专利名称：拟南芥基因roi1在植物抗高温胁迫方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种拟南芥基因R0I1的应用，尤其涉及该基因ROI 1在植物抗高温胁 迫方面的应用，同时，还涉及该基因R0I1在培育抗高温胁迫转基因植物品种方面的应用， 属于基因工程领域。
背景技术：
环境温度的变化则是植物必须经常面对的环境胁迫因子之一，温度过高会严重影 响到植物的生长发育以及正常的生理生化过程，是限制农业生产的重要不利因素，比如每 年因干热风等高温胁迫造成农业的大量减产。植物在长期的进化过程中形成了一套抵御 高温胁迫的信号转导调控机制，热激蛋白和热激转录因子参与的调控反应，在植物抗高温 胁迫反应中起着关键的作用；高温胁迫信号转导过程中，热激信号通过不同的途径传递给 HSFs，激活HSFs的转录活性，被激活的HSFs可与HSPs基因上游的特异的序列结合，调节 HSPs的表达和蛋白的积累，具有分子伴侣作用的HSPs可以提高植物的抗高温反应能力。
Ca2+、 H202、 ABA和水杨酸等信号转导系统在植物细胞中广泛存在，它们也参与调节 植物抗高温胁迫反应。在高温胁迫条件下，植物体迅速产生并积累&02，并伴随着高温胁迫 相关基因的被诱导和表达；HSFs可以感受H202信号和启动热激反应，H202处理可以增加植 物的抗高温胁迫反应，因此，认为H202很可能是继HSFs和HSPs之后的重要热激调节分子。 但是人们对整个过程的认识还是不系统、不完善的，中间还存在很多盲区。随着新的研究手 段的建立和相关突变体的筛选和分离，为人们认识植物抗高温胁迫的反应机制提供了新的 支持和研究思路。 高温胁迫往往伴随着干旱和脱水反应，气孔开度变化调节着植物水分的蒸腾散失 和参与植物调节植物的抗高温胁迫反应。植物叶片水分散失带走叶片表面的热能，引起叶 片温度的改变。远红外成像技术可以测定植物叶片表面微弱的温度变化，该技术的快速、高 效和非侵入检测的特点，为大规模筛选与气孔运动调节相关的突变体研究提供了有效技术 保障。其中用此方法筛选得到的ostl和htl突变体，为认识干旱反应过程中的ABA和H202 信号转导机制和C02调节的气孔反应过程提供了遗传学的证据，也为分离和鉴定与植物气 孔运动调节相关抗逆信号分子提供了新的思路。 有实验表明，蚕豆气孔的开度随着环境温度的变化而变化，随着环境温度变化，植 物气孔发生快速的关闭反应，并可诱导保卫细胞质膜内向K+通道开放和外向K+通道关闭， 因此，高温胁迫和气孔开度之间存在一定的调节关系。有关高温与气孔开度变化的机制的 证据目前还很少，可能的原因也许是由于不同温度气孔的反应不一致。这种高温胁迫和气 孔开度之间的复杂关系正是需要我们去认识和研究的内容。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种拟南芥基因R0I1在植物抗高温胁迫方面的应用， 以拓展基因ROIl的应用范围。
同时，本发明的目的还在于提供一种拟南芥基因R0I1在培育抗高温胁迫转基因 植物方面的应用。 为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种超表达拟南芥基因ROIl在植 物抗高温胁迫方面的应用。 所述的基因R0I1为0ST1基因的同源基因，在Genebank中的编号为AT3G33950，该 基因的CDS长度为1089bp，编码362个氨基酸的蛋白，该蛋白为一个蛋白激酶，R0Il蛋白主 要分布在保卫细胞的细胞核内，ROIl和HSFs之间存在相互作用，这种作用与激酶活性和热 激转录调节有关。 同时，本发明的技术方案还采用了一种超表达拟南芥基因R0I1在培育抗高温胁 迫转基因植物方面的应用，将R0I1基因或其中部分片断，以及通过替换、增减碱基后连接 到不同种类载体上，以及通过不同的表达载体转化获得抗高温相关的转基因植物。如构建 由CaMV35S启动子控制的超表达R0I1转基因植株，比较分析转基因植株的表型和R0I1基 因的生物学功能，从分子水平上揭示^02、气孔和热激反应的关系。 本发明利用远红外成像技术，筛选得到了11202和高温胁迫不敏感拟南芥突变体 roil-1和roil-2，克隆得到了 R0I1基因，采用GUS组织定位和GFP融合蛋白的细胞定位方 法，分析ROIl基因的细胞和组织表达特性。 