-蛋白质、b2475-蛋白质、纤维二糖/熊果苷/水杨苷-特异性PTS酶(IIB组分/IC组分)、限制点蛋白质、CP4-57原噬菌体/RNA合酶LS、二氢尿嘧啶核苷合酶、DNA-结合转录二元调节蛋白质、D-木糖转运蛋白亚基、Y -Glu-腐胺合酶、葡糖酸转运蛋白、葡萄糖-I-磷酸胸苷转移酶、谷氨酰胺tRNA合酶、谷胱甘肽依赖性氧化还原酶、甜菜碱转运蛋白亚基蛋白质、糖原合酶、GTP环化水解酶I、热休克蛋白、热休克蛋白HtpX、血红素裂解酶(CcmH亚基)、己糖醒酸转运蛋白、组氨酸/赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸转运蛋白亚基蛋白质、HyaA/HyaB-加工蛋白质、内膜蛋白质、L-阿拉伯糖转运蛋白亚基、Lsm(类似于Sm)蛋白质、L-苏氨酸3-脱氢酶、甲基乙二醒合酶、多药运出系统(B亚基)、PTS的N，N' - 二乙酰基壳二糖-特异性酶IIA组分、NADH脱氢酶(N亚基)、中性氨基酸运出系统、烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶、鸟氨酸脱羧酶、泛酸激酶、肽酰基-脯氨酸顺反式异构酶A(旋转异构酶A)、磷酸转运蛋白、磷脂酰基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、钾转运ATP酶(B亚基)、预测的抗微生物肽转运蛋白亚基、预测的精氨酸/鸟氨酸转运蛋白、预测的水解酶、预测的激酶、预测的连接酶、预测的外膜脂蛋白、预测的氧化还原酶(黄素=NADH组分)、预测的孔蛋白、预测的PTS酶(IIB组分/IIC组分)、预测的丝氨酸转运蛋白蛋白质、预测的转运蛋白蛋白质、小(40S)核糖体亚基的蛋白质组分、脂多糖链的O抗原组分的长度调节物、核糖核酸酶活性调节蛋白质RraA、具有NarP(NarL)的两组分调节系统中的感受器组氨酸激酶、钠/质子反向转运蛋白、剪接因子、苏氨酸和高丝氨酸运出系统、转录调节蛋白质、转录抑制蛋白质MetJ、ABC超家族的转运蛋白亚基/周质结合组分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特异性腺苷脱氨酶、通用应急蛋白质UP12、Yal049c-蛋白质、YCR059C-蛋白质、YEL005C-蛋白质、YER156C-蛋白质、Yfr042w-蛋白质、YGL045W-蛋白质和Y0R024w-蛋白质。
2.权利要求I的方法，其中增加或产生至少一种下述多肽的活性，所述多肽包含选自以下的多肽 (i)包含表II或表IV第列5或第7列分别描述的多肽、共有序列或至少一个多肽基序的多肽；或 ( )包含表I第列5或第7列中描述的多核苷酸的核酸分子的表达产物， (iii)或(i)或(ii)的功能等价物。
3.权利要求I或2的方法，其中增加或产生至少一种下述核酸分子的表达，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子 a)编码表II第列5或第7列所示多肽的核酸分子； b)表I第列5或第7列所示的核酸分子； c)核酸分子，其作为遗传密码简并性的结果衍生自表II第列5或第7列所示的多肽序列，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生。
d)核酸分子，其与包含表I第列5或第7列所不的核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%的同一性，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生； e)编码多肽的核酸分子，所述多肽与(a)到(C)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30%的同一性，并具有包含表I第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生； f)核酸分子，其与(a)到(C)的核酸分子在严格的杂交条件下杂交，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生； g)编码多肽的核酸分子，所述多肽可在针对(a)到(e)的一个核酸分子编码的多肽而产生的单克隆或多克隆抗体的帮助下分离，并具有包含如表I第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性； h)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含如表IV第7列所示的共有序列或一个或多个多肽基序，并优选具有包含如表II或表IV第5列所不的多核苷酸的核酸分子代表的活性； h)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列所示蛋白质代表的活性，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生； i)包含多核苷酸的核酸分子，其通过使用表III第7列中的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得，并优选具有包含表II或表IV第5列所不的多核苷酸的核酸分子所代表的活性，所述引物在其5’末端不以核苷酸ATA开始； 和 j)在严格的杂交条件下，通过使用包含(a)或(b)核酸分子或其片段的互补序列的探针筛选合适的核酸文库获得的核酸分子，所述片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt,优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,并编码具有包含如表II第5列所示多肽的蛋白质所代表的活性的多肽。
