生物分子的选择性放射性标记的制作方法

专利名称：生物分子的选择性放射性标记的制作方法
生物分子的选择性放射性标记
背景技术：
将氟原子，特别是放射性氟原子引入到包含氨基酸残基的生物分子上的方法是相 当令人感兴趣的。但是，因为放射性氟原子，例如18F,具有大约110分钟的相当短的寿命， 因此需要时间有效的方法来将放射性氟引入到生物分子上。一直需要一种有效的和位置特定的方法来将氟原子(包括放射性氟原子)引入到 生物分子上。

发明内容
在一方面，公开了将氟原子引入到生物分子例如多肽上的方法。该方法可以包含 (i)提供连接剂，该连接剂包括硫醇反应性末端和叠氮基/炔反应性末端；(ii)将该连接剂 的硫醇反应性末端与包含至少一个硫醇基团或者其反应性衍生物的生物分子进行反应；和 (iii)随后将该连接剂的叠氮基/炔反应性末端与氟取代的叠氮化物或者炔基分别进行反应。在另一方面，提供了一种将一个或多个氟原子引入到生物分子上的方法。该方法 包含⑴将Mal-炔双官能连接剂例如N-(丁-3-炔)-3-(2，5_ 二氧-2，5-二氢-IH-吡 咯-1-基)丙酰胺连接剂(1)的硫醇反应性基团与包含至少一个硫醇基团的生物分子进行 反应；和(ii)随后将该连接剂的炔基与氟取代的叠氮化物进行反应。在仍然的另外一方面，提供了生物结合物(bioconjugate)，包含衍生自下面的结 构单元(i)包含至少一个硫醇基团的生物分子；和(ii)连接剂。该连接剂可以通过这样 一种方法来制备的，该方法包含将包含叠氮基或者炔反应性官能基团的胺化合物与包含硫 醇反应性官能基团的羧酸或者活化的酯进行反应。在另一方面，该连接剂可以通过将包含 硫醇反应性官能基团的胺化合物与包含叠氮基或者炔反应性官能基团的羧酸或者活化的 酯化合物进行反应来制备。在仍然的另一方面，在本文中提供了使用所述方法制备的生物结合物，连接剂，和 生物分子。在另一方面，提供了连接剂的复合物(compositions)。


当参考附图来阅读下面的详细说明时，本发明的这些方面和优点将变得更清楚， 在附图中，同样的附图标记在整个附图中表示同样的部件，其中图1表示了非最优化的系统的反应混合物的HPLC分析，其表示了 18F click标记 的抗-Her2亲和体(27) (a,放射性通道；b, 280nm的UV通道)。图2表示了含有2-[18F]氟乙基叠氮化物(11)的反应混合物的HPLC分析，该分 析使用梯度I，216nm的UV (a，放射性通道，2-[18F]氟乙基叠氮化物(11)在3 :51min ；b, UV 通道)。蒸馏的产物显示仅仅存在着2-[18F]氟乙基叠氮化物(11) (c，放射性通道；d，UV通 道)。
图3表示了使用模块化合物(16)和2_[18F]氟乙基叠氮化物(11)，在不同的炔 (16)浓度和温度所形成的三唑产物(17)的放射化学产率的HPLC图。图4表示了炔基化的亲和体(22)的MALDI-TOF MS数据。图5表示了在炔基化的亲和体(22)和Cy5标记的叠氮基PEG(25a)之间的click 结合物的SDS-PAGE蛋白质凝胶。当存在Cu1源和还原剂时，在期望分子量的结合物产物 (26)时观察到Cy5染料的荧光发射。在不存在任何这些的对照试验中，没有观察到结合的 产物的存在。