本发明利用酵母双杂交技术筛选得出了 HSF3和R0I1之间存在较强的相互作用， Pull-Down、 spilt-YFP、磷酸化分析的技术为进一步解释了 HSF3和R0I1的作用关系，确立 了 R0I1可以和HSF3相互作用，通过调节R0I1自身和HSF3蛋白的磷酸化水平，影响GOLsl 基因的表达水平，调节植物的抗热激反应能力。 本发明编号为At4g33950的ROIl (Reactive Oxygen specieslnsensitivel)基因 编码一个蛋白激酶，该基因为抗旱相关的0ST1的同源基因，主要定位在保卫细胞的细胞核 内，与热激转录因子HSF3作用，调节HSF3和ROI1自身的磷酸化水平，调节植物的抗高温反 应；同时也影响高温胁迫引起的H202的产生和植物体内活性氧的积累。超表达R0I1基因 可以提高植物的抗高温胁迫特性。该基因的第1221碱基和第一个内含子的第一个碱基突 变，可以抑制ROIl的功能，降低植物突变体性氧的产生和活抗高温胁迫的能力。本发明通 过对R0I1基因的分离和基因能功能的分析鉴定，确立了 R0I1在植物抗高温胁迫中的作用 及其调节机制，为培育抗高温胁迫的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。
本发明从拟南芥抗高温胁迫敏感突变体中克隆得到能够调节植物抗高温胁迫反 应的基因ROIl，为获得抗高温胁迫作物新品系提供了遗传学材料和基础。
本发明通过远红外成像技术，筛选得到了对高温和氧化胁迫敏感的拟南芥突变体 roil，分离得到了 R0I1基因；实验表明拟南芥ROIl基因被高温胁迫诱导表达，调节植物 体内H202的产生，并与热激转录因子HSF3结合，通过磷酸化调节的方式调节HSF3的活性和 下游信号分子，调节提高植物的抗高温胁迫反应。R0I1的功能的分析和鉴定为获得抗高温 胁迫植物新品种提供了理论和方法的基础。
图1为高温胁迫对突变体roil-1死亡的影响； 图2为超表达R0I1基因拟南芥和T-DNA插入R0I1基因拟南芥突变体的鉴定和表
4型分析； 图3为HSF3调控ROI1的抗高温反应能力。 其中图1中(A)野生型拟南芥，(B)roil-l突变体，(C)高温胁迫引起的拟南芥死 亡率统计。 图2中，(A)定量PCR分析R0Il基因在野生型、roil-l和roil-2突变体以及超表 达(R0I1-0E)植株中的表达；(B)高温胁迫条件下roil-l/T-DNA突变体、roil-l突变体和 R0I1超表达植株(R0I1-0E)抗高温特性。 图3中，(A)热处理前R0Il基因突变体roil-l、HSF3基因突变体hsf3，双突变体 roil-l/hsf3以及野生型WT的表型；(B)热处理2小时后R0I1基因突变体roil-l、HSF3基 因突变体hsf3，双突变体roil-l/hsf3以及野生型WT的表型。
具体实施方式
实施例1 高温胁迫和氧化相关突变体的筛选和突变基因的克隆 如图1所示，在H202处理条件下，通过远红外成像仪对EMS诱变拟南芥突变库进 行筛选，得到叶片温度明显升高的ROS胁迫相关的两株突变体，我们将两株突变体分别命 名为roil-l禾口 roil-2 (reactive oxygen speciesinsensitive) 。 45。C高温胁迫处理2h， 通过远红外分析发现roil-l和roil-2叶片温度明显低于野生型，高温胁迫引起roil-l 和roil-2叶片萎蔫和死亡，因此，roil-l和roil-2突变体是对H202和高温胁迫都不敏感 (insensitive)的拟南芥突变体。图位克隆分析表明，roil-l和roil-2是At4g33950基因 发生不同位点的突变产生的突变体。
实施例2 R0I1基因的体内表达和定位分析 从拟南芥基因组中利用PCR扩增分离得到的R0I1的启动子区序列和CDS序列，克
隆得到pCAMBIA1381的GUS报告载体和pEGAD的GFP细胞定位载体，转化拟南芥植株并获
得转基因阳性植株。GUS组织化学染色和荧光定位分析表明，R0I1主要分布在维管和保卫
细胞细胞核中，这可能与该基因控制的叶片失水和调节气孔的反应相关。表明ROIl的作用
