具有增强的耐旱性的转基因植物的制作方法

专利名称：：具有增强的耐旱性的转基因植物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有增强的耐旱性的转基因作物植物。本发明还进一步提供了嵌合基因、核酸载体以及产生具有增强的耐旱性的转基因植物的方法。
背景技术：
：植物经常面临影响它们生存的环境胁迫因子的挑战。不利的生物和非生物胁迫因子能够减少作物植物的生长和生产力。由于对生物和非生物胁迫的耐受力对植物生产力(产量和产品质量)有直接影响，赋予或增强胁迫耐受力的机制已被广泛研究，并且用于赋予环境胁迫耐受力的各种方法在本领域已有描述。但是，由于大多数研究机制基于生物或非生物胁迫间相互作用，而在自然界植物要应付和抵抗多重胁迫因子。与有利条件下的产量相比，环境胁迫因子据估计可引起作物产量上高达70%的减值(Boyer，Science218，443-448，1982)。因此，作物对环境因子变化的稳定性是育种最有价值的性状之一。但是，传统的育种被胁迫耐受力性状的复杂性、产量构成的低遗传变异和选择技术的缺乏效率所阻碍。因此，在育种中，通过标记辅助选择及通过有更高胁迫耐受力的遗传工程植物来跟踪编码胁迫耐受力构成的特异性基因可能是有用的，在作物植物的环境胁迫反应复杂性中，简单模型拟南芥的使用，提供了一个用于精密遗传分析大多数植物共有的胁迫反应途径的机会。拟南芥模型的相关性在使用拟南芥中鉴定出的基因在提高耐旱性、耐盐性和耐冻性的最近的实例(Jaglo-0ttosen等，Science280,104-106，1998;Kasuga等，Nat.Biotechnol.17,287-291,1999)中是明显的。^些基因是ERF/AP2家族的转录因子，在许多异种植物(heterologousplant)中，其调控赋予胁迫抗性的许多下游基因的表达。世界范围内植物不得不应付的最严重的非生物胁迫之一是干旱胁迫或脱水胁迫。世界上农业土地的十分之四位于干旱或半干旱区。除此之外，生长于具有相对高降水量的区域的植物在生长季节也可能遭受干旱的轮值。许多农业区，特别在发展中国家，具有一致的低降雨量，并且依赖于灌溉来维持产量。在许多地区水缺乏，并且它的价值无疑会随着全球变暖而增加，导致对在低的可利用水条件下能够维持产量水平(或甚至具有更高产量)和产量质量的耐旱作物植物的更大需求。据估计在灌溉农业中生产lkg棉花需要大约15000升水，lkg大米需要4000升。增强或设计作物植物对千旱的短或长时间轮值的耐受力和减少在灌溉农业中作物生长的水分需求显然是非常重要的目标。虽然对耐旱性的育种(如标记辅助)是可行的，并且在一定范围的作物物种(主要是谷类，如玉米、高地水稻、小麦、高粱、珍珠粟，但也有其它物种如豇豆、木豆和绿豆)中正在被追求，但这极度困难和繁瑣，这是因为耐旱性或抗早性是非常复杂的性状，该性状由许多基因座和基因-环境相互作用所决定。因此正在寻找能赋予或提高耐旱性的且可容易的转移到高产量作物变种和育成品系中单独的显性基因。大部分水由叶子通过蒸腾作用失去，许多转基因方法集中在通过改变叶子来减轻水分损失。例如WO00/73475描述了来源于玉米的C4NADP+-苹果酸酶在烟草表皮细胞和保卫细胞中的表达，根据公开内容，其通过调整气孔开度增加了植物的水分利用效率。其它方法包括，例如渗透调节剂(osmo-protectants)如植物中糖(如海藻糖生物合成酶)的表达，以便增加水分胁迫耐受力，参见如W099/46370。还有其它方法集中于改变植物的根系结构。到目前为止另一种增强耐旱性的有前途的方法是CBF/DREB基因(DREB是指脱水应答元件结合；DRE结合)的过量表达，其编码各种AP2/ERF(乙烯应答因子)转录因子(WO98/09521)。在拟南芥中CBF/DREB1蛋白的过量表达导致耐冻性的增加(也可称为水冻导致的脱水耐受力)(Jaglo-Ottosen等，Science280，104-106，1998;Liu等，PlantCell10，1391-1406，1998;Kasuga等，Nat.Biotechnol.17，287-291，1999;Gilmour等，PlantPhysiol.124，1854-1865，2000)，以及增强重组植物对要么是水缺乏引起的脱水，要么是暴露于高盐度引起的脱水的耐受力(Liu等，1998，见前；Kasuga等，1999，见前)。另一种CBF转录因子，CBF4，已经被描述为拟南芥中干旱适应性的调节基因(Haake等2002，PlantPhysiology130，639-648)。尽管可获得一些已经在许多植物物种中表现出增强的耐旱性的基因，如十字花科和茄科，仍然有鉴定在作物植物中表达时具有赋予或提高耐早性的其它基因的需要。在一个实施方式中，本发明提供了一种满足这种要求的新基因和相关机制。生物胁迫如病原体(细菌、真菌、病毒)或害虫(昆虫、线虫)是最为普遍的，许多机制通常保护植物免受大多数这些威胁。但是，在某些情况下植物对特异的病原体或害虫表现出易感反应(susceptiblereaction),被认为是特异的病原体或害虫的宿主。宿主-病原体的相互作用已经用基因对基因的概念很好的表征，其中来自宿主植物和病原体/害虫的特异基因相互作用，要么表现为易感反应，要么表现为抗病反应。尽管近年来这种相互作用的分子遗传学已经被很好的表征，这些简单抗性基因的使用仍然被病原体系统的多变的突变所妨碍，这些突变产生多样性以克服抗性基因。一般而言，抗性基因属于蛋白质的少数大类，其包括富亮氨酸重复和额外的结构域。尽管这些基因和基因相互作用对研究植物病原体相互作用#^"趣，利用它们用于保护作物免受广泛多样性的和一系列的病原体仍然还有一粉巨离(awaysaway)*另一体，其所用机制不依赖于植物和病原体的识别。这将赋予更广泛的非种族特异性抗性，这是因为它将赋予对更广泛系列病原体的抗性。一般定义术语"核酸序列"(或核酸分子)是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别是指编码本发明蛋白质或蛋白质片段的DNA。"分离核酸序列"是指不再位于从其中分离的自然环境中的核酸序列，如在细菌宿主细胞中或在植物的核基因组或质体基因组中的核酸序列。术语"蛋白质"或"多肽"可交换的使用，是指由氨基酸链构成的分子，而不论其特异性的作用模式、大小、三维结构或起源。这样蛋白质的"片段"或"部分"仍然被称为"蛋白质"。"分离蛋白"通常是指不再处于其自然环境的蛋白质，如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞。术语"基因"是指包含区(转录区)的DNA序列，其在细胞中被转录成RNA分子(如mRNA)，可操作的连接于合适的调控区(如启动子)。这样基因可能包含几个可操作的连接序列，如启动子，包含如涉及翻译起始的序列的5'前导序列，(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)，以及包含如翻译终止位点的3'非翻译序列。"嵌合基因，，(或重组基因)是指在自然界物种中正常不会发现的任何基因，特别是这样的基因，其核酸序列的一部分或更多部分在自然界中以相互间不连接的形式存在。例如自然界中启动子不与转录区的部分或全部或其它调控区连接。术语"嵌合基因"被理解为包括表达构建体，其中启动子或转录调控序列可操作的连接于一个或多个编码序列或反义序列(正义链的反向互补)或反向重复序列(正义或反义，由此RNA转录物通过转录形成双链RNA)。"基因表达"是指以下过程，可操作的连接于适当的调控区、特别是启动子上的DNA区转录成RNA，该RNA是有生物活性的，如其可翻译成生物活性蛋白质或肽(或活性肽片段)，或其自身具有活性(如在转录后基因沉默或RNAi).在某些具体实施方式中的活性蛋白是指由于存在阻遏结构域而具有显性阴性(dominant-negative)功能的蛋白质。编码序列优选正向并且编码所需的生物活性蛋白质或肽或活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA形式存在，包含把基因的反向或正向和反向的短序列。"异位表达"是指正常时不表达的基因在組织中的表达."转录调控序列"这里定义为能够调控可操作的连接于转录调控序列的(编码)序列的转录速率的核酸序列。这样这里定义的转录调件)、维持和调控转录所必需的序列元件，包括如弱化子或增强子。虽然通常是指编码序列的上游(50转录调控序列，该定义也包含编码序列下游(3')发现的调控序列。这里所用的术语"启动子"是指功能是控制一个或多个基因转录的核酸片段，位于基因的转录起始位点的转录方向的上游，结构上通过以下位点的存在来鉴定DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点，阻遏子和活化子蛋白结合位点，以及本领域技术人员所知的、直接或间接用于调控从启动子开始的转录的量的任何其它核苷酸序列。"组成型"启动子是指在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。"诱导型"启动子是指受生理(如外部施用某种化合物)或发育调控的启动子。"组织特异性"启动子是指仅仅在特定类型的组织或细胞中有活性的启动子。这里所用的术语"可操作的连接"是指多核苷酸元件的功能关系连接。当一个核酸被安置成与另一核酸序列有功能上的关系时，它被"可操作的连接，，。例如，启动子，或更确切的说转录调控序列，如果它影响编码序列的转录，它就与编码序列"可操作的连接"。可操作的连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的，当连接两个蛋白编码区为必需时，被连接的DM序列是在阅读框内且是连续的，以便产生"嵌合蛋白"。"嵌合蛋白"或"杂合蛋白"由各种蛋白"结构域"(或基序)组成的蛋白，其在自然界不能发现，但是可结合以形成功能蛋白，这显示了结合结构域的功能性(如DNA结合或抑制导致显性阴性功能)。嵌合蛋白也可以是自然界存在的两种或多种蛋白的融合蛋白。这里所用的术语"结构域"是指蛋白的具有特定结构和功能的任何部分和结构域，其可转移到另一种蛋白，以提供具有至少结构域功能特性的新杂合蛋白。特异性结构域也可以用来鉴定属于相似转录因子组的蛋白成员，如来源于其它植物物种的直向同源蛋白(ortholog)。术语"靼肽"是指以细胞内的细胞器或细胞外间隙(分泌信号肽)的蛋白质为目标的氨基酸序列，细胞器官如质体，优选叶绿体、线粒体。编码靶肽的核酸序列可以融合(在框架上)到编码蛋白的氨基末端(N-末端)的核酸序列上。"核酸构建体"或"栽体"这里理解为由用重組DM技术产生的人造核酸分子，其可用来将外源DNA递送到宿主细胞中。如本领域公知的或本文别处描述的，载体框架举例而言可以是双元载体或超双元栽体(superbinaryvector)(参见如US5591616、US2002138879和W0950722)，共整合栽体或T-DNA载体，其中嵌合基因是整合的，或如果存在适当的转录调控序列，仅仅所需的核酸序列(如编码序列、反义序列或反向重复序列)整合到转录调控序列的下游。栽体通常包含进一步的基因元件，以便于在分子克隆中的使用，如筛选标记、多克隆位点和其它(参见下文)。术语"宿主细胞"或"重组宿主细胞"或"转化细胞"是指由至少一种核酸分子引起的新的个体细胞(或微生物)，特别指包含编码所需蛋白的嵌合基因，或转录时产生用来沉默靶基因/基因家族的反义RNA或反向重复RNA(或发夹RM)的核酸序列的细胞，其中所述嵌合基因或核酸序列被导入所述细胞。宿主细胞优选植物细胞或细菌细胞。