专利名称：一种编码植物生长调节剂的基因、表达产物及其用法的制作方法
技术领域：
本发明一种编码植物生长调节剂的基因、表达产物及其用法，属农业生物技术领域，专用于促进植物生长、防治植物病虫害和农业生物技术育种。
从环境进化而来的植物，在其基因组中存在抗环境胁迫的基因。植物病原细菌是植物的主要环境胁迫因子之一。现代分子植物病理学揭示，植物病原菌有其致病性，也有诱导植物产生抗病性和促进植物生长的能力。这种能力是由植物病原细菌的hrp基因决定的。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上的过敏反应(hypersensitive response on nonhost plants,HR)和在寄主植物上的致病性或寄主性(pathogenicity or parasitism on hostplants)。HR是植物一种局部的、快速的细胞编程死亡形式，是植物主动抗性的结果。植物病原细菌中具两性功能的因子是由hrp基因编码的。目前的研究结果显示，植物病原黄单胞细菌(Xanthomonas)中也存在hrp基因。黄单胞细菌中的hrp基因簇不同于Ⅰ组病原细菌(Erwinia amylovora、Pseudomonas syringae)的hrp基因簇，其特征在于hrp调节基因hrpG和hrpX位于hrp基因簇外，hrp基因簇结构和功能更为复杂。黄单胞菌种类多、寄生专化性强和侵染为害的植物种类多，但编码两性功能因子的基因更为保守。
研究植物病原黄单胞细菌的hrp基因，不仅可以揭示其致病性的基本遗传决定因子，其与植物互作的分子机制，而且还可以发现hrp基因中编码促进植物生长、增强抗逆性(抗旱、抗干热风等)、诱导产生抗病性和避虫性等多功能的新型多效植物生长调节剂的基因。国外已对E.amylovora、Pseudomonas syringae、Ralstonia solanacearum和Xanthomonascampestris pv.vesicatoria中hrp基因的结构和功能进行了系统的研究。hrp基因簇一般由20多个hrp基因组成。国内王金生等人已对X.oryzae的hrp基因克隆和hrp调节基因hrGXooc、hrpXooc和hrpXoo申请了专利保护(专利申请号为00112216.9)。
本发明的目的是提供一种能编码植物生长调节剂的基因、表达产物及其用法，能够表达新型多效植物生长调节剂，可作为基因资源，用于农业生物技术育种、转基因植物和防治病虫害以及与其它有益基因重组构建用于商业用途的遗传重组体。其基因产物可用于仿生化学工业，模拟合成植物生长调节剂。还可直接应用于植物，促进植物生长、提高产量、增强植物抗逆能力和诱导植物产生抗病性和驱虫性。
本发明所提供的一种编码植物生长调节剂的基因hrfl基因，其特征在于1．hrfl基因来源对水稻黄单胞菌白叶枯病变种(X.o.pv.oryzae)的hrp基因克隆pUHRX245中所携17.0Kb EcoRⅠ片段(申请专利号为00112216.9)进行序列测定，发现其中1个阅读框架(420bp)具有harpin特征，推测其蛋白质富含甘氨酸。依据此阅读框架设计引物，用PCR方法扩增出该片段。用PCR方法还可从水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)、水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、野油菜黄单胞苜蓿致病变种(X.campestris pv alfalfae)、棉花角斑病菌(X.campestris pv.malvacearum)、柑桔溃疡病菌(X.citri)、桃细菌性穿孔病菌(X.c.pv.pruni)和菜豆疫病菌(X.campestris pv.phaesoli)等植物病原黄单胞细菌的基因组中扩增出该片段。该阅读框架定名为hrfl基因(hrp and multiple function gene)。
2．hrfl基因的核苷酸序列420-432个核苷酸大小，起始密码子处存在EcoRⅠ酶切位点，编码区域富含ggt或ggc等密码子，ggcggcggcttc在不同黄单胞菌中有不同的重复，一般2～3次。hrfl的核苷酸序列为EcoRⅠ5’-AT TTTGAACACACAATTCGGCGGCAGCACGTCCAACCTTCAGGTTGGCCCAAGCCAGGACACAACGTTCGGTTCGAACCAGGGCGGCAACCAGGGCATCTCGGAAAAGCAACTGGACCAGTTGCTGTGCCAGCTCATCTCGGCCCTGCTTCAGTCGAGCAAAAATGCTGAGGAG AAG CAG GATAAT CAG AATTCGCAGCAGGCCGGGCAGCAGAATGGCCCCTCGCCATTCACCCAGATGCTGATGCATATCGTCGGAGAGATTCTCCAGGCGCAGAAT GACTTTAGTGGCGACCTCGGCCTCGGCACCAACCTCTCGAGCGACAGCGCATCGATGCAGTAA-3’hrfl基因的核苷酸序列中的ATG示起始密码子，TAA示终子密码子， 或 示编码甘氨酸(glycine,G)的密码子， 示编码一个GGGF氨基酸残基的重复。 示EcoRⅠ酶切位点。