具体实施例方式下面的详细说明是示例性的，目的并非限制本发明应用和本发明的用途。此外，本 发明不受限于前述发明背景或者下面的详细说明中所展示的任何理论。为了更清楚和简明的描述和指出所请求保护的本发明的主题，提供了下面的定义 来用于在下面的说明书及其附加的权利要求中所用的具体术语。除非另有明确的指示，单 数形式“一种(a/an)，，和“该/所述(the)，，包括复数指示。作为此处使用的，术语“活化基团”指的是任何这样的基团，其使得羰基基团朝着 亲核试剂(nucleophiles)具有更大的反应性，该亲核试剂是例如N-羟基琥珀酰亚胺，磺 基-N-羟基琥珀酰亚胺，酰基氯和脲中间体。作为此处使用的，术语“叠氮基反应性末端”和/或“叠氮基反应性官能基团”指 的是任何能够与叠氮化物官能基团进行反应的官能基团。叠氮基反应性官能基团的一些例 子包括但不限于炔类(alkynes)，丙二烯类(allenes)和膦类(phosphines)。作为此处使用的，术语“炔反应性末端”和/或“炔反应性官能基团”指的是任何能 够与炔官能基团进行反应的官能基团。炔反应性官能基团的例子包括但不限于叠氮化物， 其能够在Cu1源(包括但不限于Ci^Ci^Cu11)和还原性试剂(例如抗坏血酸钠)的存在下 进行反应。作为此处使用的，术语“脂肪族基”或者”脂肪族基团”通常指的是碳原子的阵列 (array)，其不是环状的，并且具有sp3碳原子的连接点。该碳原子的阵列可以进一步包含 SP3, Sp2或者sp杂化的碳原子的任意组合。此外，该碳原子的阵列可以是单价的，二价的或 者三价的。烷基基团的例子包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异辛基，苄基， 环己基甲基，和苯乙基，1'，1' - 二甲基苄基。作为此处使用的，术语“芳香族基”或/和“芳香族基团”指的是SP2杂化碳原子和 共轭的碳_碳双键的环状阵列，并且具有在芳族SP2杂化碳原子处的连接点，其形成了该环 状阵列碳原子的一部分。该芳香族基(团)可以具有从1到最大允许数目的取代基。芳族 基团的例子包括苯基，取代的苯基，甲苯基，取代的甲苯基，二甲苯基，2，4，6_三甲苯基，氯 苯基，萘基，呋喃基，噻吩基，和吡咯基。作为此处使用的，术语“环烷基”或者“环烷基基团”指的是环状阵列的sp3杂化碳 原子，并且具有在SP3杂化碳原子处的连接点，其形成了该环状阵列碳原子的一部分。该碳 原子阵列可以进一步包含sp3，SP2或者SP杂化碳原子的任意组合。此外，该环状阵列的碳 原子可以用1到最大允许数目的取代基进行取代。此外，该阵列的环状原子可以包含杂原 子，例如0，N，或者S。环烷基基团的例子包括环己基，甲基环己基，三甲基环己基，苯基环己基，四氢吡喃基，4-硫杂环己基，和环辛基。术语“能够与硫醇基团进行硫醇交换反应的二硫化物基团”指的是能够与生物分 子的硫醇基团进行反应的基团。因此，二硫化物可以被认为是硫醇反应性基团。吡啶基二 硫化物是这样的二硫化物的一个例子。作为此处使用的，术语“氟取代的叠氮化物”表示具有至少一个氟取代基的包含叠 氮化物的化合物。此外，该氟取代基可以是任何的同位素变体，例如诸如18F和19F。在一种 实施方案中，该氟取代基是18F。该叠氮化物可以是脂肪族叠氮化物，脂环族叠氮化物或者 芳香族叠氮化物。此外，该脂环族叠氮化物和芳香族叠氮化物可以具有单环，双环或者多环 结构。作为此处使用的，术语“氟取代的炔”表示具有至少一个氟取代基的含有炔的化合 物。此外，该氟取代基可以是任何的同位素变体，例如诸如18F和19F。在一种实施方案中， 该氟取代基是18F。该炔可以是脂肪族炔，脂环族炔或者芳香族炔。此外，该脂环族炔和芳 香族炔可以具有单环，双环或者多环结构。作为此处使用的，术语“蛋白质”，“肽”和“多肽”在此用来描述氨基酸的任何链， 而不管长度或者翻译后修饰例如糖基化或者磷酸化。因此，该术语可以在此交替的用来表 示氨基酸残基的聚合物。该术语还用于这样的氨基酸聚合物，在其中一种或多种氨基酸残 基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟品。因此，术语“多肽”包括全长的天然存在 的蛋白质以及重组的或者合成产生的多肽，其对应于全长的天然存在的蛋白质或者对应于 天然存在的蛋白质的特定域或者部分。应用于术语“烷基”，“脂肪族”，“脂环族”和“芳香族”的术语“基”和“基团”在此