宿主细胞可以包含作为染色体外的(游离基因的)复制性分子的核酸构建体，或优选包含整合在宿主细胞的细胞核或质体基因組上的嵌合基因。术语"筛选标记"是本领域普速技术人员熟知的术语，本文是指表达时可用来筛选包含筛选标记的细胞的任何遗传实体。筛选标记基因产物赋予了如抗生素抗性，或更优选的除草剂抗性或其它筛选性状如表型性状(如色素沉着的变化)或营养需求。术语"报告子"主要用来指可见标记，如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、荧光素酶、GUS或其类似物。术语基因或蛋白的"直向同源"这里是指在其它物种发现的同源基因或蛋白，其具有和所述基因或蛋白相同的功能，但是(通常)从携带有该基因的物种发生趋异时的时间点起序列发生趋异(即从同一祖先通过物种形成进化的基因)。这样拟南芥基因的"直系同源"可在其它植物物种上基于序列比较(如基于全序列或特异性结构域的序列同源性百分比)或功能分析来鉴定。术语"同源的"或"异源的"是指核酸或氨基酸序列和其宿主细胞或器官的关系，特别在上下文的转基因生物中。这样同源序列是在宿主物种中天然存在的(如用西红柿基因转化的西红柿植物)，而异源序列不是在宿主细胞中天然存在的(如用源于马铃薯植物的序列转化的西红柿植物)。根据上下文，术语"同源(homolog)"或"同源的(homologous)"可替换性地指由相同祖先序列派生的序列(如它们是直系同源)。"严谨杂交条件"可用来鉴定基本上与给定的核苷酸序列等同的核苷酸序列。严谨条件是序列依赖性的，并且在不同环境下会不同。总的来说，严谨条件选定为比特异序列在限定的离子强度和PH下的热力学熔点0;)低大约51C。L是指50%的靶序列与完全匹配探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。典型的严谨条件选定为pH7时盐浓度大约为0.02摩尔，温度至少为601C。降低盐浓度和/或增加温度可增加严谨性。RNA-DNA杂交(用如100nt探针的northern印迹杂交)的严谨条件如包括在631C下、在0，2XSSC中洗涤20min至少一次或相当的条件。DM-DNA杂交(用如100nt探针的southern印迹杂交)的严谨条件如包括在至少50^C、通常约55"下在O.HSSC中洗涤20min至少一次(通常2次)，或相当的条件。也可参见Sambrook等(1989)和Sambrook和Russell(2001)。"序列同一性"或"序列相似性"可用通过全部或局部的比对算法对两种肽或两种核苷酸序列的比对来确定。这样当它们(优选用如程序GAP或BESTFIT在默i^参数下比对)共有至少某一最小序列同一性百分比(如下文定义)时，序列可以是"实质上等同"或"基本相似"。GAP用Needleman和Wunsch总体比对算法来比对两个序列的全长，同时最大化匹配数以及最小化空位数(gap)。总的来说，用GAP默认参数，同时空位产生罚分(gapcreationpenalty)=50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分(gapextensionpenalty)-3(核苷酸)/2(蛋白质)。对核苷酸而言，所用的默认得分矩阵是nwsgapdna，对蛋白质而言，默认得分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。序列同一性百分比的序列比对和得分可用计算机舉序来确定，如GCGWisconsinPackage，Version10.3，可从AccelrysInc.，9685ScrantonRoad,SanDiego，CA92121-3752美国获得。另一种相似性或同一性百分比可通过FASTA、BLAST等检索数据库来确定。在本文和其权利要求中，动词"包含"及其动词变化形式被用作其非限定意义，意味着包括在该单词之后的项目，但是未特异提到的项目也不排除在外。另外，提到用不定冠词"一个"或"一种"的元件不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求有元件中的一个或仅仅一个。这样，不定冠词"一个"或"一种"通常意味着"至少一个"。可进一步理解为，这里当提到"序列"时，通常指真实的的具有亚单位(如氨基酸)的某种序列的物理分子。本发明详细描述用激活标签法，发明人分离和表征了拟南芥基因，这里指HARDY(HRD)，其过量表达引起植物林型(plantarchitecture)和相关内部结构与野生型相比，有许多变化。HRD的激活导致叶子看起来较厚，具有较小的紧凑强壮的植物结构。植物更难以从地上拉起，这大概是由于增强的侧根网络。克隆和测序HRD基因，发现其与定义为AP2/ERF的转录因子相似(Alonsoetal.2003，Science301，653-657)。但是本领域并无HRD功能的描述和HRD基因使用的暗示.肌D基因在转基因拟南芥植物中的組成型表达显示出与最初的激活标签系相同的表型，虽然表型更加严重.最初的过量表达突变体AW用来测试对非生物和生物胁迫条件的抗性，发现其明显比野生型对照i^性更显著。另外，通过使用将HRD融合到糖皮质激素受体上的条件性过量表达策略，表明表型可以诱导，具有轻微或几乎没有表型的植物对胁迫测试有抗性。使用全基因组拟南芥微阵列的hrd突变体的微阵列实验，显示出整套基因的差异表达，该差异表达不同于其它已知的胁迫抗性AP2/ERF基因如DREB1A的过量表达，这表明在赋予通常的胁迫抗性上有不同的机制。根据本发明的核酸序列和蛋白质在本发明的一个实施方式中提供了HARDY转录因子成员的核酸序列和蛋白质序列，同时也提供了用于分离或鉴定其它植物物种中HARDY基因的直系同源物的方法。蛋白质的功能可用各种现有方法进行测试，优选通过测试组成型表达待测蛋白质的转化体的表型和相同宿主物种(或变种)的HRD过量表达转化体的表型(优选包含稳定整合到宿主基因组的嵌合HRD编码性基因)来比较，从而允许直接比较转化体表型的功能效果。可理解为在任何转化体实验中，可以看到转化体表型的一定程度的变化，通常是由于基因組中的位置效应和/或由于拷贝的数量。技术人员知道如何在转化体间比较，如通过选择单拷贝数量事件(singlecopynumberevents)和分析它们的表型。其它确定或确认体内基因/蛋白质功能的方法包括产生剔除突变体(knock-outmutants)或短暂表达研究。启动子-报告子基因表达研究也可以提供关于时空的表达图谱和蛋白质角色的信息。与野生型或对照转化体相比，HARDY基因成员的组成型(过量)表达导致一种或多种以下表型变化-具有增加层的叶肉层的更厚的叶子—看起来较小紧凑和强壮的植林—具有增强侧根的更强壮的根系结构-对病原体，如非种特异性(黄萎病)的增加抗性-对干旱的增强耐受力，这通过比野生型更高的存活率来展现。可以利用这些表型来创造具有改性或改良的农艺学特性转基因植物或植物组织/器官，如增强耐旱性或这里在别处描述的其它特性。在一个实施方式中，本发明提供了包含整合在其基因组中的嵌合基因的转基因作物植物，其特征在于，所述嵌合基因包含植物细胞中有活性的转录调控序列，其中该调控序列可操作的连接于核酸序列上，该核酸序列编码具有SEQIDNO:3序列的蛋白质或与SEQIDNO:3有至少70%同一性的蛋白质，或其直系同源蛋白质，或其功能片段。优选植物具有选自以下组中表型的一种或多种增强的耐旱性，增强的抗病性和增强的根系结构。在进一步优选的实施方式中，所述转录调控序列选自以下组组成型启动子、诱导型启动子、组织特异型启动子和发育调控型启动子。本发明另一实施方式提供了所述转基因植物的种子或果实。本发明的进一步实施方式提供了包含组织特异型、诱导型或发育调控型启动子的嵌合基因，该启动子植物细胞中具有活性，且可操作的连接于核酸序列，该核酸序列编码具有SEQIDNO:3序列的蛋白质或至少与SEQIDNO:3有70。/。同一性的蛋白质，或直系同源蛋白质，或其功能片段。还提供了包含所述嵌合基因的栽体。优选的包含在载体中的编码核酸序列具有SEQIDNO:l序列。进一步优选所述编码核酸序列可操作的连接于胁迫诱导型启动子。在进一步实施方式中，本发明提供了利用核酸序列产生具有增强的耐旱性、增强的抗病性和/或增强的根系结构的转基因植物方面的用途，该核酸序列编码具有SEQIDNO:3序列的蛋白质或与SEQIDNO:3有至少70%同一性的蛋白质，或其直系同源蛋白质，或其功能片段。可用电子手段(insilico)来鉴定与HARDY相似的其它成员，如在已有的核酸或蛋白质数据库(如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中鉴定核酸或蛋白质序列，以及利用标准序列分析软件，如序列相似性检索工具(BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等)。根据本发明的HRD蛋白，即SEQIDN0:3所述的实例，可从自然资源中分离，通过化学合成重新合成(利用如由AppliedBiosystem公司提供的肽合成器)或由重组宿主细胞产生。可以利用根据本发明的HRD蛋白来产生单克隆或多克隆抗体，其可例如用于样品中HRD蛋白的检测(免疫化学分析方法和试剂盒)。嵌合或杂合HRD蛋白包含AP2结构域的片段和HRD蛋白的其它部分。结构域可以在HRD蛋白和其它无关的蛋白间交换(结构域交换)，只要所产生的嵌合蛋白的功能与HRD的功能本质上相似。举例而言，这样嵌合HRD蛋白包含HRD蛋白，该HRD蛋白包括AP2结构域和另外的在HRD蛋白中正常不能发现的一种或多种蛋白质结构域，如稳定结构域，结合结构域(如激素结合结构域，如在糖皮质激素受体中发现的，导致可诱导性)等。在另一个实施方式中，提供了嵌合HRD基因，其包含HRD-阻遏子结构域融合，如下面描述的HRD-EAR融合。在转基因植物中，这些嵌合蛋白的过量表达导致显性阴性表型。HRD-阻遏子结构域融合还包含额外的结构域融合在其上，如激素结合结构域(参见如Markel等，2002，Nucl，AcidRes.30，4709-4719)。还提供了编码HRD蛋白的核酸序列(基因组DNA、cDNA、RNA),该HRD蛋白例如上述定义的HRD(包括任何嵌合或杂合HRD蛋白)、或源自另一物种的任何HRD蛋白。由于基因编码的简并性，不同的核酸序列可以编码相同的氨基酸序列。提供的核酸序列包括天然存在的、人工的或合成的核酸序列。编码HRD的核酸序列的实例如SEQIDNO:1(源自拟南芥的编码HRD蛋白的序列)和SEQIDNO:2(源自拟南芥的基因組HRD序列)所示。可以理解当涉及DNA序列但是指RNA中描述的序列时，RM分子的实际碱基序列与DNA分子相同，除了用尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)的差异。很显然许多种方法可用来鉴定、合成或分离HRD核酸序列的变体或片段，如核酸杂交、PCR技术、电子分析和核酸合成，以及其它，如下所述，编码本发明HRD蛋白的核酸序列，特别是DNA序列，可以插入到表达栽体中以产生高产量的肌D蛋白(或如嵌合肌D蛋白)。在宿主中HRDDNA序列最优的表达可以通过采用在植物基因中，特别走植物属或种(Bennetzen&Hall,1982，J.Biol,Chem.257，3026-3031，Itakura.等，1977Science198,1056-1063)的自然基因中最优选的密码子使用，利用现有的密码子使用表进行密码子优化(如更适应在棉花、大豆或水稻中的表达)。用于各种植物物种的密码子使用表如由Ikemura(1993，在"PlantMolecularBiologyUbfax"，Croy，ed.