hrfl基因表达产物是harpinXoo蛋白质，其特征在于，亲水性，对热稳定，对蛋白酶敏感，分子量大小14.0kDa，等电点为4.3，富含甘氨酸，不含半胱氨酸，GGGF在黄单胞菌中重复2～3次，harpinXoo的氨基酸序列如下 hrfl基因的表达产物harpinXoo使用方法为按浓度为5～100μg/ml的harpinXoo对植物进行叶面注射、喷洒、蘸根或种子处理，在生长季节使用2-3次。
本发明所提供的编码植物生长调节剂的基因hrfl基因，能够表达新型多效植物生长调节剂，可作为基因资源，用于农业生物技术育种、转基因植物和防治病虫害以及与其它有益基因重组构建用于商业用途的遗传重组体。hrfl基因的表达产物harpinXoo，可用于仿生化学工业，模拟合成植物生长调节剂。也可直接应用于植物，促进植物生长、提高产量、增强植物抗逆能力和诱导植物产生抗病性和驱虫性。
hrfl基因的表达产物harpinXoo，按以下浓度对植物进行处理5μg/ml的harpinXoo注射烟草叶片，24h内可激发产生HR。15～30μg/ml的harpinXoo对植物进行叶面喷洒或种子处理，在生长季节使用2-3次，可促进植物生长，提高作物产量达15％以上，诱导植物产生的抗病性和常规化学杀菌剂相当。100μg/ml时，可使水稻叶片保绿，相当于细胞激动素6-呋喃氨基嘌呤10μg/ml的作用。30μg/ml的HarpinXoo在小麦干热风前使用，相当于2％KH2PO4的效果。
图1．hrfl基因序列及其编码产物harpinXoo的蛋白质序列特征。
图2．hrfl基因构建于pET30a上获得的遗传重组质粒pEHR4的物理图谱。
实施例1编码植物生长调节剂功能的hrfl基因特征与表达水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)hrp基因克隆pUHRX245所携hrp基因片段大小为36.8Kb。EcoRⅠ酶切36.8-bp hrp片段，获得17.0-bp hrp基因片段，克隆pHRE17(本发明的前一个发明已对此申请了专利保护，专利申请号为00112216.9)。17.0-bpEcoRⅠ片段测序后，用ORF Finder程序寻找开放阅读框架，发现一大小为420bp的核苷酸序列，其推测产物具harpin性质(
图1)。依据420核苷酸序列设计引物5′-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3′和5′-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3′PCR方法可扩增出该片段。PCR扩增条件为94℃/4min+(94℃/30 sec+60℃/1min+72℃/2min)×35循环+72℃/7min。PCR产物纯化后经NdeⅠ和BamHⅠ酶切，连接于表达载体pET30a上，获得重组质粒为pEHR4(pET30a::hrfl)(图2)。将pEHR4转化大肠杆菌BL21，获得重组微生物BLHR4(BL21/pET30a::hrfl)，将重组微生物BLHR4单菌落接种于20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振荡培养12h，将1M的IPTG加入其中使终浓度达1mM，再培养3h。离心(5000rpm)10min收集菌体。菌体于100℃中水浴10min，冷却后12000rpm离心10min，取上清注入烟草叶片叶肉细胞中，24h内产生过敏反应(hypersensitive response,HR)。取3μl上清液进行12％SDS-PAGE电泳，根据标准蛋白质的分子量推算，该表达蛋白的分子量约为14kD。凝胶成象系统扫描显示，该蛋白的表达量约占总蛋白的40％。圆盘等电聚焦电泳(IEF)测定harpinXoo蛋白质的等电点(pⅠ)为4.3。将此基因命名为hrfl基因(hrp and multiple function gene)。hrfl基因的核苷酸序列为EcoRⅠ5’-AT TTTGAACACACAATTCGGCGGCAGCACGTCCAACCTTCAGGTTGGCCCAAGCCAGGACACAACGTTCGGTTCGAACCAGGGCGGCAACCAGGGCATCTCGGAAAAGCAACTGGACCAGTTGCTGTGCCAGCTCATCTCGGCCCTGCTTCAGTCGAGCAAAAATGCTGAGGAG AAG CAG GATAAT CAG AATTCGCAGCAGGCCGGGCAGCAGAATGGCCCCTCGCCATTCACCCAGATGCTGATGCATATCGTCGGAGAGATTCTCCAGGCGCAGAAT GACTTTAGTGGCGACCTCGGCCTCGGCACCAACCTCTCGAGCGACAGCGCATCGATGCAGTAA-3’420个碱基的hrfl基因序列中，ATG示起始密码子，TAA示终子密码子， 或 示编码甘氨酸(glycine,G)的密码子， 示编码一个GGGF氨基酸残基的重复。 示EcoRⅠ酶切位点。
