专利名称：一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHR1、编码该蛋白的基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHRl、编码该蛋白的基因及应用。
背景技术：
土壤中磷素的缺乏是一个世界性的问题，在30-40%的可耕地中磷的浓度仅有I
10PM，这么低的磷含量不能满足植物生长和发育的需要。通常人们通过施用磷肥来保证植物正常的生长和获得较高的作物产量，然而，即使有充足的磷肥供应，大部分磷肥也会与碱性土壤中的钙离子或酸性土壤中的铝离子和铁离子形成不可溶的化合物，或者与微生物作 用形成有机物质，仅有20%左右的磷素被植物吸收利用；此外，土壤中的部分无机磷通过雨水冲洗或径流进入地下水中，导致土体富营养化，而且这种情况越来越成为一个全球化的环境问题。加之，长年过多的施用无机磷肥对不可再生的磷矿资源也是一种消耗和浪费，最终导致提高了作物的产量成本。为了解决作物磷利用率低的问题，有必要对缺磷条件下的磷利用调控机制进行认识和了解，从而采用分子育种方法改善作物的这一性状。在缺磷条件下，植物已经形成了一系列的适应机制。已有报道，在拟南芥中有29%的转录因子与磷饥饿反应有关。转录因子诸如WRKY75、ZAT6、MYB62、BHLH32、AtPHRl和PHR1-LIKE1是不同植物中调控磷素动态平衡的主要调控子。其中，属于MYB-CC家族一员的AtPHRl是拟南芥中第一个在转录水平上被证明对磷饥饿起调控作用的转录因子它以二聚体的形式与一系列磷饥饿响应基因启动子区域的一段不完全回文序列(P1BS，GNATATNC)结合，从而调控相应基因的表达(Rubio et al. 2001; Franco-ZorriIIaet al. 2007;Nilsson et al. 2007)。将AtPHRl进行转基因研究，结果表明，在转化后的野生型株系和突变体株系中无机磷的含量均得到了显著提高(Bari et al. 2006; Nilsson et al.2007)，说明AtPHRl在提高磷的利用方面起到作用。近年来，从水稻中分离出的0sPHR2与AtPHRl有些类似，过量表达0sPHR2的株系中，几个磷转运蛋白基因的表达均得到了上调，认为与茎中磷含量的提高呈正相关，从而推测0sPHR2在提高水稻磷利用效率方面也起到调节作用(Zhou et al. 2008)。玉米是世界上最重要的栽培作物和经济作物，大部分都生长于酸性和碱性土壤，由于磷肥很容易被土壤颗粒所吸附，导致形成不可溶性的磷化合物，影响到玉米正常生长及获得较高产量。有研究表明，玉米不同的种质材料对磷的利用效率存在基因型差异，通过温室和田间试验的磷利用效率筛选研究，只有极少部分自交系被认为属磷高效利用基因型。而磷的高效利用属于数量性状，受多基因控制，转录因子的导入，将能调控下游一系列磷利用相关功能基因的表达，对提高作物磷利用效率是一种切实可行的方法(Century etal. 2008)。然而，到目前为止，在玉米中，尚未有与PHRl相似的转录因子的报道。本发明通过对玉米转录因子ZmPHRl的分离、序列分析和异源功能验证等研究证明，在拟南芥中过量表达ZmPHRl，调控了一系列磷诱导基因和磷转运蛋白基因的表达，从而使植株对磷胁迫的敏感性得到了缓解，改善和提高了低磷条件下植株的长势和茎叶中磷的含量，从而为育种工作者通过遗传工程手段提高磷利用效率提供了物质基础。
发明内容
为了采用分子育种方法改善作物磷利用率低的问题，本发明提供了一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHRl、编码该蛋白的基因及应用。本发明是采用如下技术手段实现的
一种玉米低磷胁迫反应调控因子ZmPHRl，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或者几个氨基酸 所形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述调控因子ZmPHRl的基因，所述基因的序列含有SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列。本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。所述的植物表达载体，包括
(1)植物表达载体为pJIT163-ZmPHRl:: GFP，及其在构建过程中生成的各种中间载体，是将所述基因插入PJIT163 GFP的Sal I和BamH I酶切位点之间得到的；