，BiosScientificPublishersLtd,)和Nakamura等(2000,Nucl.AcidsRes.28，292.)以及在主要的DM序列数据库(如在Heidelberg中的EMBL，德国)中公布。因此，可以构建合成的DM序列，以便产生相同或本质上相同的蛋白质。在专利和科学文献中可以发现改造密码子使用以使之在宿主细胞优化的几种技术，用于修饰密码子使用的确切方法对于本发明并不关键。如上文所述的DNA序列的小的改造可通过PCR介导的突变形成(Ho等，1989,Gene77，51-59.，White等，1989,TrendsinGenet.5，185-189)来常规制造。DM序列更复杂的改造可利用现有技术通过重新DNA合成所需的编码区来常规完成。也可以通过增加或删除蛋白质N-末端的一个或多个氨基酸来改造HRD核酸序列，以使HRD蛋白的N-末端具有更优的翻译起始环境。通常本发明蛋白质优选在植物细胞中用Met-Asp或Met-Ala二肽优化转录起始来表达。Asp或Ala密码子这样可在已有的Met之后插入，或第二密码子，Val，可用Asp(GAT或GAC)或Ala(GCT，GCC，GCA或GCG)来代替。DNA序列也可改造以除去不正常的剪切位点。在本发明的一个实施方式中HRD基因表达通过如在它处描述的RNAi方法，在宿主细胞、植物或特异性组织中下调.在另一实施方式中，HRD功能损失型表型(宿主细胞、组织或整株植物)通过表达核酸序列产生，该核酸序列编码具有(显性)阻遏结构域的HRD蛋白(如定义的)的蛋白融合子."功能损失"这里是指HRD蛋白功能在宿主组织或器官中的损失，包含在分子水平(如肌D转录因子下游把基因的转录活性损失)和优选在表型水平的功能。例如，为了提供功能损失型，HRD蛋白融合子根据Hiratsu等2003(PlantJ.34:733-739)的描述用12氨基酸的"EAR"阻遏结构域制得，在此通过引用并入本文。这些融合到HRD蛋白(如定义的)中的任何一种的阻遏结构域融合子，这里术语为"HRD-EAR"融合蛋白，能够引起抑制下游把基因，从而导致了有效的功能损失型突变体(显性阴性效应)。这些阻遏融合子也在还未鉴定出的直系同源基因的异源植物中影响阻遏作用。在一实施方式中提供编码嵌合阻遏结构域-HRD蛋白融合蛋白的核酸序列，特别是HRD-EAR融合蛋白。另外还提供包含所述核酸序列的栽体和包含所述嵌合基因的宿主细胞、组织和/或器官。为了产生HRD-阻遏结构域融合蛋白，编码阻遏结构域的核酸序列可翻译的融合到包含HRD编码序列的核酸序列。HRD-阻遏结构域融合蛋白的编码核酸序列(特别是HRD-EAR)，被置于组成型或特异型启动子(如组织特异型或发育调控型)的控制下。组成型表达在所有HRD或直系同源物被表达和需要发挥其功能的宿主组织中，提供功能损失。HRD-EAR蛋白的特异性表达在组织特异或条件特异时提供功能损失，如特异型启动子可操作的连接在编码HRD-EAR融合蛋白的核酸上。在植物细胞中可以理解HRD蛋白可操作的融合到现有技术可获得的且起作用的其它阻遏结构域。这些包括动物蛋白的阻遏结构域，如果錄ENGRAILED(En)阻遏结构域。例如N-末端的298个氨基酸可以融合到根据本发明的HRD蛋白上，创造出显性阴性嵌合蛋白(参见Markel等.2002,NucleicAcidResearchVol30，4709-4719,以及Chandler和Werr2003，TrendsinPlantScienceVol.8,279-285，都通过引用并入本文)。已经注意到阻遏结构域可以与HRD蛋白在C-末端或在N-末端融合，这依赖于结构域，编码显性阴性融合蛋白的核酸序列可以称为"显性阴性嵌合基因"，当被转移到宿主基因組时被称为"显性阴性转基因"(稳定的整合到宿主基因組上，或短暂的表达)。其它植物阻遏接结构域例如AGAMOUS的LEUNG和SEUSS共阻遏子，FLC和多梳蛋白(polycombprotein).其它动物阻遏结构域包括如WTl、eve、c-ErbA和v-ErbA和Krtippel相关赵associatedbox)(参见Chandler和Werr，2003，见前及其参考文献)。本发明的另一实施方式中，提供了用于检测HRDDNA序列的PCR引物和/或探针和试剂盒。用于从样品中扩增HRDDM的简并或特异性PCR引物对可根据SEQIDNO3来合成，这是本领域的已知技术(参见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,和McPherson等(2000)PCRBasics:FromBackgroundtoBench,FirstEdition,SpringerVerlag,Germany)。同样的，SEQIDNol-2的DNA片段可用作杂交探针。HRD检测试剂盒包括HRD特异性引物和/或HRD特异性探针，以及使用引物或探针来检测样品中HRDDNA的相关指南。举例而言，这样的检测试剂盒可用于检测植物中是否转染了本发明的HRD基因(或其部分)。由于遗传编码的简并性，一些氨基酸密码子可在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下被其它密码子代替。在另一实施方式中，提供了特异结合到根据本发明的HRD蛋白的抗体。特别的，本文还包括结合到HRD或片段或其变体的单克隆或多克隆抗体。抗体可利用本领域已知的方法，用根据本发明的HRD蛋白作为抗原在动物体中制备，如在Harlow和Lane"UsingAntibodies:Alaboratorymanual"(NewYork:ColdSpringHarborPress1998)和在Liddell和Cryer"APracticalGuidetoMonoclonalAntibodies"(Wiley和Sons，1991)中所述的。抗体可进而用来分离、鉴定、表征或纯化其结合的HRD蛋白，例如，通过如ELISA(酶联免疫吸附)或免疫印记分析，允许免疫复合物形成和检测免疫复合物的存在以检测样品中的HRD蛋白。还提供了免疫试剂盒，可用于检测提供的样品的HRD蛋白、蛋白质片段或表位，样品可以是细胞、细胞上清液、细胞悬浮液、组织等，这样的试剂盒至少包括结合到HRD蛋白的抗体和一种或多种免疫检测试剂。抗体也可用来分离/鉴定其它HRD蛋白，如用ELISA或Western印记，另外，这里提供了包含HRD启动子的核酸序列。在SEQIDN0:1的ATG密码子的上游约lkb序列处发现了转录调控序列。这里提供了在SEQIDNO:2中的HRD的转录调控序列，其如1.lkb的5'区所示，这些转录调控序列可用于构建嵌合基因以及用于表达宿主或宿主细胞中可操作连接的核酸序列，特别是HRD转录调控序列可用于在种子或胚胎中表达以用于早期胁迫耐受力的基因表达。可以理解，转录调控序列的组织特异性可通过分析所提供序列的缺失片段直接表达可操作连接在其上的核酸序列的能力而改进或特导化。这种缺失分析允许删除引起非特异性(基础)表达的核酸部分。相似的是，其它类HRD基因的转录调控序列可用已知的方法如TAIL-PCR，通过ATG密码子上游基因组DNA的测序来分离。根据本发明的嵌合基因、载体和重组微生物本发明的一个实施方式中，编码上文所述的HRD蛋白(包括如HRD-GR和HRD-EAR等融合蛋白)的核酸序列被用来制备嵌合基因和包含这些核酸序列的载体，所述栽体用来将嵌合基因转化到宿主细胞和在宿主细胞中产生HRD蛋白，所述宿主细胞如从转化细胞衍生的细胞、组织、器官或有机体.宿主细胞优选植物细胞，但是微生物宿主(细菌、酵母、真菌等)也包括在内。任何作物植物都是合适的宿主，如单子叶植物或双子叶植物，如玉米/谷物(玉米种，如Z.mays,Z:diploperennis(chapule)，Zealuxurians(Guatemalanteosinte),Zeamayssubsp.huehuetenangensis(SanAntonioHuistateosinte)，Z.mayssubsp.mexicana(Mexicanteosinte)、Z.mayssubsp,parviglumis(Balsasteosinte),Z.perennis(perennialteosinte)和Z.ramosa)，小麦(Triticumspecies)、大麦(如Hordeumvulgare)、燕麦(如Avenasativa)、高粱(Sorghumbicolor)、黑麦(Secalecereale)、大豆(Glycinespp，如G.max)，棉花(Gossypiumspecies,如G.hirsutum，G.barbadense)、芸吝属(如B,napus，B,juncea，B.oleracea，B,rapa等)，向曰葵(Helianthusannus)、西红柿(Nicotianaspecies)、苜蓿(Medicagosativa)，水稻(Oryzaspecies,如()sativaindicacultivar-group或japonicacultivar-group)，牧草，珍珠粟(Pennisetum.spp.如P.glaucum)，树种、蔬菜种，如番痴属(如Lycopersiconesculentum)、马铃薯(Solanumtuberosum,其它马铃薯物种)、茄子(Solanummelongena),胡椒(Capsicumannuum，Capsicumfrutescens)，豌豆、豆(如Phaseolusspecies)，肉质果(葡萄、桃子、李子、草莓、芒果)，观赏物种(如玫瑰、矮牵牛、菊花、百合、非洲菊)、木本树(如物种杨树(populus)、柳树、栎树、桉树)、纤维物种如亚麻(Linumusitatissimum)和大麻(Cannabissativa)。这里"作物植物"是指人们种植和培育用于特定目的的植物物种。作物植物可种植用作食物目的(如大田作物)或用作观赏目的(如生产用来剪下的花，草坪的草等)。这里定义的作物植物也包括收获非食物产品的植物，如用作燃料的油、塑料聚合物、药用产品、软木以及其它。嵌合基因和栽体的构建，以将HRD蛋白编码核酸序列导入(优选稳定的)宿主细胞在本领域是公知的。为了产生嵌合基因，编码HRD蛋白(或如HRD-GR结构域融合蛋白)的核酸序列用标准分子生物学技术，可操作的连接于启动子序列，以适于在宿主细胞内的表达。启动子序列可以在载体中已经存在，这样HRD核苷酸序列简单的插入到栽体启动子序列的下游即可。载体然后被用于转化宿主细胞，嵌合基因插入到细胞核基因组或质体、线粒体或叶绿体基因组，并用合适的启动子在那里表达(如McBride等，1995Bio/Technology13，362;US5，693，507)。在一实施方式中，嵌合基因包含用于在植物细胞或微生物细胞(如细菌)中表达的合适的启动子，该启动子可操作的连接于编码根据本发明的HRD蛋白或融合蛋白的核酸序列，优选在3'非翻译核酸序列之后。编码功能性HRD蛋白(或在某些实施例中为功能性HRD-GR结构域融合蛋白)的肌D核酸序列，优选HRD嵌合基因，可用常规方法稳定的插入到个体植物细胞的核基因组上，这种转化的植物细胞可用常规方法用于产生转化植物，该转化植物由于肌D蛋白在某些细胞中在某一时间的存在而具有改变的表型.在这一点上，根癌农杆菌中包含编码HRD蛋白的核酸序列的T-DNA栽体，可用于转化植物细胞，其后，转化的植物可用之前描述的技术，如在EP0116718，EP0270822，PCT公开W084/02913和公开的欧洲专利申请EP(^WW6和Gould等(1991，PlantPhysiol，95，426-434),从转化的植物细胞再生。