hrfl基因表达产物命名为HarpinXoo，其蛋白质序列为 hrfl基因编码产物为HarpinXoo,139个氨基酸，分子量为14kDa,pⅠ为4.3。下划线处的氨基酸示富含甘氨酸(glycine,G)，GGGF为一个重复单位。
提取水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、水稻细条斑病菌(X.o.pv.oryzicola)、柑桔溃疡病菌(X.citris)、棉花角斑病菌(X.campestris.pv.malvacearum)、苜蓿黄单胞菌(X.c.pv.alfalfae)、桃细菌性穿孔病菌(X.c.pv.pruni)和菜豆疫病菌(X.c.pv.phaseoli)的染色体DNA，依据以上的PCR引物，进行PCR扩增。1％琼脂糖电泳发现，PCR产物与hrfl基因大小一致。按同样方法经T4DNA连接酶连接于pET30a载体上。导入宿主菌BL21中后，按同样表达方法和同样提取条件，都能在上清液中检测到激发烟草产生HR的活性物质。
实验室小剂量生产harpinXoo将编码139个氨基酸的420bp hrfl基因连接于表达载体pET30a上得到重组质粒pEHR4(pET30a::hrfl)。pEHR4转化大肠杆菌BL21得到遗传重组微生物BLHR4(BL21/pEHR4)。单菌落接种BLHR4于LB+Km20μg/ml+IPTG 1mM中于37℃下振荡(转速为110转/分)培养16h。离心(5,000rpm)10min收集菌体，加1/40发酵体积的20mM Tris缓冲液(pH9.0)充分悬浮后，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min后，加0.5ml/25ml PMSF(20mg/ml)，超声波(20KHz)破碎菌体10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混匀后再超声波破碎10min。10000rpm离心10分钟，取上清于100℃水浴下10min，冷却后12,000rpm离心10min收集上清液。上清液中含harpinXoo蛋白质的浓度达600μg/ml。LB为培养基(1L中含5g酵母粉、10g聚蛋白胨，10gNaCl,pH7.0)。Km为卡那霉素，IPTG为异丙基硫代-β-半乳糖苷，PMSF为苯甲基磺酰氟，Tris为三羟甲基氨基甲烷。下同。
大规模表达植物生长调节剂hrfl基因和提取harpinXoo(1)制备原种将高产HarpinXoo的菌株BLHR4于LB+Km20μg/ml的斜面上划线，37℃下培养过夜。(2)制备母种单菌落BLHR4接种于100ml LB+Km20μg/ml中，于37℃，110转/分条件下振荡培养12h。(3)制备栽培种20L发酵罐中加入20L LB+Km25μg/ml培养液，1％量接入母种，37℃，110转/分和0.5L/分通气量的条件下培养12h。(4)大规模发酵1吨发酵罐中1000L的LB灭菌(120℃，2kg压力，30分钟)后通过微孔滤膜加入Km40μg/ml+IPTG 1mM作为发酵液，1％体积接入栽培种，32℃，110转/分和1L/分通气量条件下发酵培养20h，于离心机中4500转/分离心10分钟收集菌体，加入1/40体积20mMTris缓冲液(pH9.0)悬浮菌体，加入1/50体积的PMSF(20mg/ml)，100℃蒸汽破碎菌体10分钟，冷却后喷雾干燥收集产物，加入填充料制成微颗粒制剂，使harpinXoo有效含量达2％(W/W)。1吨发酵液可提取harpinXoo达1.0-1.5kg。
黄单胞菌中的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、水稻细条斑病菌(X.o.pv.oryzicola)、柑桔溃疡病菌(X.citris)、棉花角斑病菌(X.campestris.pv.malvacearum)、苜蓿黄单胞菌(X.c.pv.alfalfae)、桃细菌性穿孔病菌(X.c.pv.pruni)和菜豆疫病菌(X.c.pv.phaseoli)为公知公用菌株。
pET30a载体和大肠杆菌BL21菌株见文献Sambrook J.,Fritsch EF.,and Maniatis T.1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manua1.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press.