(2)植物表达载体为pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP，及其在构建过程中生成的各种中间载体，是将限制性内切酶KpnI和Xho I双酶切重组质粒甲得到的小片段和限制性内切酶KpnI和SalI双酶切pCAMBIA1300得到的大片段连接得到的。本发明还提供了一种农杆菌菌株，是将含有植物表达载体pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP的重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株GV3101获得的。本发明还提供了过量表达的转基因纯合株系，是通过将含有植物表达载体pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP的农杆菌菌液点滴法导入拟南芥中获得的。本发明扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对，所述引物序列如下
引物对I
正向引物5' - AAGCAAGGTAATGAAATG -3'；
反向引物5' - TGAATAGTGCAACCGATA -3'。引物对2
正向引物5' -CACCCTTTATTTCTCAGTCATCCAA -3'
反向引物5' -TCATTTTGTGTAGCACTCTCATCAG -3'
本发明还进一步提供了上述基因在植物育种中的应用。在低磷条件下，转ZmPHRl基因株系的含磷量极显著高于野生型植株，ZmPHRl过表达后增加了转基因植株对磷的吸收，从而可改善植株的磷营养状况，使得植株的株高，生物量与野生型植株相比均得到明显增加，根冠比与野生型植株相比均得到明显减小，如图5所示。由于过表达ZmPHRl可增加植物的吸磷能力，因而在同样的土壤肥力的条件下，特别是低磷条件下，ZmPHRl转基因植株可以少施肥，减少土壤环境污染，节约资源。本发明的基因及其编码蛋白在作物中，特别是玉米、小麦和水稻等粮食和经济作物的品种改良中将发挥重要的作用，应用前景广阔。
图1 pJIT163-ZmPHRl GFP 的结构示意 图 2 pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP 的结构示意 图3转基因拟南芥纯合株系；
图4转基因株系PCR检测结果；
图5转基因株系RT-PCR检测结果；
图6转基因拟南芥植株GFP荧光显示结果；
图7转基因拟南芥植株根系中GFP荧光显示结果； 图8过量表达株系的获得；
图9 ZmPHRl过量表达株系和野生型株系在高磷(ImM Pi)和低磷(IOyM Pi)条件下的生长情况；
图10 ZmPHRl过量表达株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)条件下植株根系和地上部的磷含量；
图11 ZmPHRl过量表达株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)条件下憐响应基因的表达；
图12 ZmPHRl过量表达株系和野生型株系，在高磷(ImM Pi)和低磷(0. OlmM Pi)条件下磷转运蛋白基因的表达。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，材料，如无特殊说明，均为常规方法和自常规生化试剂商店购买得到的，其中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Tl代表示TO代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示Tl代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。玉米材料478 :为山西农业科学院现代农业研究中心育种室保存。pJIT163-GFP载体中国科学院遗传与发育生物学研究所赠得。质粒PCAMBIA1300 :从中国科学院遗传与发育生物学研究所赠得。农杆菌GV3101 :从中国科学院遗传与发育生物学研究所赠得。哥伦比亚生态型拟南芥从中国科学院遗传与发育生物学研究所赠得。实施I ZmPHRl蛋白及其编码基因的发现及克隆
根据拟南芥的AtPHRl (At4g28610)的氨基酸序列，搜查TIGR (The Institute ofGenomic Research Database-TDB)玉米数据库(http://maize. jcv1. org),根据同源性、预测氨基酸序列的长度和结构域，获得可能编码PHRl基因的合并序列TC346249，共计13个玉米EST。以TC346249为模板，设计PCR引物序列如下
正向引物5' - AAGCAAGGTAATGAAATG -3'；
反向引物5' - TGAATAGTGCAACCGATA -3'。用Invitrogen公司的Trizol试剂提取玉米自交系478的总RNA,DNaseI (RNase-free)处理后,取4iig用Promega公司的M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA第一链，用其作为模板进行PCR扩增，