用于农杆菌介导的植物转化的T-DM的构建在本领域是公知的。T-DNA要么是如在EP0120561和EP0120515中所描述的双元栽体，要么是如在EP0116718中所描述的，通过同源重组可整合到农杆菌Ti质粒上的共整合栽体。优选的每一T-DM栽体包含可操作的连接于HRD编码核酸序列的启动子，其位于T-DNA边界序列间，或至少位于右边界序列的左边。边界序列在Gielen等(1984，EMB0J3，835-845)中已有描述。当然，其它类型载体也可用于转化植物细胞，用如直接基因转化(如在EP0223247所描述的)、花粉介导转化(如在EP0270356和WO85/01856中所描述的)、原生质体转化，如在US4，684，611中所描述的，植物RNA病毒介导转化(如在BP0067553和US4，407，956中所描述的),脂质体介导转化(如在US4，536，475中所描述的)，和其它方法如那些描述用于特定系的转化谷物(如US6，140，S53;Fromm等.，1990,Bio/Technology8,833-839;Gordon-Kamm等，1990，ThePlantCell2，603-618)和水稻(Shimamoto等，1989，Nature338，274-276;Datta等1990，Bio/Technology8，736-740)的方法，以及用于转化单子叶植物(PCT公开WO92/09696)的普遍方法。对于棉花转化也参见WO00/71733，对于水稻转化也参见在W092/09696，WO94/00977和W095/06722中所描述的方法。对于高粱转化参见如JeoungJM等，2002,Hereditas137:20-8或ZhaoZY等2000，PlantMolBiol.44:789-98)。同样的，从转化细胞中筛选和再生转化植物在本领域也是公知的.显然，对不同物种，甚至对单一物种的不同变种或栽种品种，特异地采用再生高频转化体的方案。除了核基因组的转化外，本发明还包括质体基因组，优选叶绿体基因组的转化.质体基因組转化的一个优点是可以降低转基因传播的风险。可用本领域^^知的方法实现质体基因组转化，参见如SidorovVA等，1999，PlantJ.19:209-216或LutzKA等2004，PlantJ.37(6):906-13。得到的转化植物可用于常规植物育种计划，以产生更多的具有相同特性的转化植物，或将基因部分的引入相同植物的其它变种或相关植物品种。从转化植物获得的种子，包含作为稳定基因插入的嵌合HRD基因。转化植物的细胞可用常规方法培育，以产生HRD蛋白，其可以回收用于如产生抗体的其它用途。HRD核酸序列插入到植物细胞基因組，以便插入的编码序列在启动子的控制下，位于启动子的下游(如3')，该启动子可指引植物细胞的表达。优选通过插入嵌合基因到植物细胞基因组来实现，特别优选插入到核基因组或质体(如叶绿体)基因组，优选的启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的分离林CM1841(Gardner等，1981，NucleicAcidsResearch9，2871-2887)，CabbB-S(Franck等，1980，Cell21，285-294)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987，Virology86，482-493)的强组成型35S启动子(strongconstitutive35Spromoters)或增强型35S启动子("35S启动子")，Odell等(1985，Nature313，810-812)或在US5164316中描述的35S启动子，或源自泛素家族的启动子(如玉米泛素启动子，Christensen等,1992，PlantMol.Biol.18，675-689，EP0342926，也可参见Cornejo等，1993，Plant.Mol.Biol.23，567-581)，gos2启动子(dePater等，1992PlantJ.2，834-844)，emu启动子(Last等，1990,Theor.Appl.Genet.81，581-588)，拟南芥肌动蛋白启动子如An等(1996，PlantJ.10，107。)描述的启动子，水稻肌动蛋白启动子如Zhang等(1991，ThePlantCell3，1155-1165)描述的启动子，以及US5，641，876中描述的启动子和WO070067中描述的水稻肌动蛋白2启动子；花椰菜花叶病毒启动子(W097/48819，Verdaguer等，1998，PlantMol.Biol,37，1055-1067)，源自地下三叶草侏4需病毒(Subterraneancloverstuntvirus)的pPLBX系歹'启动子(WO96/06932，特别是S7启动子)，乙醇脱氬酶启动子，如pAdhlS(GenBankaccessionnumberX04049,X00581)，以及TRl'启动子和TR2'启动子(分别是"TR1'启动子"和"TR2'启动子")，其可分别驱动T-DNA的l'和2'基因的表达(Velten等，1984,EMB0J3，2723-2730)，US6051753和EP426641描述的玄参花叶病毒启动子，组蛋白基因启动子，如源自拟南芥(PMB:179-191)的Ph4a748启动子，或其它。换句话说，可利用不是组成型的启动子，而是对植物中一种或多种组织或器官特异的启动子(组织优选/组织特异型，包括诱导发育调控启动子)，如优选叶子、优选表皮，优选根，优选花的组织如绒毡层或花粉嚢，优选种子，优选豆荚等的启动子，由此HRD基因(包括如HRD-GR融合蛋白编码基因)仅仅在某些发育阶段和/或仅仅在特异组织或器官的细胞中表达。例如，通过将编码基因置于植物自身或其它植物的光诱导启动子的控制下，如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小的亚单位基因启动子，HRD基因在植物叶子中可选择性的表达，所述植物为如在US5，254，799中披露的豌豆或在US5034322披露的拟南芥。启动子的选择由所要达到目标的表型来确定，将在下文中更加详细的描述。为了达到耐旱性，組成型、根特异型、胁迫诱导型或病原体诱导型启动子都适合。合适的非生物诱导型启动子是rd29A启动子(kasuga等，1999)。为了在根组织中表达，于根中具有分化活性的启动子在WO00/29566中描述。另一种根分化表达的启动子是US5，"3，363中描述的ZRP启动子(或其变型)。在本实施方式中提供另一种根系特异型启动子，其为BOUNTIFUL启动子(Pereira等未发表)。另一种选择是使用表达为诱导型的启动子.诱导型启动子的实施例是伤害诱导型启动子，如Cordera等(1994，ThePlantJournal6，141)所描述的MPI启动子，其可通过伤害(如由昆虫或物理伤害引起)诱导，或COMPTII启动子(W00056897)或US6031151中描述的启动子。另外，启动子可由化学药品诱导，如由Aoyama和Ch11a(1997，PlantJournal11:605-612)以及US6063985描述的地塞米松，和四环素(T0PFREE或T0P10promoter,参见Gatz,1997，AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol.48:89-108和Love等，2000，PlantJ.21:579-88)诱导。其它诱导型启动子如通过温度变化诱导，如US5，447，858中描迷的热休克启动子，如通过厌氧条件诱导(如玉米ADH1S启动子)，通过光诱导(US6455760)，通过病原体诱导(如EP759085或EP309862)或通过衰老诱导(SAG12和SAG13，参见US5689042)。显然，还有其它范围的启动子可利用。HRD编码序列(或嵌合HRD蛋白编码序列)插入到植物基因组，以便编码序列位于合适的3'末端转录调控信号("3'末端")(如转录形成和多聚腺苷酸信号)的上游(如5M.多聚腺苷酸和转录形成信号包括下述基因的信号CaMV35S基因("3'35S"),胭脂碱合酶基因("3'nos")(D印icker等，1982J.Molec.Appl.Genetics1，561-573)，章鱼碱合酶基因("3'ocs")(Gielen等，1984，EMB0J3，835-845)和T-DNA基因7("3'基因7")(Velten和Schell，1985，NucleicAcidsResearch13，6981-6998)，其作为转化植物细胞中3'不翻译DNA序列，以及其它。将T-DNA载体引入农杆菌可用已知方法实现，如电穿孔或三亲融合。HRD编码核酸序列可任选的作为杂交基因序列插入植物基因组，由此HRD序列框架内(US5，254，799;Vaeck等，1987,Nature328，33-37)连接于编码选择性或可评估(scorable)标记的基因，如编码卡那霉素抗性的neo(或nptll)基因(EP0242236)，以便植物表达出容易检测的融合蛋白。植物细胞的转化也可用来在植物细胞培养物中大量产生根据本发明的HRD蛋白，该植物细胞培养物对许多胁迫有抗性，可在培养时用于生产特异产品。这里当提到制造转基因植物细胞时，这是指分离或组织培养物中的植物细胞(或也指植物原生质体)、或指包含在植物或分化的器官或组织中的植物细胞(或原生质体)，这里也特异性包括两种可能性。因此，说明书或权利要求中提到的植物细胞不仅仅意味着培养物中分离的细胞，还指任何植物细胞，不论它位于何处或存在于任何类型的植物组织或器官中。编码HRD蛋白(或嵌合HRD蛋白)的HRD核酸序列的全部或部分，还可用于转化微生物，如细菌(如大肠杆菌、假单胞菌、农杆菌、芽孢杆菌等)、真菌、病毒、藻类或昆虫。用合并到合适的克隆栽体上的本发明的HRD核酸序列的全部或部分来转化细菌，可用常规方法来实现，优选用Maillon等(1989，FEMSMicrobiol.Letters60，205—210)和W090/06999描述的常规的电穿孔技术。例如在原核宿主细胞中，核酸序列的密码子的使用可由此(如上文对植物的描述)优化。应该除去内含子序列，其它优化表达的适应性可用已知方法获得。为了获得在单子叶植物中的增强表达，如在谷物或水稻等草类物种，内含子，优选单子叶植物内含子可以加到嵌合基因中。例如，将玉米Adhl基因的内含子插入到5'调控区，已经显示了在玉米中的增强表达(Callis等，1987，GenesDevelop.1:1183-1200)。同样的，US5，859,347描述的HSP70内含子，可用于增强表达。HRD核酸序列的DNA序歹iJ，可用翻译中性(translationlyneualtral)方法进一步转变，用定点(site-directed)内含子插入和/或通过引入密码子使用的变化，来修改存在于基因部分中的可能的抑制性DNA序列，如使密码子利用适应于植物最优选的密码子，所述植物优选如上文所描述的特异相关植物属。根据本发明的一个实施方式，HRD蛋白(或嵌合蛋白)的以细胞内的细胞器为靶标，如质体，优选叶绿体、线粒体，或由细胞分泌，从而潜在优化蛋白稳定性和/或表达。相似的是，蛋白可以以液泡为靶标为了这个目的，本发明的一个实施方式中，本发明的嵌合基因包含编码信号肽或乾肽的编码区，该编码区连接于本发明的HRD蛋白编码区。