是交替使用的。作为此处使用的术语“硫醇反应性末端”和/或“硫醇反应性官能基团”指的是能 够与硫醇基团(即，-SH基团)进行反应的官能基团。硫醇反应性官能基团的例子包括但不 限于马来酰亚胺基团，卤代脂肪族基团，卤代芳香族基团，卤代脂环族基团，(卤代乙酰基) 烷基基团，(卤代乙酰基)环烷基基团，(卤代乙酰基)芳族基团，α，β-不饱和砜基团，乙 烯基砜基团，α，β-不饱和羰基基团，环氧基团，氮丙啶基团，和能够与硫醇基团进行硫醇 交换反应的二硫化物基团。合适的马来酰亚胺基团包括母(未取代的)基团以及衍生物，该衍生物包含脂肪 族，脂环族或者芳香族基团作为取代基。合适的α，不饱和羰基基团包括包含丙烯酰基 团的那些。合适的α，β-不饱和羰基基团包括α，β-不饱和酯和α，β-不饱和砜。乙 烯基砜基团是α，β-不饱和砜基团的一个具体的例子。除非另有指示，否则在说明书和权利要求中的全部表示成分，性质例如分子量，反 应条件等等的量的数字被理解为在所有的情况中是用术语“大约”进行修正的，因此除非另 有相反的指示，否则在下面的说明书和附加的权利要求中所述的数字参数是近似的，其可 以根据本发明所期望的获得的性能来变化。最起码的，并且目的并非是限制将等价的原则 应用于权利要求的范围，每个数字参数至少应当按照所报道的有效数字的数值和通过使用 通常的四舍五入技术来进行解释。本发明的方面涉及一种将氟原子引入到生物分子上的方法。该方法包括步骤(i)提供连接剂，该连接剂包括硫醇反应性末端和叠氮基或者炔反应性末端；
(ii)将该连接剂的硫醇反应性末端与包含至少一个硫醇基团或者其反应性衍生 物的生物分子进行反应；和(iii)随后将该连接剂的叠氮基或者炔反应性末端与氟取代的叠氮化物或者炔基 分别进行反应。本发明的另一方面是提供一种生物结合物复合物(compositions)，其包含衍生自 下面的结构单元包含至少一个硫醇基团的生物分子和连接剂。该连接剂可以通过这样一 种方法来制备，该方法包含将包含叠氮基或者炔反应性官能基团的胺化合物与包含硫醇反 应性官能基团的羧酸或者活化的酯进行反应。在另一方面，该连接剂可以通过将包含硫醇 反应性官能基团的胺化合物与包含叠氮基或者炔反应性官能基团的羧酸或者活化的酯化 合物进行反应来制备。生物分子作为此处使用的，术语“生物分子”指的是天然存在的或者工程化的分子，其包含 至少一个硫醇基团(有时候也称作“巯基”基团)或者其反应性衍生物，用于与连接剂进行 反应。该硫醇基团可以天然的存在于生物分子中或者可以使用标准生物学方法或者合适的 本领域公认的方法而化学引入或者工程化。在一些实施方案中，该生物分子明确的排除具 有小于50个氨基酸残基。这样的生物分子可以在它们的天然状态时具有一个或多个SH基团，或者它们可 以是工程化的，例如使用标准分子生物技术来工程化的。天然具有SH基团的生物分子的例 子包括连接到一个或多个半胱氨酸氨基酸的那些。术语“其反应性衍生物”表示SH基团的 衍生物，其被活化以便产生用于与连接剂化合物反应的游离硫醇基团。生物分子(其包含一个或多个天然硫醇基团或者化学工程化的硫醇基团)的例子 包括肽，多肽，媒介物，脂质，多糖，糖胺聚糖及其改性物，糖脂，糖蛋白，合成聚合物，细胞响 应调节剂，(例如，生长因子，趋化因子或者细胞因子)，酶，受体，神经传递素，荷尔蒙，细胞 因子，疫苗，半抗原，毒素，干扰素和核酶。