PCR反应体系超纯水39.5 ii LUOXPCR buffer 5 y L，模板2 y L，浓度为IOy M的正、反向引物各 I U L, EX-TaqDNA 酶(5u/ u L)0. 5u L, dNTPs (IOmM) I u L。PCR 反应条件94°C 4min ；94°C 30sec, 53/60°C 30sec,72°C lmin30sec, 35 个循环-,1 TC IOmin ;4°C保温。得到PCR扩增产物，参照北京鼎国生物技术有限责任公司产品DNA片段快速纯化/回收试剂盒纯化PCR扩增产物，与pMD18-T载体在16°C下过夜连接，获得重组质粒pMD18-ZmPHRl，使用热击法将重组质粒pMD18- ZmPHRl转化大肠杆菌DH5 a，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒，进行测序。测序后获得I个完整的0RF，即序列表中SEQ ID NO 2氨基酸序列，推测由449个氨基酸残基组成的多肽，该蛋白命名为ZmPHRl，含有典型的MYB和Coiled-coil结构域。 将ZmPHRl蛋白的编码基因命名为ZmPHRl基因，其开放阅读框核酸序列如SEQ ID N0:1所示，为1350bp (含有终止密码子)。实施2植物表达载体的构建1. pJIT163-ZmPHRl :: GFP表达载体的构建 具体步骤如下
(I)在重组质粒pMD18- ZmPHRl的基因两端引入SalI和BclI位点(BclI为BamH I的同尾酶)
PCR引物
正向引物5’ - GC gtcgac ATGAGGAAGITTAATC-3’
反向引物5’ - GCG tgatca ACTATCTTGCAGTTT-3，
PCR反应体系超纯水39.5 ii L、10 XPCR buffer 5 y L，模板2 y L，浓度为IOy M的正、反向引物各 I U L, EX-TaqDNA 酶(5u/ u L)0. 5u L, dNTPs (IOmM) I u L。PCR 反应条件94°C 4min ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C lmin30sec, 35 个循环-,1 TC IOmin ;4°C保温。(2)将重组质粒pMD18- ZmPHRl用限制性内切酶Sail和BclI进行双酶切，回收带有酶切位点的基因片段。(3)用限制性内切酶Sal I和BamH I双酶切重组质粒pJIT163_GFP，回收载体骨架。(4)将步骤(2)回收的片段和步骤(3)回收的载体骨架连接，得到重组质粒PJIT163- ZmPHRl GFP ;序列表的SEQ ID NO 1自5’末端第I至1347位核苷酸所示的ZmPHRl基因插入pJIT163-GFP的双35S启动子和GFP基因之间的SalI和BamH I酶切位点之间，见图1。2. pCAMBIA1300_ZmPHRl : : GFP 表达载体的构建 具体步骤如下
(I)用限制性内切酶KpnI和Xho I双酶切重组质粒甲(PJIT163- ZmPHRl :: GFP)，回收约3.6kb左右的片段(含有35S启动子、ZmPHRl基因、GFP基因和终止子)。(2)用限制性内切酶KpnI和Sal I双酶切质粒pCMBIA1300，回收载体骨架。(3)将步骤(I)回收的片段和步骤(2)回收的载体骨架连接(Xho I与Sal I是同尾酶)，得到重组质粒pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP，其结构示意图见图2。实施3转基因株系的获得1、重组农杆菌菌株的获得
将重组质粒pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP利用冻融法导入农杆菌菌株GV3101，获得含ZmPHRl基因的重组农杆菌。2、转基因植株的获得
(1)用重组农杆菌菌液通过点滴法转化哥伦比亚生态型拟南芥。得到TO代种子；
(2)用潮霉素(50mg/L)筛选2代；
(3)将阳性T2代植株在含抗生素(50mg/L潮霉素)的MS平板上发芽，2-3周后观察抗性反应情况，没有阳性与阴性分离的株系为转ZmPHRl纯合株系，即T3代(见图3)。
3、转基因纯合株系的鉴定
T3代植株经PCR和RT-PCR检测，获得8个在DNA水平和RNA水平上表达ZmPHRl的阳性株系(图4，图5)。利用活体成像系统，在转基因纯合株系中观察到GFP荧光(图6)，利用共聚焦荧光显微镜在转基因纯合系的根尖分生组织细胞核中观察GFP荧光(图7)。
实施4过量表达转基因株系的获得1、高磷处理
分别将生长状况相同的一个T3代株系幼苗30株和野生型幼苗置于23°C光照培养箱中进行高磷培养液培养(3天换一次营养液)。营养液为2 mM Ca(NO3)2, 0.65 mM MgSO4,25 uM Fe-EDTA, 5 uM MnSO4, 50 u M KCl, 2 u M ZnSO4, 0. 5 u M CuSO4, 0.005 u M(NH4)6Mo24 和 25 mM H3B04。ImM KH2P04。2、ZmPHRl基因表达量在转基因株系中的检测
提取高磷处理的拟南芥地上部的RNA，反转录为cDNA ; WcDNA为模板进行Real-timePCR扩增。扩增ZmPHRl基因的引物如下
正向引物5’ -CACCCTTTAITTCTCAGTCATCCAA-3’
反向引物5’ -TCATTTTGTGTAGCACTCTCATCAG-3，