更优选的包含于本发明蛋白质中的肽是针对叶绿体或其它质体靶向的转运肽，特别是源自植物基因的复制转运肽区(该植物基因的基因产物乾向质体)，优化的如Capellades等的转运肽(US5，635，618)，源自菠菜的铁氧化还原蛋白-NADP+氧化还原酶转运肽(Oelmuller等，1993,Mol.Gen.Genet.237，261-272)，Wong等描述的转运肽(1992，PlantMolec.Biol.20,81-93)和公开的PCT专利申请WOOO/26371中的粑肽。也优选的肽为介导连接至该肽的蛋白分泌至细胞处的肽，如马铃薯蛋白酶抑制子11的分泌信号，(Keil等，1986，Nucl.AcidsRes，14，5641-5650)，水稻的oc-淀粉酶3基因分泌信号(Sutliff等1991，PlantMolec.Biol.16，579-591)以及西红柿PR1蛋白的分泌信号(Cornelissen等，1986,EMBOJ.5，37-40)。本发明的特别有用的信号肽包括叶绿体转运肽(如VanDenBroeck等，1985，Nature,313，358)，或US5，510，471和US5，635，618中引起蛋白转运到叶绿体中的优化的叶绿体转运肽，分泌信号肽或将蛋白靶向至其它质体、线粒体、ER或其它细胞器的肽，靶向至细胞内细胞器的信号肽或用于植物细胞外分泌或分泌至细胞壁的的信号序列已在自然界中的靶蛋白或分泌蛋白中发现，优选以下描述的那些Kl6sgen等(1989，Mol.Gen.Genet.217，155-161)、Kl6sgen和Weil(1991，Mol.Gen.Genet.225，297-304)，Neuhaus&Rogers(1998，PlantMol.Biol.38，127-144)，Bih等(1999,J.Biol.Chem.274，22884-22894)，Morris等(1999,Biochem.BIophys.Res.Commun.255，328-333)Hesse等(1989，EMBOJ.8，2453-2461)，Tavladoraki等(1998'FEBSLett.426，62-66.)，Terashima等(1999，Appl，Microbiol.Biotechnol.52，516-523)，Park等(1997，J.Biol,Chem.272，6876-6881)，Shcherban等(1995,Proc.Natl.Acad.SciUSA92，9245-9249)。为了允许HRD蛋白分泌到转化宿主细胞外，合适的分泌信号肽可以融合到肌D蛋白的氨基末端(N-末端).假定的信号肽可用基于计算机的分析来检测到，用如SignalP印tidesearch程序(SignalPVl,lor2.0)(VonHeijne，Gunnar，1986和Nielsen等，1996)。在一实施方式中，几种肌D编码核酸序列在单一宿主中共同表达。共同表达的宿主植物可用转化已经表达本发明HRD蛋白的植物，或使用本发明的不同的HRD蛋白转化的植物杂交，而很容易的获得。另夕卜，几种肌D蛋白编码核酸序列可存在于单一转化栽体中，或用分离的栽体在同一时间共同转化并选择包含两种嵌合基因的转化体。相似的是，一种或多种HRD编码基因可在单一植物中与另一种嵌合基因一起表达，例如编码其它增强耐旱性的蛋白的嵌合基因，如CBFl,DREB1A，水稻0sDREB基因(Dubouzet等，2003，PlantJ.33:751),SHINE基因(Aharoni等2004，PlantCell16:2463-80)或其它。可以理解不同蛋白可以在同一植物上表达，或每个都在单独的植物上表达，然后通过单独的植物间相互杂交来结合在同一植物上。例如，在杂交育种生产时，每一亲本植物表达单一的蛋白质。将亲本植物交叉以产生杂交，这样两种蛋白可在杂交植物上结合。优选的，为了选择的目的，也为了选择控制杂草的目的，本发明转基因植物也可用能编码赋予除草剂抗性的蛋白的DNA来转化，所述除草刑如广镨除草剂，例如基于草胺磷作为活性成分的除草剂(如Liberty⑧或BASTA;抗性由PAT或bar基因赋予；参见EP0242236和EP0242246)或草甘磷为活性成分的除草剂(如RoundUp⑧；抗性由EPSPS基因赋予，参见如EP0508909和EP0507698)。利用除草剂抗性基因(或赋予所需表型的其它基因)作为选择标记进一步具有避免引入抗生素抗性基因的优点。另外，可用其它筛选标记基因，如抗生素抗性基因。通常不接受保持抗生素抗性基因在转化宿主植物中，这些基因可在转化体筛选后再次除去。存在不同的技术以除去转基因。一种除去方法是通过将脂氧合酶(lox)位点侧翼于嵌合基因，然后进行选择，之后将转化的植物与CRE重组酶表达植物杂交(crossing)(参见如EP50676犯1),位点特异型重组导致标记基因的切除，另一位点特异重组系统是EP686191和US5527695描述的FLP/FRT系统。也可用如CRE/L0X和FLP/FRT这些位点特异重组系统来达到基因叠加的目的。还进一步的描述了一种元件排除系统(one-componentexcisionsystem),参见如W09737012或WO9500555.转化植物细胞/植物、种子和根据本发明的核酸序列和蛋白质的应25a接下来的部分描述了应用根据本发明的HRD序列来产生具有一种或多种修饰表型的转化植物细胞、植物、植物种子和其任何衍生物/后代。A)具有增强的胁迫耐受力的植物有胁迫耐受力的转基因植物可用编码HRD蛋白的核酸序列转化植物宿主细胞，并且从所述细胞中再生转基因植物来产生，所述核酸序列在如上文所描述的合适的启动子的控制下。优选的启动子为特异性地由胁迫(非生物和生物)或随化学化合物施用后诱导的启动子。特别优选以下的启动子水稻PR10启动子(Hashimoto等，2004，PlantCellPhysiol.45:550-559)拟南芥AtPLAIIA启动子(Narusaka等，2003，PlantCellPhysiol,44:1246-52)拟南芥CYP83B1启动子(Narusaka等，2004，PMB55:327-342)小麦发芽素(germin)gf-2.8启动子(Berna&Bernier,1999，PMB39:539-549)这里所用的"耐旱性"或"增强的耐旱性"是指转化体(相对于野生型或对照转化体)对耐受一定时期干旱(脱水/缺水导致如在对照植物上可见的叶子萎蔫症状)以及随后恢复的增强的能力，因此导致减少的总产量损失，这是由于每m2有更多的植物存活和/或存活植物的产量没有显著下降。耐旱性可在受控的环境(如温室或生长室)中评定,将每个转化事件的至少约IO个转化体和至少IO个对照植物放置到该环境中，不浇水，经过不同的时间阶段(l-4周或更多)，直到对照植物出现叶子萎蔫或膨压损失，随后又给植物浇水1-2周，同时分析它们的恢复表型。在相同条件下，不浇水时，具有耐旱性的转化体比对照转化体(如用空栽体转化)或野生型植物多存活至少2、3、4、5、6、7天，优选至少2-5天，其显示了不可逆的组织伤害。另一种评定转化体的恢复耐受的方法是比对照组至少高2-5倍(如20%的对照组恢复，而40-100%的转化体存活)。这里所用的"抗病性"或"增强的抗病性"是指转化体与野生型或对照转化体相比，显示了疾病症状减少的增强的能力。疾病抗性筛选用在野生型上显示易感反应的病原体来完成。在一实施方式中，病原体是具有如非宿主特异抗性的真菌棉花黄萎病菌(verticilliumdahliae)。在拟南芥的筛选中，幼苗种植于生长室中直径10cm的盆中，22-24iC下12小时光照，盆中含有培养料沙子珍珠岩(2:1:l)的混合物。发芽后两个周时，幼苗轻轻的连根拔起，暂时的浸入棉花黄萎病菌培养物的饱和悬浮液中，然后放回盆中，用土覆盖根。植物正常浇水，几天后，检查不同时期的疾病症状。植物用每个基因型的5盆复制体来评分，疾病分数根据成熟时存活的植物频率评定。野生生态型Wassilewskija在这种试验中无一存活，而抗病基因型显示有20-100%存活。表达高水平HRD蛋白的转化体通过如分析拷贝数目(Southern印记分析)，mRNA转录水平(如RT-PCR，用HRD引物对或侧翼引物(flankingprimer))或分析不同組织HRD蛋白的存在和水平(如SDS-PAGE，ELISA分析等)而进行选择。为了调控的缘故，优选单拷贝转化体，分析嵌合基因插入位点的侧翼序列，优选测序以表征"事件"。选择高HRD表达转基因事件用以进一步的杂交/回交、自交，直到获得具有稳定HRD基因的高性能良种事件。总的来说，HED基因表达水平和HRD蛋白水平与耐早性表型相关.特别在一实施方式中提供了源自这种植物的转基因种子，其可作为"耐旱性"出售。表达根据本发明的一种或多种HRD基因的转化体也可包含其它转基因，如其它赋予耐旱性或赋予对其它生物或非生物胁迫抗性的基因。为了获得这种具有"叠加"转基因的植物，其它转基因要么基因渗入到HRD转化体中，要么HRD转化体随后用一种或多种其它基因转化，或使用几种嵌合基因转化林系或变种。例如，几种嵌合基因可存在于单一的栽体中，或存在于共转化的不同载体中。在一实施方式中，以下基因与根据本发明的一种或多种HRD基因结合编码其它AP2/ERF型转录因子的基因，优选在植物对环境胁迫应答起作用的基因，如拟南芥CBF1、CBF2、CBF3和/或CBF4编码基因(Jaglo-Ottosen等1998，Kasuga等1999，见前)或源自其它物种的其直向同源基因(Dubouzet等2003，见前)，SHN基因(Aharoni等，2004，见前)，具有昆虫抗性的基因，如苏云金芽孢杆菌毒性基因(编码杀虫蛋白，如cry基因，vip基因等，在hup://www.biols.susx.ac.uk/ho迈e/上有可获得的基因列表)、真菌抗性基因，或其它。这样叠加转化体可能具有更加广的环境胁迫耐受力，如对盐度、低温胁迫、昆虫抗性、病原体抗性、热胁迫、水分胁迫等。将HRD基因导入或渗入已具有相关高耐早性和/或耐病性的植物品系，这是可行的，由此这种耐性可由不同的潜在分子机制(如根系结构)引起。B)包含修饰表型的非转基因植物本发明实施方式还使用非转基因方法，例如突变形成系统如TILLING(定向诱导基因组局部突变，McCallu迈等，2000，NatBiotech18:455，和McCallum等2000,PlantPhysiol.123，439-442，在此通过引用都并入本文))和选择，以产生能生产更高水平的根据本发明的一种或多种HRD蛋白的林系。不限制本发明的范围的情况下，相信这种植物可包含在启动子中的点突变/缺失突变，该点突变/缺失突变即为阻遏子蛋白的结合位点，该阻遏子蛋白使宿主肌D基因为组成型(constitutive)或更高的表达。优选在突变体或部分突变体中的HRD蛋白水平比非突变植物增加至少约2、5、10、15%或更高。TILLING在高通量筛选突变体后(如用Cel1切割突变-野生型DM异源双链体并用测序凝胶系统检测)，用常规的化学药品诱变(如EMS资变)，参见如Henikoff等，PlantPhysiologyPreviewMay21,2004。这样，这里就包含了根据本发明的非转基因植物、种子和組织以及产生并鉴定这种植物的方法，所述非转基因植物、种子或组织包含有在一种或多种組织中增强的HRD基因表达和包含有一种或多种HRD表型(如增强的耐旱性、增强的疾病抗性等所有上文描述的)。在一实施方式中该方法包括以下步骤诱变植物种子(如EMS诱变)，集中(pooling)植物个体或DNA，PCR扩增感兴趣的区域，形成异源双链体和高通量检测、鉴定突变植物，突变PCR产物测序。可以理解，同样可使用其它突变和选择方法来产生这样的突变植物。种子可用如辐射或化学处理，并且筛选具有修饰的HRD表型如增强的耐旱性的植物。