所公开的方法还可以应用于这样的分子，其不包 含硫醇基团，但是共轭到包含硫醇基团的分子上。生物分子另外的例子包括蛋白质，蛋白质 片段，蛋白质变体，支架基蛋白质，工程化蛋白质，核苷酸和相关分子，核酸，寡聚DNA或者 寡聚RNA肽结合物，抗体例如多克隆和单克隆抗体，和基于抗体的片段。因此，所公开的方 法能够用于氟化核酸，包括脱氧核糖核酸(例如寡聚脱氧核苷酸，核酸探针，质粒)，与含有 硫醇的分子(例如具有硫醇基团的多肽)相关连的核糖核酸(例如siRNA)。该生物分子可以是具有至少一个硫醇基团的任何天然存在的或者工程化的生物 分子。在全部的实施方案中，该生物分子可以包括天然存在和/或非天然的氨基酸残基。在 另外一种实施方案中，该包含至少一个硫醇基团的生物分子包含半胱氨酸残基或者非天然 的基团。术语“半胱氨酸残基”是指在将半胱氨酸作为生物分子链一部分包括在内之后产 生的除了硫醇基团之外的结构片段。在仍然的另外一种实施方案中，用于与连接剂反应的 生物分子是具有工程化半胱氨酸残基的分子，这意味着可以对合适的前体生物分子进行化 学改性来产生具有硫醇基团和半胱氨酸残基的期望的生物分子。在一些情况中，生物分子可以用还原剂处理来产生反应性硫醇基团。例如，具有 二硫化物连接基的生物分子可以用合适的还原剂还原，来产生两当量的具有硫醇基团的 生物分子。有用的还原剂的例子包括2-巯基乙醇，2-巯基乙醇胺，二硫苏糖醇(DTT)和三-(2-羧乙基)膦(TCEP)。连接剂作为此处使用的，术语“连接剂”指的是双官能化合物，其包含硫醇反应性末端或 者其受保护的衍生物，和叠氮基或者炔反应性末端或者其受保护的衍生物。该连接剂可以 用来通过硫醇反应性末端在一端连接到含有硫醇的化合物，和分别通过叠氮基或者炔反应 性末端在另一端连接到叠氮化物或者炔，特别是氟取代的叠氮化物或者炔。作为此处使 用的，术语“Mai-炔双官能连接剂”指的是这样的连接剂，其在第一末端具有马来酰亚胺 基团和在第二末端上具有炔基，例如N-(丁 -3-炔基)-3-(2，5- 二氧-2，5- 二氢-IH-吡 咯-1-基)丙酰胺连接剂(1)，“Mai-叠氮化物双官能连接剂”指的是这样的连接剂，其在 第一末端上具有马来酰亚胺基团和在第二末端上具有叠氮化物基团，例如化合物(2)。连接 剂的一些非限定性的例子表示在结构(1)_(6)中。
(6)在一些实施方案中，硫醇反应性末端，叠氮基或者炔反应性末端，或者硫醇反应性 末端和叠氮基或者炔反应性末端二者可以用前体衍生物来代替。该连接剂可以用来通过硫 醇反应性末端在一端连接到含有硫醇的化合物，和/或分别通过叠氮基或者炔反应性末端 在另一端连接到叠氮化物或者炔(例如氟取代的叠氮化物或者炔)。连接剂制备该连接剂可以通过任何这样的方法来制备，该方法使得硫醇反应性官能基团和叠 氮基或者炔反应性官能基团能够用于分别与(i)具有至少一个硫醇基团的生物分子，和 (ii)氟取代的叠氮化物或者炔进行反应。在一种实施方案中，该连接剂是通过将包含叠氮 基或者炔反应性官能基团的胺化合物与包含硫醇反应性官能基团的羧酸或者活化的酯进 行反应来制备的。可以使用任何的具有叠氮基或者炔反应性官能基团的胺化合物。在一种 实施方案中，该胺化合物包含结构(7)，G-J-NHR1(7)