可能与气孔运动调控的抗高温胁迫有关。 实施例3 R0I1基因的功能分析 如图2所示，利用PCR扩增分离得到的ROI 1的CDS全长编码序列，构建
pCAMBIA1205-R0Il超表达载体，农杆菌侵染法转化和筛选转基因阳性植株。 从拟南芥资源中心(Nottingham Arabidopsis Stock Centre NASC)索要ROIl的
T-DNA插入突变体SALK_008068 (E) (0)。 超表达植株R0I1-0E的表型分析表明，ROIl基因超表达植株(R0I1-0E)可以抵抗 45。C高温处理24h，而roil-l突变体和R0I1的T-DNA插入突变体在45。C高温处理24h，植 物已经完全枯萎。因此，R0I1基因的表达可以提高植物的抗高温胁迫能力。
实施例4 R0I1基因与热激转录因子HSF3的作用分析
如图3所示，我们用酵母双杂交和Pull-Down技术分析了 R0I1和HSFs之间的作 用关系，结果表明，ROI1可以和热激转录因子HSF3发生相互作用，而与HSF1 、 HSF4等热激 转录因子之间不存在相互作用。Spilt-YFP分析表明，ROIl和HSF3之间在体内也存在较强 的相互作用，其作用位点为细胞核。 我们利用原核表达蛋白R0I1-GST和HSF3-6HIS进行体外磷酸化分析表明，R011不 仅可磷酸化通用底物MBP，同时也有较强的自身磷酸化能力，HSF3蛋白可以抑制R0I1的磷 酸化和自身磷酸化反应，且HSF3的抑制作用与HSF3的量直接相关，加入两倍的HSF3蛋白 对ROIl的自身磷酸化抑制作用明显强于加入一倍的HSF3蛋白的抑制作用。因此，HSF3和 R0I1之间相互作用的过程中，HSF3通过抑制R0I1的磷酸化调节植物的抗高温反应。HSF3
作为转录因子调节热激反应过程中的热激蛋白的合成。
实施例5 hsf3、 roil和roil/hsf3双突变体的高温胁迫表型分析 通过45t:高温胁迫处理分析表明，T-DNA插入hsf 3突变体表现出抗高温胁迫能 力，其抗性大于野生型。在roil和hsf3突变体中，hsf3具有很强抵抗高温胁迫能力。
我们通过遗传杂交和DNA测序的方法，将hsf3突变体和roil杂交，获得了 roil/ hsf3双突变体杂交植株。在正常条件下，roil/hsf3和野生型拟南芥植株没有明显的区别； 但在45t:高温胁迫条件下，roil/hsf3表现出类似于roil-l的高温不敏感的症状，roil/ hsf3的抗高温胁迫能力比野生型弱；而hsf3的表现的最强的抗高温胁迫能力。
权利要求
一种拟南芥基因ROI1在植物抗高温胁迫方面的应用。
2. 根据权利要求1所述的超表达拟南芥基因ROI1在植物抗高温胁迫方面的应用，其特 征在于所述的基因R0I1为0ST1基因的同源基因，在Genebank中的编号为AT3G33950，该 基因的CDS长度为1089bp，编码362个氨基酸的蛋白。
3. 根据权利要求1或2所述的超表达拟南芥基因ROI1在植物抗高温胁迫方面的应用， 其特征在于ROIl参与HSF3、H202相关植物抗高温反应过程。
4. 一种拟南芥基因ROI1在培育抗高温胁迫转基因植物方面的应用。
5. 根据权利要求4所述的拟南芥基因R0I1在培育抗高温胁迫转基因植物方面的应用， 其特征在于将ROI1基因或其中部分片断，以及通过替换、增减碱基后连接到不同种类载 体上，以及通过不同的表达载体转化获得抗高温相关的转基因植物。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥基因ROI1在植物抗高温胁迫方面的应用。本发明筛选得到了对高温和氧化胁迫敏感的拟南芥突变体roi1，分离得到了ROI1基因；实验表明拟南芥ROI1基因被高温胁迫诱导表达，调节植物体内H2O2的产生，并与热激转录因子HSF3结合，通过磷酸化调节的方式调节HSF3的活性和下游信号分子，调节提高植物的抗高温胁迫反应。ROI1的功能的分析和鉴定为获得抗高温胁迫植物新品种提供了理论和方法的基础。
文档编号A01H5/00GK101781659SQ200910064138
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月21日 优先权日2009年1月21日
发明者刘浩, 安国勇, 宋玉伟, 宋纯鹏, 王棚涛, 薛小波, 赵孝亮 申请人:河南大学