实施例2 hrfl基因表达产物harpinXoo的直接使用方法种子处理根据作物种类及其栽培方式，可选择拌种或浸种方式。
浸种将harpinXoo溶于水中，使其终浓度达15-30μg/ml。将种子浸入其中4-6h。浸种适宜催芽的作物种子，如瓜果菜等。将种子从harpinXoo浸种液中取出，进行催芽或播种。出苗一周后，苗增高10％以上，生长量提高10％以上，诱导抗苗期病害的能力与常规化学杀菌剂效果相当。
拌种将种子少许湿润，加入种子量的0.1％的harpinXoo制剂，充分拌匀后播种。出苗后苗齐苗壮，提高对苗期病害的抗性与常规化学农药相当。
蘸根适于移栽定殖的作物，特别是瓜果菜。harpinXoo制剂配制成60μg/ml，将被移栽作物苗的根在harpinXoo溶液中浸根2小时，或带土蘸根一下进行移栽。或者移栽前，用30μg/ml喷雾，三天后移栽。移栽后，植株恢复生长快，缓苗时间缩短，植株长势旺。
叶面喷雾在作物生长季节进行喷雾。将harpinXoo制剂配制成水溶液，终浓度15-30μg/ml，在作物的苗期、分蘖期、初花期、初果期或灌浆期进行喷雾使用。作物生长季节一般喷雾2-3次。喷雾后，可提高作物生长15-30％，提高产量15％以上，诱导作物产生抗病性与常规化学杀菌剂相当。另外还有一定的抗旱能力和驱虫效果。在小麦干热风前期喷雾一次，可显著提高对小麦干热风的能力，作用相当于2％KH2PO4的效果。
实施例3hrfl基因构建重组防病生物体的方法依据pET30a载体上的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点，将hrfl基因(420bp)通过T4DNA连接酶与之连接。连接混合物首先转化大肠杆菌BL21菌株，在LB+Km20μg/ml的平板上获得遗传重组菌株BLHR4。按Sambrook J.,Fritsch EF.,and Maniatis T.等人(MolecularCloning:A Laboratory Manua1.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989.)方法提取含hrfl的重组质粒pEHR4，通过NdeⅠ和BamHⅠ酶切，1％琼脂糖电泳，确定hrfl基因是否连接于载体pET30a上。含有hrfl基因的菌株命名为BLHR4。
按文献(Sambrook J.,Fritsch EF.,and Maniatis T.1989.Molecular Cloning:A LaboratoryManua1.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press.)方法，将含有T7噬菌体RNA聚合酶的λ噬菌体DE3区DNA整合到Erwinia herbicola中，以DE3区DNA为探针，Southern杂交方法确定Erwinia herbicola菌株中是否整合有DE3区DNA。整合有DE3区DNA的E.herbicola菌株用于遗传重组。
按Sambrook J.,Fritsch EF.,and Maniatis T.等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)提取BLHR4中的遗传重组质粒pEHR4，按Choi等人(International Rice ResearchNotes,1994,19(2):31-32)电转化法将pEHR4质粒导入含有λ噬菌体DE3区DNA的Erwinia herbicola中，按Sambrook J.,Fritsch EF.,andManiatis T.等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nded.Cold Spring HarborLaboratory Press.1989)方法提取转化子基因组总DNA，以其为模板用依据hrfl基因设计的引物(5′-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3′和5′-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3′)进行PCR扩增。扩增条件为94℃/4min+(94℃/30sec+60℃/min+72℃/2min)×35循环+72℃/7min。扩增后1％琼脂糖电泳。可扩增出420bp条带的转化子为含有hrfl基因的遗传重组草生欧氏杆菌(Erwinia herbicola)。该遗传重组微生物命名为ErHR4。