其中G是叠氮基或者炔反应性官能基团，J是连接单元，R1是H，脂肪族基团，芳香 族基团或者脂环族基团。二价连接单元J的性质可以设计来使得空间位阻最小，该位阻会 对硫醇反应性和叠氮基或者炔反应性官能基团的反应性产生不利影响。本方案的一个优点 是连接单元可以设计调整来改变生物结合物的最终性能。因此，该连接剂可以在大小，极 性，电荷和化学成分方面进行改变，来改变最终的结合物的性能，例如溶解性和药物动力学 /药效学(PK/PD)性能。此外，该连接剂可以包括用于基团连接的另外的处理，这将提高目 标性和/或溶解性。在其他的实施方案中，该连接剂可以将包含硫醇反应性官能基团的胺化合物与包 含叠氮基或者炔反应性官能基团的羧酸或者活化的酯化合物来制备。该羧酸或者活化的酯包含结构(8)，L-M-COR2(8)其中L包含硫醇反应性官能基团，或者其受保护的衍生物；M是二价连接单元，R2 是OH或者活化基团。该活化基团R2促进了具有叠氮基或者炔反应性官能基团的胺化合物 与结构(8)的羰基碳原子的反应。在另外一种实施方案中，该连接剂复合物(compositions)包含式L-M-CO-NH (R1) -J-G，其中L是硫醇反应性官能基团；M和J是双官能单元/连接单元；R1是H，脂肪族基团，芳香族基团或者脂环族基团；和G是叠氮基或者炔反应性官能基团在反应方案1和2中表示了用于制备具有结构(1)和(2)的连接剂的示例性合成方案。反应方案1 在反应方案1和2中，DMF代表了二甲基甲酰胺，DIEA代表了二-异丙基乙基胺。 能够使用这些方法来制备的连接剂的一些例子表示在上面的结构(1)_(6)中。生物结合物由连接剂与具有至少一个硫醇基团的生物分子反应而形成的产物被称作生物结 合物。因此在一种实施方案中，该生物结合物包含衍生自下面的结构单元(i)包含至少一 个硫醇基团的生物分子；和(ii)连接剂；其中该连接剂是通过这样的方法来制备的，该方 法包含将包含叠氮基或者炔反应性官能基团的胺化合物与包含硫醇反应性官能基团的羧 酸或者活化的酯进行反应。在另外一种实施方案中，该生物结合物包含衍生自下面的结构 单元(i)包含至少一个硫醇基团的生物分子；和(ii)连接剂；其中该连接剂是通过这样 的方法来制备的，该方法包含将包含硫醇反应性官能基团的胺化合物与包含叠氮基或者炔 反应性官能基团的羧酸或者活化的酯进行反应。在另一方面，该连接剂可以通过将包含硫 醇反应性官能基团的胺化合物与包含叠氮基或者炔反应性官能基团的羧酸或者活化的酯 化合物进行反应来制备。氟化生物结合物的方法此处所述的方法能够制备氟标记的生物结合物，更具体的是放射性氟(例如18F)标记的生物结合物。这些方法的一个优点是连接剂可以选择性连接到生物分子例如在非放 射性条件下的生物分子上，其中该生物分子的硫醇基团能够选择性地与连接剂的硫醇反应 性官能基团进行反应，并且所形成的生物结合物可以在与18F或者通常的氟取代的叠氮化 物或者炔进行反应之前进行净化。另外一个优点是该放射性氟标记可以在最后的步骤中选 择性地加入，这消除了在制备最终的生物结合物之前另外的净化步骤所需的时间消耗，特 别是在痕量水平时。此处所述的用于将氟引入到生物结合物上的方法可以用来产生任何长度的氟化 的生物结合物。因此，在一些实施方案中，该生物结合物的生物分子包含了至少50个氨基 酸残基或者至少100个氨基酸残基。在一方面，公开了一种用于将一个或多个氟原子引入到生物分子上的方法。该方 法可以包含(i)提供连接剂，该连接剂包括硫醇反应性末端和叠氮基或者炔反应性末端； (ii)将该连接剂的硫醇反应性末端与包含至少一个硫醇基团或者其反应性衍生物的生物 分子进行反应；和(iii)随后将该连接剂的叠氮基或者炔反应性末端与氟取代的叠氮化物 或者炔基分别进行反应。在该用于将氟原子引入到生物分子例如多肽上的方法的一些实施方案中，连接剂 的硫醇反应性末端选自马来酰亚胺基团，卤代脂肪族基团，卤代芳香族基团，卤代脂环族基 团，(卤代乙酰基)烷基基团，(卤代乙酰基)环烷基基团，(卤代乙酰基)芳族基团，乙烯 基砜基团，丙烯酰基团，环氧基团，氮丙啶基团和能够与硫醇基团进行硫醇交换反应的二硫 化物基团。