以进行相同处理后过量表达植株中ZmPHRl基因的表达量为1，则可以看出过量表达株系与野生型株系的相对表达量比较，见图8。在高磷处理条件下ZmPHRl基因的表达量高于野生型植株。Tl株系的ZmPHRl的表达量较野生型株系高13. 06倍，从而获得了过量表达ZmPHRl的转基因纯合株系(图8)。实施5 ZmPHRl基因功能验证1、不同磷处理水平
基础培养液组成如下2 mM Ca (NO3) 2) 0. 65 mM MgSO4, 25 u M Fe-EDTA, 5 uMMnSO4, 50 uM KCl, 2 uM ZnSO4, 0. 5 u M CuSO4, 0.005 u M (NH4)6Mo24 和 25 mMH3B04。高磷培养液中，KH2P04浓度为ImM。低磷培养液组成如下为了使营养液中的K离子浓度保持一致，再补充0. 99 mM KCl，其它同完全培养液；低磷培养液中，KH2P04浓度为0.Olmmol/L。
分别将生长状况相同的一个T3代株系幼苗60株和野生型幼苗(WT)60株置于23°C光照培养箱中进行水培(高磷营养液，3天换一次营养液)，培养4-5周后,30株改用低磷培养液培养7天，30株继续用高磷培养液培养(3天更换一次)，然后观察拍照并测定植株干物质量、植物地上部(叶和茎)和根的全磷含量和有效磷含量。2、过量表达株系的形态及生长状况
相比高磷处理，过量表达株系和野生型株系的长势在低磷条件下均受到不同程度的抑制(图9)。过量表达株系的植株冠部大小和干物质量均高于野生型(表1)，而且在低磷条件下更明显。在低磷条件下，过量表达株系的根冠比明显低于野生型。说明过量表达株系对低磷胁迫的敏感性减小，抵抗力增强，即过量表达植株有低磷条件下长势好于野生型(图9)。表I过量表达株系和野生型株系在不同 磷水平条件下的植株干重、根冠比和全磷含量
3、全磷和有效磷含量分析
3.1有效磷测定，利用钥锑抗比色法进行。(I)试剂配制
I)配制IOOml 2%的冰醋酸水溶液(体积比)(提取剂)。2)配制硫酸-钥酸铵溶液(溶液A):即0. 5N H2S04中含有0. 4%(ff/V)的钥酸铵
①溶解0.8g钥酸铵((NH4) 6M07024 4H20于IOOml蒸馏水中；
②然后徐徐加入5ml的浓H2S04(98%)；
③充分混匀，冷却后加水至200ml
3)配制10%(W/V)的抗坏血酸溶液(溶液B)
溶解2g抗坏血酸于水中，最后加水至20ml，贮于棕色瓶中，在4°C冰箱保存(最好现配现用)。4) IOOml 0. 5%酒石酸锑钾溶液 IOOmlA液中加入0. 5%酒石酸锑钾溶液10ml。5)工作溶液按体积比6:1混合液A和溶液B.注工作溶液需要每天配制，配制好后放置2小时后再使用。(2)操作步骤
I)称取适量(约0.1g)地上部或根装入一个2. OmL离心管中，用液氮磨匀，在4°C放置(冰上或者冰箱)至样品冻融；
2)加入2mL 2% (体积百分含量)冰醋酸水溶液，在42°C水浴中温浴30min。3) 12000rpm离心2min,上清液用于有效磷含量的测定。4)取Iml工作溶液与I ml样品上清液混合，于37°C温育I小时。5)反应液在冰上冷却或4°C 5 min终止反应。820nm可见光波长下测定吸收值。(3)磷标准曲线的制作
称取0.44g KH2P04(80°C干燥2h)溶于蒸馏水中，定容至得母液(无机磷浓度为100 u g/mL)
然后用母液配置无机磷浓度分别为0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1和2iig/mL的标准液,蒸懼水为空白对照。
取500 ii L上述标准液(或蒸馏水)，加入500 u L AMES反应液，37°C反应I小时；4°C放置5min终止反应。820nm可见光波长下测定吸收值。并绘制标准曲线。(4)计算
植物有效磷(Pi)含量(mg Pi/g FW) =OD 值 * (V/m) * (V2/V 1)*C OD值一换算后待测液中磷的质量浓度(PPM: mg/L)
V一样品制备溶液的ml数，即样品所加提取剂的体积(此为0. 01 L) m 一样品鲜重(g)(根据实际称得的质量计算)
VI一吸取反应所用体积(I ml)
V2 —反应液总体积数(3ml) C 一样品的稀释倍数(如果样品浓度过高，需稀释至I ml后再反应)
3.2全磷测定 先将材料在300° C进行H2SO4-H2O2消煮，再利用钥锑抗比色法进行测定。3. 3研究结果
无论在高磷还是低磷培养条件下，过量表达株系的全磷含量高于野生型株系，但差异不明显(表I)。而在低磷条件下，过量表达株系茎叶中的有效磷含量则为野生型的两倍，差异明显。在根中的有效磷含量则无显著差异(图10)。这个结果暗示，过量表达株系能够在低磷条件下提高茎叶中的有效磷含量。4、对下游磷饥饿响应基因和磷转运蛋白基因的调控