4.权利要求I的方法产生的转基因植物细胞、植物或其部分，所述转基因植物细胞、植物或其部分与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生。
5.权利要求4的转基因植物细胞、植物或其部分，其来自单子叶植物。
6.权利要求4的转基因植物细胞、植物或其部分，其来自双子叶植物。
7.权利要求4的转基因植物细胞、植物或其部分，其中所述植物选自玉蜀黍、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽油菜，包括卡诺拉油菜和欧洲油菜、玉米、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、芜青、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油椰、椰子，多年生草、饲料作物和拟南芥。
8.权利要求4的转基因植物细胞、植物或其部分，其来自裸子植物，优选来自云杉、松树和冷杉。
9.权利要求5到8中任一项的转基因植物产生的种子，其中所述种子在遗传上是转基因纯合的，所述转基因赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生，产生与相应的未转化野生型植物相比对环境胁迫提高的耐性和增加的生物量产生。
10.包含选自以下的核酸分子的分离的核酸分子 a)编码表IIB第列5或第7列所示的多肽的核酸分子； b)表IB第列5或第7列所示的核酸分子； c)核酸分子，其作为遗传密码简并性的结果衍生自表II第列5或第7列所示的多肽序列，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生。
d)核酸分子，其与包含表I第列5或第7列所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30%的同一性，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生； e)编码多肽的核酸分子，所述多肽与(a)到(C)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30%的同一性，并具有包含表I第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生； f)核酸分子，其与(a)到(C)的核酸分子在严格的杂交条件下杂交，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生； g)编码多肽的核酸分子，所述多肽可在针对(a)到(e)的一个核酸分子编码的多肽而产生的单克隆或多克隆抗体的帮助下分离，并具有包含如表I第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性； h)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含如表IV第7列所示的共有序列或一个或多个多肽基序，并优选具有包含如表II或表IV第5列所不的多核苷酸的核酸分子代表的活性； h)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列所示的蛋白质代表的活性，并赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生； i)包含多核苷酸的核酸分子，其通过使用表III第7列中的引物扩增CDNA文库或基因组文库获得，并优选具有包含表II或表IV第5列所示的多核苷酸的核酸分子代表的活性，所述引物在其5’末端不以核苷酸ATA开始； 和 j)在严格杂交条件下，通过使用包含(a)或(b)核酸分子或其片段的互补序列的探针筛选合适的核酸文库获得的核酸分子，所述片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt,优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,并编码具有包含如表II第5列所示的多肽的蛋白质所代表的活性的多肽。
其中(a)到(j)的所述核酸分子在至少一个或多个核苷酸上不同于表IA的第列5或第7列中所述序列，并优选编码至少一个或多个氨基酸不同于表IIA的第列5或第7列中所述蛋白质序列的蛋白质。
11.引起权利要求10所述的核酸分子表达的核酸构建体，其包含一个或多个调节元件，由此宿主细胞中所述核酸的表达产生与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生。
12.包含权利要求10所述的核酸分子或权利要求11所述的核酸构建体的载体，其中宿主细胞中所述编码核酸的表达产生与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生。
13.宿主细胞，其已经稳定或瞬时转化了权利要求12所述的载体或权利要求10中所述的核酸分子或权利要求11所述的核酸构建体，并且因转化显示与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生。
14.用于产生多肽的方法，其中所述多肽在权利要求13所述的宿主细胞中表达。
15.权利要求14所述的方法产生的多肽或权利要求10所述的核酸分子编码的多肽，其中所述多肽在一个或多个氨基酸上不同于表II中所示的序列。