更具体的，此处所述的方法能够用于使用Mal-炔双官能连接剂例如N- (丁 _3_炔 基)-3-(2，5-二氧-2，5-二氢-IH-吡咯-1-基)丙酰胺⑴作为连接剂，来将一个或多个 氟原子引入到生物分子上。这样的方法包含(i)将N-(丁 -3-炔基)-3-(2, 5- 二氧-2， 5-二氢-IH-吡咯-1-基)丙酰胺(1)的硫醇反应性基团与包含至少一个硫醇基团的生物分 子进行反应；和(ii)随后将步骤(i)所形成的中间体产物的炔基团与氟取代的叠氮化物进 行反应。在另外一种实施方案中，该方法可以用于使用Mal-叠氮化物双官能连接剂例如化 合物(2)作为连接剂，来将一个或多个氟原子引入到生物分子上。这样的方法包含(i)将 化合物(2)的硫醇反应性官能基团与包含至少一个硫醇基团的生物分子进行反应；和(ii) 随后将步骤(i)所形成的中间体产物的叠氮化物基团与氟取代的炔进行反应。连接剂的叠氮基或者炔反应性末端与氟取代的叠氮化物或者炔的反应可以在任 何的介质中进行，该介质可以处于适度的酸性到适度碱性条件的范围内。在一种实施方案 中，该反应可以在PH为大约6-大约9的介质中进行；和在另外一种实施方案中，在PH为大 约7-大约8的介质中进行。反应温度可以从环境温度到大约70°C变化。反应时间可以变 化，但是通常可以是大约10分钟-大约60分钟。在一些实施方案中，反应时间是从大约10 分钟-大约30分钟变化的。但是，也可以使用更长的反应时间。该反应可以在Cu1或者其 前体，包括但不限于Cu°，Cu1或者Cu11盐的存在下，在还原剂例如但不限于抗坏血酸钠的存 在下进行。反应方案3和4表示了用于制备氟标记的生物结合物(9)和(10)的可能的方 案。反应方案3反应方案4 在一种方案中，含有炔或者叠氮化物的连接剂的前体可以首先与包含硫醇基团的 多肽进行反应，将所形成的中间体转化来产生期望的生物结合物。可选择的，含有炔或者叠 氮化物的连接剂的前体可以首先转化来产生连接剂，其然后可以与包含硫醇基团的多肽反 应来产生产物。使用上述的技术，可以将氟或者放射性氟原子例如18F引入到生物分子上当氟取 代的叠氮化物或者炔与生物结合物反应时，产生了氟取代的生物结合物。当放射性氟取代 的叠氮化物或者炔与该生物结合物反应时，产生了放射性氟标记的生物结合物。合适的氟 取代的叠氮化物/炔非限定性的例子表示在结构(11)_(14)中。
(11)前述的具有至少一个硫醇基团的任何的生物分子例如多肽可以用来制备生物结 合物。具有至少一个硫醇基团的生物分子例如多肽，媒介物，支架基蛋白质和工程化的结 合蛋白质是特别有价值的，因为这样的材料具有潜在的有价值的诊断和治疗价值。因此在 一种实施方案中，生物结合物可以通过将支架基蛋白质例如亲和体与Mal-炔双官能连接 剂例如N-(丁-3-炔基)-3-(2，5-二氧-2，5-二氢-IH-吡咯-1-基)丙酰胺连接剂(1) 反应来生产。在另外一种实施方案中，生物结合物可以通过将支架基蛋白质例如亲和体与 Mal-叠氮化物双官能连接剂例如化合物(2)反应来生产。此外，有价值的氟标记的生物结 合物可以通过将生物结合物与氟取代的叠氮化物或者炔反应来生产。该氟标记的生物结合物在诊断应用方面是有价值的材料。使用本领域已知的成像 技术例如诸如PET (正电子发射断层照相术)技术能够显现18F标记的生物结合物。虽然在此仅仅说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域技术人员能够想到许 多的改进和变化。