在本发明另一实施方式中，植物材料是物种或相关物种的自然种群，该物种或相关物种包含在HRD直系同源编码和/或调控序列处的DNA序列的多态性或变异。在HRD基因靶点处突变体可用ECOTILLING方法筛选(Henikoff等2004，见前)。在这种方法中，在品系或相关物种中的天然多态性用上述的TILLING方法筛选出，其中植物个体或库(pool)用于HRD乾点的PCR扩增，异源双链体的形成和高通量分析。这可通过选择具有所需突变的个体植物来进行，该个体植物可用在随后的育种程序中，以纳入所需的HRD直系同源等位基因来培养具有所需性状的栽培品种。突变体植物可用分子方法和修饰的表型特性与非突变体区别开，分子方法如存在于DNA、HRD蛋白水平、HRDRNA水平的突变。非转基因突变体对赋予增强内源性HRD基因表达的突变或突变体HRD等位基因来说，可以是纯合的或杂合的。序列SEQIDNO1:拟南芥HRD编码序列SEQIDNO2:编码HRD的拟南芥基因组DNASEQIDNO3:拟南芥HRD氨基酸序列SEQIDNO4:糖皮质激素受体(GR)结构域蛋白SEQIDNO5:具有用于克隆的侧翼序列的GR结构域编码序列图1hrd突变体和35S::肌D植物表型A)早期hrd突变体植物表型，显示了暗绿色叶子和减少的林高B)hrd突变体与野生型叶横截面的比较，显示出hrd突变体有更多的叶肉细胞层。图2萌发后3周时hrd突变体与野生型根系结构的比较，显示出接近于茎附着物(stemattachment或根基处有更丰富的次生根和三生根，其提供了总的纤维状结构。图3hrd突变体，表达分析和HRD蛋白结构A)hrd突变体基因组区域，显示了连续的标签基因(taggedgenes)，其被注释为AP2样和醛缩酶，与它们的位于离CaMV增强子四聚物I-ATag插入处6kb和2.3kb的启动子。B)连续活化标签插入处的两种基因，AP2样和醛缩酶的RT-PCR表达分析。所用的RNA源自2林野生型样本和hrd突变体的簇生叶。醛缩酶基因表达是不变的，而AP2样基因在hrd突变体中过量表达，所以是赋予该表型的候选物(candidate),C)HARDY氨基酸序列，显示了保守AP2结构域。阴影方框的氨基酸是与AP2结构域相同的，粗体的氨基酸与AP2结构域共有序列相似，图4用DEX诱导HRD-GR显示hardy突变体表型HRD-GR转化系与野生型Ws生态型和hrd突变体比较。基因型在短白昼条件下(8小时光照)种植4周，以增加叶片数目。基因型要么用类固醇诱导物DEX处理，要么不处理.DEX处理的HRD-GR基因型显示了与hrd突变体相似的暗绿色叶片表型。图5^^用hrd和野生型的耐旱性试验使野生型Ws、hrd突变体系后代和阳性对照组rd29-DREBlA系(提供耐旱性；Kasuga等.1999，见前)的15天幼苗经历9到U天的脱水。接着，浇灌幼苗，一周后，它们的外观(恢复)呈现在困中(除了第一行9D0D外，其中图片直接拍摄于脱水阶段的末期)。DOD为脱水天数。图6由HRD-GR融合子赋予的类固醇诱导性耐旱性与hrd突变体和野生Ws生态型测试耐旱性比较，用10pMDEX处理的35S::HRD-GR系显示了可诱导性。三种基因型的幼苗萌发后用DEX处理，并与不处理的基因型在干旱试验中比较。野生型出现死亡的那天计数为1DAWD(野生型死亡后天数)，其它基因型的存活相对于该天计数。最初两行野生型在所有样本中都显示了死亡的植株，在每一处理中其它基因型存活超过这的天数显示为l-3DAWD。与-DEX处理相比，DEX诱导后的HRO-GR显示了明显的抗性，与hrd突变体用+或-DEX处理所显示的相似。图7hrd突变体与野生型抗病性的比较hrd突变体(A)与对照植物(B)用黄萎病菌病原体处理(标记为+丫)和不用黄萎病菌处理(-V)的比较。hrd突变体未受黄萎病菌感染，而对照组显示了易感的萎蔫表型.具体实施例方式以下的非限制性实施例描述了HRD基因用于改性植物表型的应用。除非另有说明，否则在实施例中，所有重组DNA技术根据以下描述的标准方案(protocol)实施Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,和Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual:第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY;以及Ausubel等(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology的第一和笫二巻，CurrentProtocols,USA。用于植物分子工程的标准材料和方法描述于R.D.DCroy编著的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)，由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications，UK共同出版。实施例1材料和方法1.1植物材料和耐旱性试验所有植物，包括活化标签种群(Marsch-Martinez等，2002，PlantPhysiol.129:1544-1556)和转基因系种植于约22t!的温室，并且是在拟南齐生态型Wassilewskija(Ws)中。对于干旱试验，活化标签突变体hardy与rd29A-DREB-1A系(提供耐旱性；Kasuga等，1999)比较，二者都在拟南芥生态型Ws中。试验在221C的温室中实施，植物种植于包含一份沙子和珍珠岩以及两份培养料(compost)(由25%粘土和75%具有EC1/41(氮、磷和钾)的泥炭(turf)的组成的混合物，Hortimea,Elst,TheNetherlands)的土壤混合物。种子以每个4cm盆6林植物的密度播种(4iC下，三夜之后)，每个托盘有51盆(Araconcontainers;BetaTech,Gent,Belgium)。营养(Hydroagri,Rotterdam,TheNetherlands;2.6EC)于萌发后10天供应，萌发后2个周，把盆转移到干托盘(从外部干燥每一盆后)，让植物经受干旱(9、10、11或12天)。干旱时每2天在托盘内移动植物以抵消位置效应。随后，植物复水，并在一周后观察恢复状况。在野生型、DREB1A和hrd植物间比较耐旱性的试验，在冬季和夏季重复三次以分别给予短或长的白昼状况。另外，用含有35S::HRD-GR融合子的植物的干旱试验(具有与以上所述相似的生长条件)，用如下文所述的DEX诱导来实施。将诱导剂10jiMDEX用三种不同的方法施用到不同的基因型上(35S::HRD-GR、Ws和hrd)，以诱导不同水平的HRD功能a)DEX从托盘中盆的底部施用，b)喷到植物的顶部，c)从盆的底部施用和顶部喷洒二者都用。DEX在植物最初两片叶子出现时施用，并且每隔一天施用直到萌发后14天。然后植物经受前面所迷的千旱和复水，并在一周后观察恢复状况。1.2分离侧翼DM和序列分析用根据Pereira和Aarts(1998,TransposontaggingwiththeEn-Isystem,Totowa，NJ，HumanaPress)的方法从两片叶子或花幼蕾中分离DNA，并且用(Marsch-Martinez等，2002，见前)描迷的方法将10ng基因组DNA用于热不对称交错PCR(TALLPCR)。扩增片段测序前通常进行re-PCR,并用BlastN算法(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215:403-410)鉴定拟南芥基因组中的插入位置，用CLUSTALX(Tho迈pson等.1997,Nucl.AcidRes.25，4876-4882)和DMSTAR(DMSTARInc.Madison,WI)进行多序列比对，而GENEDOC(Nicholas等，1997，EMBNETNews4，1-4)和TreeView(Page,1996，Comp.Applic.Biosci.12:357-358)程序分别用于编辑比对，以分别产生系统发育树。包括引导程序(bootstrapping)的系统发育分析用Lucker等(2002，Eur.J.Bioche迈.269，3160-3171)描述的方法实施。1.3产生植物转化构建体和转基因拟南芥编码所关心的基因或调控序列的片段用pfuDNA聚合酶从基因组DNA上扩增。在这些情况下，片段是A尾式的(A-tailed)，并按照生产商(Promega)所描述的方法导入到pGEM-TEasy载体中，接着在消化并结合到到双元栽体中前从两端测序。用标准方案来进行PCR、限制性消化、质粒DNA分离和凝胶电泳。包含全长编码区的片段从基因組DNA(针对HRD，A12g36450)上(用pfuDNA聚合酶)扩增，以产生过量表达构建体。用于扩增的基因组DM源自拟南芥生态型Columbia,并使用HRDF和HRDR引物。寡核苷酸H咖《5*-'CGG腦面GCftA03MC潔CMIkfaC-3"SEQIDNO-6HM>rCfiTGtSACStSfTTGfTTAaCEaTC&TGG—3/〗SgQID恥:7寡核苷酸对分别在扩增片段的5'和3'导入BamHI和Sa11限制性位点，该限制性位点可用于将555bp的编码区片段结合到pNEWl双元载体(改性的pBI121双元栽体，NayelliMarsch-Martinez和AndyPereira，未发表)的BamHI和Sall位点上(位于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和胭脂碱合酶(N0S)终止子之间)。合成的构建体在35S启动子的控制下过量表达At2g36450AP2转录因子。为了产生启动子GUS构建体，每个基因的ATG密码子(HRD的lkb处)上游的片段，用TaqDNA聚合酶和在5'和3'分别导入XbalNcol限制性位点的寡核苷酸，从基因组DNA(Columbia生态型)中扩增。这允许将该片段结合到改性pBinPlus栽体(vanEngelen等，1995，Trans.Res.4，288-290)的Xbal和Ncol位点(位于栽体位于p-葡糖苷酸酶(GUS)报告子基因的上游)。为了产生35S::HRD-GR构建体，包含HRD全长编码区的片段从拟南芥Columbia生态型的幼叶基因组DNA用寡核苷酸RP6和RP6(用pfuDNA聚合酶)扩增，以扩增含有HRD全长编码区的0.55kb片段。BF《TT義TTTC:r;w5MTCaUVGGlAC:CfC:CAAAGAC—3'SS6IDNOS接,3"CTMmGiRTOTGttMLMTCCACmft.,-3f卿IDNO:9寡核苷酸对将Xbal和BglII限制性位点分别导入到扩增片段的5'和3、其可用于连接。35S::HRD-GR构建体通过多点连接装配(assemble),其中具有合适相容的粘性末端的个体片段(启动子、HRD基因、GR片段、终止子)在一个反应中共同连接到双元栽体中。从-526处延伸到转录起始位点的CaMV35S启动子片段，可作为源自pDH51(Pietrzak等，1986，NuclAcidRes14:5857-68)的pBS-SK土衍生物的0.55kb的Hindm-Xbal片段获得。GR片段作为源自pMTL23(SeqID5，编码GR蛋白结构域SeqID4)的0.85kb的BglII-XhoI片段获得。CaMV35S终止子片段作为源自pDH51(Pietrzak等，1986,见前)的pBS-SK士衍生物的0.21kbSalI-EcoRI片段获得。构建体在双元载体pMOG22(ZENECA-MOGEN，NL)中制得，其包含嵌合的CaMV35S-潮審素磷酸转移酶-tNoS，以用于转化期间的选择。