16.抗体，其特异性结合权利要求15所述的多肽。
17.植物组织、繁殖材料、收获材料或植物，其包含权利要求13所述的宿主细胞。
18.用于鉴定在植物细胞、植物或其部分，植物或其部分中赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生的化合物的方法，其包括以下步骤 a)培养植物细胞；植物或其部分，其维持下述多肽的植物表达，所述多肽由权利要求10的核酸分子编码，赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生；能够与所述多肽在合适条件下相互作用的未转化野生型植物或其部分和读出系统，所述合适条件允许所述多肽与所述读出系统在化合物或包含大量化合物的样品存在下相互作用，且所述读出系统能够提供响应化合物在下述条件下与所述多肽结合的可检测信号，所述条件允许所述读出系统和权利要求10的核酸分子编码的多肽表达，所述多肽赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生；未转化野生型植物或其部分； b)通过检测所述读出系统产生的信号的存在或缺失或增加鉴定所述化合物是否是有效的激动剂。
19.用于制备农用组合物的方法，其包括权利要求18的方法的步骤，和将在权利要求18中鉴定的化合物配制成可用于农业应用的形式的步骤。
20.组合物，其包含权利要求10的核酸分子、权利要求15的多肽、权利要求11的核酸构建体、权利要求12的载体、权利要求18的化合物、权利要求16的抗体，以及任选地农业上可接受的载体。
21.如表II，优选表IIB中所示的分离的多肽，其选自酵母，优选酿酒酵母，或大肠杆菌，优选大肠杆菌K12，和/或集胞藻属物种PCC 6803。
22.产生与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其中对环境胁迫的耐性和/或抗性和増加的生物量产生通过表达权利要求10的核酸编码的多肽而提高，所述表达导致与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生，其包括a)用权利要求12的表达载体转化植物细胞、或植物部分，和 b)从所述植物细胞或植物的部分产生转基因植物，所述转基因植物与相应的未转化野生型植物相比具有对环境胁迫提高的耐性和增加的生物量产生。
23.通过增加或产生选自以下的胁迫相关蛋白质(SRP)的一种或多种活性产生转基因植物的方法，所述转基因植物在环境胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有增加的生物量2，3- 二羟基-2，3- 二氢丙酸苯酯脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶、酸性热休克蛋白前体、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白质、b0482-蛋白质、b0631-蛋白质、b0753-蛋白质、b0866-蛋白质、bl052_蛋白质、bll61_蛋白质、bl423_蛋白质、bl878_蛋白质、b2226-蛋白质、b2475-蛋白质、纤维二糖/熊果苷/水杨苷-特异性PTS酶(IIB组分/IC组分)、限制点蛋白质、CP4-57原噬菌体/RNA合酶LS、二氢尿嘧啶核苷合酶、DNA-结合转录二元调节蛋白质、D-木糖转运蛋白亚基、Y -Glu-腐胺合酶、葡糖酸转运蛋白、葡萄糖-I-磷酸胸苷转移酶、谷氨酰胺tRNA合酶、谷胱甘肽依赖性氧化还原酶、甜菜碱转运蛋白亚基蛋白质、糖原合酶、GTP环化水解酶I、热休克蛋白、热休克蛋白HtpX、血红素裂解酶(CcmH亚基)、己糖醛酸转运蛋白、组氨酸/赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸转运蛋白亚基蛋白质、HyaA/HyaB-加工蛋白质、内膜蛋白质、L-阿拉伯糖转运蛋白亚基、Lsm(类似于Sm)蛋白质、L-苏氨酸3-脱氢酶、甲基乙二醛合酶、多药运出系统(B亚基)、PTS的N，N' -二乙酰基壳二糖-特异性酶IIA组分、NADH脱氢酶(N亚基)、中性氨基酸运出系统、烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶、鸟氨酸脱羧酶、泛酸激酶、肽酰基-脯氨酸顺反式异构酶A (旋转异构酶A)、磷酸转运蛋白、磷脂酰基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、钾转运ATP酶(B亚基)、预测的抗微生物肽转运蛋白亚基、预测的精氨酸/鸟氨酸转运蛋白、预测的水解酶、预测的激酶、预测的连接酶、预测的外膜脂蛋白、预测的氧化还原酶(黄素=NADH组分)、预测的孔蛋白、预测的PTS酶(IIB组分/IIC组分)、预测的丝氨酸转运蛋白蛋白质、预测的转运蛋白蛋白质、小(40S)核糖体亚基的蛋白质组分、脂多糖链的O抗原组分的长度调节物、核糖核酸酶活性调节蛋白质RraA、具有NarP(NarL)的两组分调节系统中的感受器组氨酸激酶、钠/质子反向转运蛋白、剪接因子、苏氨酸和高丝氨酸运出系统、转录调节蛋白质、转录抑制蛋白质MetJ、ABC超家族的转运蛋白亚基/周质结合组分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特异性腺苷脱氨酶、通用应急蛋白质UP12、Yal049c-蛋白质、YCR059C-蛋白质、YEL005C-蛋白质、YER156C-蛋白质、Yfr042w-蛋白质、YGL045W-蛋白质和Y0R024w_蛋白质。