ErHR4菌株经在LB+Km20μg/ml+IPTG 1mM/L的培养液中于37℃下振荡培养至对数生长期(＞108cfu/ml)。发酵液于植物上喷雾使用，发现ErHR4除有生防效果外，还能促进植物生长和诱导植物产生抗逆性。
大肠杆菌BL21、草生欧氏杆菌Erwinia herbicola和λ噬菌体，公知公用。
权利要求
1．一种编码植物生长调节剂功能的hrfl基因，其核苷酸序列为EcoRI5’-AT TTTGAACACACAATTCGGCGGCAGCACGTCCAACCTTCAGGTTGGCCCAAGCCAGGACACAACGTTCGGTTCGAACCAGGGCGGCAACCAGGGCATCTCGGAAAAGCAACTGGACCAGTTGCTGTGCCAGCTCATCTCGGCCCTGCTTCAGTCGAGCAAAAATGCTGAGGAG AAG CAG GATAAT CAG AATTCGCAGCAGGCCGGGCAGCAGAATGGCCCCTCGCCATTCACCCAGATGCTGATGCATATCGTCGGAGAGATTCTCCAGGCGCAGAAT GACTTTAGTGGCGACCTCGGCCTCGGCACCAACCTCTCGAGCGACAGCGCATCGATGCAGTAA-3’核苷酸大小为420-432个碱基，其核苷酸序列中的ATG示起始密码子，TAA示终止密码子， 或 示编码甘氨酸(glycine,G)的密码子， 示编码一个GGGF氨基酸残基的单位，在不同黄单胞菌中有不同的重复，一般2～3次，在起始密码子处的 示EcoRⅠ酶切位点。
2．根据权利要求1所述编码植物生长调节剂功能的hrfl基因，其特征在于来源于下列植物病原黄单胞细菌，包括水稻白叶枯病菌、水稻细条斑病菌、野油菜黄单胞苜蓿致病变种、棉花角斑病菌、柑桔溃疡病菌、桃细菌性穿孔病菌和菜豆疫病菌。
3．权利要求1或2所述hrfl基因的表达产物蛋白质harpinXoo，其特征在于，harpinXoo蛋白质亲水性，对热稳定，对蛋白酶敏感，分子量大小14.0kDa，139个氨基酸，等电点为4.3，富含甘氨酸，不含半胱氨酸，氨基酸残基GGGF在黄单胞菌中重复2～3次，3-5μg/ml可诱导植物产生细胞编程死亡，harpinXoo蛋白质的氨基酸序列为 下划线处的氨基酸序列示富含甘氨酸(glycine,G)，GGGF为一个重复单位。
4．权利要求3所述hrfl基因的表达产物harpinXoo使用方法为按浓度为5～100μg/ml的harpinXoo对植物进行叶面注射、喷洒、蘸根或种子处理，在生长季节使用2-3次。
全文摘要
本发明一种编码植物生长调节剂功能的hrfl基因的特征、表达产物及用法,属农业生物技术领域。来自黄单胞菌中的hrfl基因可作为基因资源,用于农业生物技术育种、转基因植物和防治病虫害以及与其它有益基因重组构建用于商业用途的遗传重组体等。hrfl基因产物harpinXoo,还可用于仿生化学工业,模拟合成植物生长调节剂。hrfl基因产物harpinXoo,可直接应用于植物,促进植物生长、提高产量、增强植物抗逆能力和诱导植物产生抗病性和驱虫性。图为hrfl基因序列和hrfl基因编码产物harpinxoo的蛋白质序列特征。
文档编号C12N15/31GK1300547SQ0013540
公开日2001年6月27日 申请日期2000年12月15日 优先权日2000年12月15日
发明者王金生, 闻伟刚, 陆徐忠, 陈功友, 董汉松 申请人:南京农业大学