所用的rd29A-DREBlA构建体与(Kasuga等，1999,Nat.Biotech.17，287-291)所描述的相似，除了基因融合子是插入到pBinPlus处之处(vanEngelen等，1995,Trans.Res.4，288-290)。构建体用浸花转化方法导入植物(Clough和Bent,l"8,PlantJ.16，735-743)。种子盘栽于二分之一强度(onehalf-strength)MurashigeandSkoog培养基(1/2MS;Murashige和Skoog，1962，Physiol.15，473-497)，用50mg/L卡那霉素选择的幼苗随后转移到温室中。1.4基因表达分析用于逆转录-PCR(RT-PCR)的总RNA，用TrizolReagent按照生产商(Invitrogen,Lifetechnologies)所描述的方法，分离自4周大的hardy活化标签突变体和野生型(WS生态型)植物的成熟的绿色簇生(rosette)叶。大约1ug的总RNA按照供应商(Invitrogen，Carlsbad,CA)所述的方法，用于DNaseI处理和cDNA合成(用SuperScriptII逆转录酶)。cDNA稀释50倍，并用针对肌动蛋白基因的特异寡核苷酸来扩增，以补棲cDNA样品的浓度。腦!TPl,5GCGGTT，TCC織GT您fQTOWS.EQID恥IDRA譜2,TCCCTG猫CCTGCTTCftTC鹏CT-3,卿'SDN'Os11随后，利用稀释的cDNA进行PCR反应，该PCR反应使用为扩增插入位点侧翼的两个基因设计的特异性寡核苷酸，寡核普酸HRDf和HRDr用于扩增At2g36450基因，并用适合At2g36460基因的合适引物。PCR反应条件包括变性步骤95匸下3min，接着95tl下lmin，55X:下lmin，72"C下1.5min这样35个循环，终止于72*€下5min的延伸步骤。对于对照PCR，用肌动蛋白寡核苷酸，并用30个扩增循环。1.5GUS染色和显微镜检查在体外分析来自不同器官的组织以用于它们的GUS表达模式，所述器官要么来自土壤生长植物，要么来自种植于1/2MS培养基上的幼苗。GUS溶液包含100Mm磷酸钠緩沖液，pH7.0，0.5mg/ml5-溴-4-氯-3"引咮P-D葡萄糖醛酸(glucoronicaxid)(X-Gluc，Duchefa，TheNetherlands),0.1%Triton,和每种都是0.5mM的铁氛化钾/亚铁氰化钾。样品被真空渗入并在371C下培养16-2仆，然后在70%乙醇中除净(deplete)叶绿素。要么在双目镜下观察(WILDM3ZofHeerbruggSwitzerland，type-S)，要么用光学显微镜(Zeiss)观察，并用RS测光(photometric)CoolSNAP相机(MediaCybernetics)用对应的CoolSNAP软件来照数码相片。为了用于扫描电镜(SEM)，样品用传导性碳胶(conductivecarboncement)胶合在样品架上(Leit-C，NeubauerChe迈ikalien,Germany)，然后在液氮中冰冻。样品在真空下转移到-90匸下的专用的水冻制备室(Oxford冰冻系统，CT1500HF，Eynsham,UK)中，冰冻断面(cryo-fracture)在大约150匸下用冷的(-196X:)手术刀片制得。断裂样品在真空(3X10-7帕)中-90"C下冷冻干燥3min,以除去水蒸气污染物。在样品表面用10nm钿賊射涂膜后，将其转移到在Cryo-FESBM(JE0L6300FFieldEmissionSEM，Japan,Tokyo)的冷的样品阶段(-190"),随后用5kV的加速电压分析。图片为数字化记录(0rion，Belgium)。1.6微阵列分析用TRIZOL试剂(LifeTechnologies,Inc.)才艮据生产商说明书用拟南芥的2-4片簇生叶来分离总RNA，并且用RNeasyMineluteKit(Qiagen，Carlsbad,CA,USA)来纯化。用AminoAllylMessageAmpKit(Ambion,Austin,TX，USA)来进行RNA扩增。简要的i兑，用3pg总RNA和1m1T7寡核普酸(dT)引物通过逆转录来进行第一链cDNA合成。全长dsDNA用包含1x第二链緩沖液，4jiildNTP混合溶液(dNTPmix)，2Hi1DNA聚合酶，1m1RNA酶H的反应体系在16"C下培养2个小时来合成。cDNA通过将其用到平衡过滤器(equi1ibratedfi11ercartridge)上来纯化。将纯化的cDM浓缩，并将其体积调整到14p1。用T7体外转录的反义RNA扩增，在包含12plATP、CTP、GTP混合物(25mM)，3|ilaaUTP溶液(50mM)、3n1UTP溶液(50mM)，4jil10x反应緩冲液，4^1T7酶混合物的溶液中在37C下反应8小时来完成。然后扩增的aRNA通过将其用到平衡过滤器(equilibratedfiltercartridge)上来纯化。我们用来自亚利桑那州大学的含有拟南芥的29000个基因的高密度长链寡核普酸(spottedlongoligonucleotide)0peron芯片(http://www.operon.com/arrays/omad，php)来杂交。aRNA样品与单活性(mono-reactive)Cy3或Cy5荧光染樹NHSesters)(AmershamBiosciences)结合2个小时。染色结束和纯化后，目标与含有2xSSC，0.06x液体封闭剂(LiquidBlockingReagent)(A迈ershamBiosciences)，0.04%SDS的80jil杂交溶液混合.加热到951C2分钟后，然后在水上冷却，将混合物加到位于栽玻片和盖玻片(LifterSlip，ErieScientific)间的缝隙中。栽玻片在烘箱中的杂交室中56匸下培育9小时。接着载玻片依次在含有0.5%SDS的2xSSC、0.5xSSC和0.05xSSC的溶液中在RT下清洗5分钟，然后在1000rpm的速度下旋转干燥10min。杂交载玻片用ScanArrayExpressHT扫描仪(PerkinElmer)扫描，产生Cy3和Cy5背景信号(Cy3andCy5channels)的Tiff图片。ScanArrayPMT电压根据饱和信号的第一信号设定为42-50V。扫描的图片用软件程序ScanArrayExpress(PerkinElmer)来分析。自适应圆圏方法(adaptivecirclemethod)用于定量，LOWESS方法用于数据标准化。用默认参数(下限400，乘数1.70)选定信号-背景方法用于质量测试，结果用于检测试验效率。为了进一步的数据分析，将数据提取到Excel表格处理软件中，选择显示中值强度大于2x背景的通道1或通道2(Cy3或Cy5)的基因表达值。另外，我们过滤出显著的调控基因，该调控基因显示的中值比率大于1.5或小于0.66(Log2值十/一0.58)。这些基因表达列表为我们提供了潜在调控序列的长列表，该潜在调控序列可进一步用于其它试J^r处理的比对。在特异性处理(如干旱)分析中，至少一个复制体的表达值大于2倍(fold)(Log2值土l)的基因用来与其它处理比对。实施例2hardy突变体和特征表型的鉴别通过筛选2000个拟南芥转座子活化标签系(Marsch-Martinez等，2002)，鉴定出一林具有低生长率和暗绿色叶子的突变体植物。突变体(术语为hardy,hrd)的簇生叶和茎上的叶具有比野生型植物更厚的叶。突变体随后开花，并具有降低的结实率。最显著的表型是将成熟植物从土壤中拉出是很困难的，这可能是由于强壮的根系结构。该植物看上去对温室条件的变化非常有耐受力，因此被取名为hardy.自体授粉的hrd突变体系的后代显示出显性突变(四分之三的植林表现hrd表型)。隔离的突变体植物在在生长模式上表现出不同，其大小从看上去中等植物到非常小的植物，中等大小的植物与野生型在同一时间开花，这表明在这些植物中开花事时间没有受影响，然而，在较小的植物中，开花几乎比野生型晚5-6天，这表明较小的植物开花时间晚。但是，在突变体中的花蕾要比在其野生型中的开放时间晚的多。在中等大小的hrd植物中，主干伸长达5-6cm高，并具有与主干差不多相同高度的更多数量的次生茎(secondarystems)。茎上节间长度减少。植物看上去更加茂密紧凑。由于节间长度的严重减少伸长不多，较小的hrd植物(图1A)具有非常短的主干和次生干。中等大小和较小的hrd植物与野生型相比，开花很多，但是结实率低。通过用如Example1.5描述的冷冻断裂扫描电镜(cryofractureSEM)扫描叶子结构来分析叶子结构，显示比野生型具有额外栅栏层的厚的多的叶子(图IB)。这额外层大概给予了叶子深绿色表型，这是由于更小的细胞和更多的层数使叶绿素密度更高。通过将hrd植物种在具有营养作用的沙子中，然后冲洗掉沙子以露出根系结构来表征根系表型。根系结构通过计数和测量初生根、次生根和三生根的数目和长度来分析(表l)。hrd突变体最有区别的特征是分枝为次生根和三生根的根(表1)，非常接近干或根的基部，且仅仅在沙子下(图2)。与野生型相比，这在根的基部产生了更多的纵向次生根和三生根，引起更复杂的根系结构，如单子叶植物的纤维根系系统。这样，这些根系具有更大的表面积以在基部支撑，其增加了对土壤的锚固力(anchoragecapacity),使它们更抵抗被拔出。这种接近根系基部有更多分枝的表型是为hrd突变体的更加强壮的根系表型做贡献的特性。当对用力拉约4周大的hrd突变体和野生型植物进行测定时，hrd突变体需要更高的根系拉力。从地面被所需的力拉出时，Hrd突变体需要比野生型大20-50%的力.已经显示根系拉力与根系倒伏特性(lodgingtrait)相关，倒伏特性是谷类和树中一个非常重要特性，其能使植物站直并且抗倒伏(Bruce等，2001，JExpBiol52:459-68;Bailey等2002，JExpBiol53:333-340)。表l三周大的植物离根基lcm的根的测量植物系初生根次生根三生根根基长度N=4(微士SD)(絲士SD)(綠土SD)(cm)±SDWT1±0.001.50±0,580.00±0.000.55±0.06hrd1±0.004.25±0.509.25±1.260.28±0.05实施例3AP2/ERF转录因子基因负责hrd突变体表型。DNA凝胶印记分析表明，hrd包含单位点插入(singleinsertion)(数据未显示)。分离和测序分析侧于翼插入位点的DNA，进一步表明插入位点位于染色体1的基因间区(图3A)。35S增强子四聚体在编码未知蛋白的基因(在启动子上游的4025碱基对)和编码转录因子的植物特异性AP2/ERF家族成员(启动子上游620碱基对)的基因之间。为了检查与野生型相比，这两种基因是否在hrd中被导入表达，我们用分离自hrd和野生型叶组织(图3B)的cDNA，进行了逆转录PCR(RT-PCR)试验。结果表明与野生型叶子相比，在hrd突变体叶子中，仅仅在从35S增强子四聚体6kb距离处的AP2/ERF基因AT2g36450被诱导，并且是对表型负责的第一候选者。转录因子的植物AP2/ERF超家族在拟南芥中包含141个成员(Alonso等，2003，Science301,653-657)，并且HRD蛋白包含AP2/ERF结构域(图3C)。序列同源性搜索和系统发育分析整个AP2/ERF家族，表明HRD与许多水稻中的蛋白相似(数据未显示)。水稻和拟南芥蛋白含有AP2结构域，也含有在C-末端相似的氨基酸残基。