24.权利要求22的方法，其包括 a)用权利要求12的表达载体转化植物细胞或植物的部分，并 b)从所述植物细胞或植物的部分产生转基因植物，所述转基因植物与相应的未转化野生型植物相比具有对环境胁迫提高的耐性和增加的生物量产生。
25.选自权利要求10的核酸的SRP编码核酸分子用于制备植物细胞的用途，所述植物细胞与相应的未转化野生型植物细胞、植物或植物部分相比具有对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生。
26.选自权利要求10的核酸的SRP编码核酸分子或其部分作为选择植物或植物细胞的标记的用途，所述植物或植物细胞与相应的未转化野生型植物细胞；未转化野生型植物或其部分相比具有对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和增加的生物量产生。
27.选自权利要求10的核酸的SRP编码核酸分子或其部分作为检测植物或植物细胞中胁迫的标记的用途。
28.权利要求I的转化植物细胞，其中所述环境胁迫选自盐、干旱、温度、金属、化学、病原性和氧化胁迫，或其组合。
29.权利要求I的转化植物细胞，其中所述环境胁迫是干旱和/或干燥。
30.包含编码具有选自以下的胁迫相关蛋白质(SRP)的活性的多肽的核酸分子的转基因植物细胞2，3- ニ羟基-2，3- ニ氢丙酸苯酯脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶、3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶、酸性热休克蛋白前体、天冬氨酸氨裂合酶、b0081-蛋白质、b0482-蛋白质、b0631-蛋白质、b0753-蛋白质、b0866-蛋白质、bl052_蛋白质、bll6ト蛋白质、bl423_蛋白质、bl878_蛋白质、b2226-蛋白质、b2475-蛋白质、纤维ニ糖/熊果苷/水杨苷-特异性PTS酶(IIB组分/IC组分)、限制点蛋白质、CP4-57原噬菌体/RNA合酶LS、ニ氢尿嘧啶核苷合酶、DNA-结合转录ニ元调节蛋白质、D-木糖转运蛋白亚基、Y -Glu-腐胺合酶、葡糖酸转运蛋白、葡萄糖-I-磷酸胸苷转移酶、谷氨酰胺tRNA合酶、谷胱甘肽依赖性氧化还原酶、甜菜碱转运蛋白亚基蛋白质、糖原合酶、GTP环化水解酶I、热休克蛋白、热休克蛋白HtpX、血红素裂解酶(CcmH亚基)、己糖醛酸转运蛋白、组氨酸/赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸转运蛋白亚基蛋白质、HyaA/HyaB-加工蛋白质、内膜蛋白质、L-阿拉伯糖转运蛋白亚基、Lsm(类似于Sm)蛋白质、L-苏氨酸3-脱氢酶、甲基こニ醛合酶、多药运出系统(B亚基)、PTS的N，N' - ニこ酰基壳ニ糖-特异性酶IIA组分、NADH脱氢酶(N亚基)、中性氨基酸运出系统、烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶、鸟氨酸脱羧酶、泛酸激酶、肽酰基-脯氨酸顺反式异构酶A (旋转异构酶A)、磷酸转运蛋白、磷脂酰基甘油磷酸合成酶、多磷酸激酶、钾转运ATP酶(B亚基)、预测的抗微生物肽转运蛋白亚基、预测的精氨酸/鸟氨酸转运蛋白、预测的水解酶、预测的激酶、预测的连接酶、预测的外膜脂蛋白、预测的氧化还原酶(黄素NADH组分)、预测的孔蛋白、预测的PTS酶(IIB组分/IIC组分)、预测的丝氨酸转运蛋白蛋白质、预测的转运蛋白蛋白质、小(40S)核糖体亚基的蛋白质组分、脂多糖链的O抗原组分的长度调节物、核糖核酸酶活性调节蛋白质RraA、具有NarP(NarL)的两组分调节系统中的感受器组氨酸激酶、钠/质子反向转运蛋白、剪接因子、苏氨酸和高丝氨酸运出系统、转录调节蛋白质、转录抑制蛋白质MetJ、ABC超家族的转运蛋白亚基/周质结合组分、tRNA假尿苷合酶、tRNA特异性腺苷脱氨酶、通用应急蛋白质UP12、Yal049c-蛋白质、YCR059C-蛋白质、YEL005C-蛋白质、YER156C-蛋白质、Yfr042w-蛋白质、YGL045W-蛋白质和Y0R024w_蛋白质， 其中所述多肽赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生，优选当所述多肽超量表达时赋予与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐性和/或抗性和増加的生物量产生。
31.权利要求I或29的植物，其具有 i)在下述条件下的増加的生物量产生，所述条件中的水将限制未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长， ii)在下述干旱和/或干燥条件下的増加的生物量产生，所述干旱和/或干燥条件将限制未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长，和/或 iii)在下述低湿度条件下的增加的生物量产生，所述低湿度条件将限制未转化野生型植物细胞、 植物或其部分的生长。
全文摘要
本发明总地说来涉及与相应的未转化野生型植物细胞相比，对环境胁迫具有提高的耐性和/或抗性并且生物量产生增加的植物细胞，其通过在植物中增加或产生与非生物胁迫响应和非生物耐性相关的多肽的一种或多种活性。
文档编号C07K14/195GK102770542SQ200880100182
公开日2012年11月7日 申请日期2008年5月19日 优先权日2007年5月22日
发明者O·布莱辛, O·蒂姆, P·普齐奥 申请人:巴斯夫植物科学有限公司