对过量表达株系和野生型株系中的磷饥饿响应基因J tIPSl ,A tPS2、A tPS3和七TPAS/的表达进行定量PCR检测。结果表明，低磷条件下，相比野生型株系，ZmPHRl过量表达株系根中AtIPSl、AtPS2、AtPS3和ATPAS/的表达量均得了明显提高(图11 a, c, e，g);在茎叶中，四种基因的表达量也得到上调，但只有和AtRNSl的上调比较明显(图11c，g)。在高磷条件下，ZmPHRl过量表达株系根中和的表达量也得到上调(图11 d，f, h )。而无论在那种磷培养条件下d沈AS/在过量表达株系中的表达均高于野生型株系(图11 g，h)。以上结果说明ZmPHRl调控了和ATPAS/
四种基因的表达。对过量表达株系和野生型株系中的磷转运蛋白基因Phtl; 2、Phtl; 4, Phtl; 8和Phtl; 9的表达进行定量PCR检测。在低磷条件下，过量表达株系根中的Phtl; 2、Phtl; 8的Phtl; 9的表达量得到上调(图12 a, e, g)，而在高磷条件下，过量表达株系根中的Phtl; 2和Phtl;9的表达量也得到提高(图12 b, 11)，在茎叶中沖吐1;2、？1^1;8的？1^1;9的表达量未检测到(图12 a, b, e, f, g, h)。在低磷条件下,Phtl; 2，Phtl; 8和Phtl;9在过量表达株系根中的表达高于高磷处理。以上结果表明，在低磷条件下，调控了根中Phtl; 2，Phtl; 8和Phtl; 9的表达。ZmPHRl可能对Phtl; 4的表达没有调控作用(图12 C，d)。
权利要求
1.一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHRl，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或者几个氨基酸所形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的低磷胁迫因子ZmPHRl的基因。
3.权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的序列含有SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
4.一种扩增权利要求2、或3所述基因的全长或其任意片段的引物对，所述引物序列如下引物对I正向引物5' - AAGCAAGGTAATGAAATG -3'反向引物5' - TGAATAGTGCAACCGATA -3'；引物对2正向引物5' -CACCCTTTATTTCTCAGTCATCCAA -3'反向引物5' -TCATTTTGTGTAGCACTCTCATCAG -3'。
5.含有权利要求2、或3所述基因的植物表达载体。
6.权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述载体为PJIT163-ZmPHRl :: GFP，及其在构建过程中生成的各种中间载体，是将所述基因插入pJIT163 GFP 的SalI和BamH I酶切位点之间得到的。
7.权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述载体为 pCAMBIA1300-ZmPHRl :: GFP，及其在构建过程中生成的各种中间载体，是将限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切重组质粒甲得到的小片段和限制性内切酶KpnI和SalI双酶切 PCAMBIA1300得到的大片段连接得到的。
8.一种含有权利要求7所述植物表达载体的农杆菌菌株，其特征在于，含有植物表达载体pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP,是将重组质粒乙通过冻融法导入农杆菌菌株GV3101获得的。
9.含有权利要求7所述植物表达载体的过量表达的转基因纯合株系，其特征在于，是通过将含有植物表达载体pCAMBIA1300-ZmPHRl GFP的农杆菌菌液经点滴法导入拟南芥中获得的。
10.权利要求2、或3所述基因在植物育种中的应用。
全文摘要
本发明公开一种低磷胁迫反应调控因子ZmPHR1、编码该蛋白的基因及应用，属于基因工程技术领域，是为了解决采用分子育种方法改善作物磷利用率低的问题。一种玉米低磷胁迫反应调控因子ZmPHR1，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或者几个氨基酸所形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述调控因子ZmPHR1的基因，所述基因的序列含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列；以及上述基因在植物育种中的应用。本发明的基因及其编码蛋白在作物中，特别是玉米、小麦和水稻等粮食和经济作物的品种改良中将发挥重要的作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/29GK103012574SQ20121051888
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者白建荣, 王秀红, 刘惠民, 孙毅, 史向远, 任志强 申请人:山西省农业科学院作物科学研究所