实施例4转基因植物过量表达HRD编码AP2/ERF转录因子的下游基因(At2g36450)，是对hrd突变体表型起作用的第一候选者。因此，基因的编码区(术语为HRD)被克隆，并在35SCaMV启动子的控制下在拟南芥中组成型表达。所有培育的转基因植物(IO个个体)显示了与初始活化标签系类似的表型，特别是植物的hrd暗绿色叶子和较小结构(数据未显示)。大多数35S::HRD系的表型(起始的转化体和后来的后代)比起始的hrd突变体更严重。在大多数情况下植物是较小的，在一些情况下甚至矮小(成体大小为3-5cm)(数据未显示)。相同的构建体转化到西红柿上，显示了较小的暗绿色叶子表型，这表明所述的叶子表型可以被赋予到异源植物上。实施例5水稻中HRD基因的过量表达在双元栽体pMOG22中制备含有在CaMV3SS启动子控制下的HRD编码区的构建体，以用于水稻转化。转化体用已建立的农杆菌系统在水稻栽培品种Nipponbare中获得。愈伤组织和再生芽苗(regeneratedshoots)在25mg/L的浓度下选择对潮霉素(hygromucin)的抗性。生根后，转化体转移到温室中，并完成初步表型分析。然后其自交后代用于完成详细的表型和胁迫耐受试验。用HRD过量表达构建体转化的水稻系显示了比野生型具有更多侧枝的较长的根系系统。这些就是已经发现的使水稻或其它谷类对干旱有更高耐性有用的特性。(Li等，2005，TAG110:1244-52;Bruce等2001见前)实施例6用糖皮质激素基因融合子诱导HRD表达为了在不同组织和发育阶段中导入HRD基因的表达，我们生成表达HRD和鼠糖皮质激素受体(GR;在CaMV35S启动子的控制下)的激素结合结构域的融合子蛋白转基因系(Chang等，1987，NucAcidsRes，22:9603)。35S::HRD-GR起始转化体(Tl)的种子种于含有培养基的盘内，培养基中有或无lOuM地塞米松(DEX)激素。在补充有DEX的培养基上种下的幼苗显示了如同在hrd突变体中看到的明显的表型，该表型具有深绿色叶子的较短幼苗(图4)。为了表征HRD表达赋予不同表型的机制，在不同的生长阶段和植物不同的部分进行用地塞米松(DEX)诱导来诱导HRD-GR融合子的试验。含有35S::HRD-GR转基因的幼苗和成体植物显示了野生型表型，没有像hrd突变体(图4)的表型。种植于在温室或生长室中的幼苗在萌发后的不同时间(萌发后1周、IO天)用DEX处理，并且要么从下面灌溉，要么从项部喷撒，或者喷洒和灌溉都用。用早期处理或喷洒和灌溉处理产生了具有如在叶子水平监视到的强烈表型的植物.最强诱导是用lOnMDEX，显示了与起始hrd突变体相似的表型。这样，测试35S::HRD-GR转基因系的不同DEX诱导水平，以用于如下所述的胁迫诱导的表型。当用lOpMDEX从下面灌溉处理35S::HRD-GR植物时，得到一轻度(mild)hrd表型，其比初始hrd突变体较大。这些植物表现出轻微向下的巻曲，具有细长茎的深绿色的簇生叶，有看起来正常的茎生叶(caulineleaves)和正常的开花时间(图4)。簇生叶的大小未受太大影响。当从顶部喷洒DEX处理35S::HRD-GR植物时，得到了与hrd相似的表型，其具有小簇生叶，深绿色的轻微向下巻曲。但是，主干正常延伸达7-8cm高，开花时间在一些植物中从正常到延迟。当从底部(灌溉)和顶部喷洒DEX都被釆用来处理35S::HRD-GR植物时，它们表现出非常强烈的hrd突变表型，其具有小的严重巻曲的深绿色簇生叶和开花较迟。实施例7HRD基因的时空表达为了检测服D基因的表达，创造出植物转化构建体，其将基因的预测ATG密码子上游(如在SeqID2中所示)的1.0-kbDNA序列，连接到p-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因上。在拟南芥中，在种子和胚中检测出转化体GUS表达。这与HRD基因表达的公共微阵列数据相符，表明种子发育中该基因正常发挥功能，提供了种子成熟过程的胁迫耐受力。实施例8植物过量表达HRD显示了增强的耐旱性为了查明作为HRD过量表达的结果，植物表面的变化影响它的耐旱能力到什么程度。为了这样做，使起始活化标签hrd系、rd29A-DREBlA抗性对照和野生型(Wassilewskija生态型)的15天大的幼苗脱水9-12天(图5)。然后，灌溉幼苗并检测它们的恢复状况一个周。野生型植物不从长于9天的脱水处理中恢复，而所有衍生自表达HRD基因的系的幼苗恢复，变得更绿和更强壮。HRD-GR转化体显示了DBX诱导hardy相关突变表型的暗绿色叶子，将其用于干旱胁迫试验。基因型WT(野生型)、突变hrd型和35S::HRD-GR型萌发后并用或不用DEX处理。DEX处理要么从底部灌溉，要么从顶部喷洒，或从底部灌溉和顶部喷洒都用，生长2个周后，对所有的处理和基因型限制水分9-15天。每隔一天，植物复水以便能检测恢复。记录每一处理野生型(WT)死亡之日，其它基因型和处理的存活是相对于这一日期的。野生型死亡后的天数(DAWD)被记录如表2所示。图6显示了这次试验的结果。用DEX诱导的HRD-GR型显示了与hrd突变体相当的耐旱性表型。比较从底部(对根系灌溉)、从顶部喷洒(叶)DEX处理和下部和顶部都处理的试验结果，表明如叶子表型所看到的，处理的组合给予了对耐旱性最显著的表型。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>类似的，水稻中HRD的过量表达也导致了植物具有增强的耐旱性。具有35S::HRD构建体的转化体与对照植物相比，能够在脱水作用下抵抗细长叶的枯萎，如同脱水后恢复所评定的。实施例9植物过量表达肌D显示了增强的抗病性。为了检测HRD过量表达系对生物胁迫的抗性，进行对黄萎病菌抗性的筛选，作为非宿主特异性抗性的例子。幼苗种于光照12小时、22-241C的生长室中的含有培养料沙子珍珠岩(2:1:l)混合物的直径10cm的盆中。萌发后2个周，幼苗被轻轻的连根拔起，暂时浸入黄萎病菌培养物的饱和悬浮液中，然后放回盆里，用沙子盖住根系。几天后植物正常浇水，并在不同时期检查疾病症状。植物用每种基因型的5盆复制体来打分，疾病分数用成熟时存活的植物频率来获得。野生生态型Ws在此试验中没有存活，而潜在抗性候选者基因型显示了20-100%的存活率.在用黄萎病菌复制感染试验中，hrd突变体显示了高水平的抗性，其没有显示在对照易感野生型植物(图7)上可见的枯萎症状.为了确i人HRD基因的效果，抗性试验在重演(recapitulated)过量表达系中重复。在成熟时没有可见枯萎症状或病原体的证据，这表明了完全的抗性表型。实施例10hrd突变体的微阵列分析揭示负责表型的基因为了理解联合的非生物和生物胁迫应答的机制，用hrd过量表达4突变体来进行微阵列试验。在我们关于筛选耐旱拟南芥基因型的研究中，野生生态型Wassilewskija(WS)在9天的限水后死亡，而过量表达型rd29A::DREB1A和hrd系限水12天仍然存活。为了统一检测植物材料，我们对野生型Ws用8天限水，收获叶子样品用于RNA分离，同时从野生型Ws对照，规则浇水的rd29A::DREB1A和hrd上取叶子样品。对于每一对比(野生型对照vs过量表达型)，我们分别使用2个生物复制体。野生型对照的aRNAs用Cy3标记，野生型干旱或过量表达型的aRNAs用Cy5在两个生物复制体中标记。许多复制体也进行染色交换试验以作为技术对照。试验按实施例1.6进行，在hrd突变体中，考虑到在两个复制体中表达一致的基因，微阵列试验揭示了142个被诱导的基因和151个被阻遏的基因。下面的表3显示了与野生型相比，多于双倍的具有诱导/阻遏基因的HRD调节子(共调控的基因的组)的选择。被诱导基因用红色(或暗影(darkshade))表示，被阻遏基因用绿色(浅影(lightshade))表示。HRD表达模式与DREB1A有部分类似之处，表明赋予胁迫耐受力表型的基因的调控。然而，许多基因在HRD和DREB1A过量表达型中都被特异差别性调控，如表3中的被诱导的基因所示。在HRD调节子中特异性被诱导的基因是一组4TFs、Ca2+信号蛋白、以及海藻糖和肌醇半乳糖苷代谢基因。生物胁迫相关基因以被诱导的防御素PDF2基因为代表，其已经显示可在茉莉酮酸酯通道被病原体应答诱导，以及被发病机理相关的PR-5和Betvl基因的抑制诱导.HRD和DREB1A在具有改变的表达模式的基因上的不同表明了这两种AP2/ERF基因的作用或功能的不同机制。与这些结果和公开的微阵列数据的对比表明，与之前描述的其它AP2/ERF转录因子相比，肌D基因调控不同組的下游基因。调控基因的不同組以及模式赋予了hrd突变体和HRD过量表达系的特异性表型.表3:与DREB1A型和干旱型(Drought)相比，由于HRD过量表达引起的基因上调<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>权利要求1、一种转基因作物植物，包含整合在其基因组中的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含在植物细胞中有活性的转录调控序列，所述转录调控序列可操作的连接在核酸序列上，所述核酸序列编码具有SEQIDNO3序列的蛋白质，或编码与SEQID3至少70％相同的蛋白质，或编码其直向同源蛋白或其功能片段。2、根据权利要求1所述的植物，其中所述的植物具有选自以下组中表型的一种或多种增强的耐旱性、增强的抗病性和增强的根系结构。3、根据前面所迷权利要求任意一项所述的植物，其中所述的转录调控序列选自组成型启动子、诱导型启动子、组织特异型启动子和发育调控型启动子。4、根据前面所述权利要求任意一项所述的植物，其中所述植物选自以下属玉米属、稻属、小麦属、番茄属、茄属、大麦属、芸苔属、大豆属、菜豆属、燕麦属、高粱属、棉属、杨属、栎属、柳属。5、根据前面所述权利要求任意一项所述的植物的种子或果实。6、一种嵌合基因，包含植物细胞中有活性的组织特异型、诱导型或发育调控型启动子，该启动子可操作的连接在核酸序列上，所述核酸序列编码具有SEQIDNO:3序列的蛋白质，或编码与SEQIDNO:3至少70%相同的蛋白质，或编码其直向同源蛋白或其功能片段。7、包含权利要求6所述的嵌合基因的栽体。8、根据权利要求7所述的栽体，其中所述的编码核酸序列具有SEQIDNO:1的序列。9、根据权利要求7或8所述的载体，其中所述的编码核酸序列可操作的连接在胁迫诱导型启动子上。10、将核酸序列用于生产具有增强的耐旱性、增强的抗病性和/或增强的根系结构的转基因植物的用途，所述核酸序列编码具有SEQIDNO:3序列的蛋白质，或编码与SEQIDNO:3至少70%相同的蛋白质，或编码其直系同源蛋白或其功能片段。全文摘要本发明涉及具有新表型的转基因植物领域，特别是具有增强的抗旱性和病原抗性的植物。它提供了包含整合在其基因组中的嵌合基因的转基因作物植物，其特征在于，所述的嵌合基因包含活跃于在植物细胞内的转录调控序列，该转录调控序列可操作的连接在核酸序列上，该核酸序列编码具有SEQIDNO3序列的蛋白质，或编码与SEQIDNO3至少70％相同的蛋白质，或编码其直系同源蛋白(ortholog)或其功能片段。除了增强的耐旱性外，该转基因植物也可以表现出增强的抗病性和增强的根系结构。文档编号A01H5/00GK101321871SQ200580052016公开日2008年12月10日申请日期2005年9月6日优先权日2005年9月6日发明者A·皮雷拉,A·阿哈罗尼,J·黑姆斯特拉,K·R·特瑞加特米科,S·迪克斯特申请人:植物研究国际有限公司