因此，应当理解附加的权利要求的目的是覆盖全部这样的属于本发明主 旨中的改进和变化。实施例本发明的实践从下面的实施例中将能够更充分的理解，其在此提出仅仅是用于说 明的目的，并且绝对不应当解释为对本发明的限制。实施例部分中所用的缩写解释如下“mg” 毫克；“mL” 毫升；“mg/mL” 毫克每毫 升；"mmol"毫摩尔；"μ L” 微升；"KDa"千道尔顿；“MALDI-MS，，基质辅助激光解吸电离 质谱；“HPLC”:高压液相色谱；“LC-MS”液相色谱质谱，“ESI-MS”电喷电离质谱，“MALDI-T0F MS”基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，“TFA”:三氟乙酸；“DMS0”二甲基亚砜；“DTT”: 二硫苏糖醇；“MeCN”乙腈，“PBS”:磷酸缓冲盐水，“Mai”:马来酰亚胺；“ppm”每百万份的份 数，"MWC0 截留分子量；“冷条件”没有放射性同位素；和“放射性化学产率”初始存在的 活性的分数。除非另有指示，否则全部的试剂级化学品是市购直接使用的，并且微孔过滤的 水被用于全部水溶液的制备中。
实施例1 :2-[18F]氟乙基叠氮化物(11)的制备 反应方案5[18F]-氟化物是使用具有富集的[180]H20靶的19MeV质子辐射的180(p，n)18F核反 应，通过回旋加速器来生产的。在该辐射之后，将Kryptofix (5mg，13. 3μπι01)，碳酸钾 (lmg,7. 2ymol)和MeCN(ImL)的混合物加入到该18F-水(ImL)中。将溶剂通过在氮气物流 (lOOmL/min)下在80°C加热而除去。然后，加入MeCN(0. 5mL)，并且在加热和氮气物流下蒸 发。将这个程序重复两次。在冷却到室温之后，加入甲苯磺酸-2-叠氮基乙基酯(15)在无 水MeCN(0. 2mL)中的溶液。将该反应混合物在80°C搅拌15min。在加入MeCN(0. 3mL)之后， 将2-[18F]氟乙基叠氮化物(11)在130°C在氮气流(15mL/min)下蒸馏到含有MeCN(0. ImL) 的捕集瓶中。收集该化合物(11)，并且衰减校正的放射化学产率是54% (关于18F-氟化 物)，蒸馏效率是63%。图2表示了反应混合物的HPLC分析结果，该混合物含有2_[18F]氟乙基叠氮化物 (11)(其使用梯度I，216nm的UV (a,放射性通道，在3 :51min的2-[18F]氟乙基叠氮化物 (11) ；b，UV通道))和蒸馏产物2-[18F]氟乙基叠氮化物(11) (c，放射性通道；d，UV通道)。
实施例2 浓度研究，显示了在不同浓度的小基物时三唑的形成t
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反应方案6 在该浓度研究中，将炔模块(16) (1. 2-0. Olmg, 7. 5-0. 25 μ mol)溶解在 DMF(50 μ L)中，并且在氮气下与硫酸铜(II) (25 μ 1,2. 8mg，ll. 25 μ mol)和抗坏血酸钠 (25yL,7. 5mg,37.5ymol)的水溶液进行混合。在加入[18F]2-氟乙基叠氮化物(11)/ MeCN(IOOyl)并且在室温放置15min之后，将该混合物通过HPLC进行分析。将所述的小瓶 随后加热(15min，80°C )和再次分析。所形成的三唑产物(17)是以定量的产率，在室温用3. HmM(IOOyg)的最小炔模 块(16)浓度来获得的。当将反应混合物在80°C加热时，对于一定量产率的所形成的三唑 (17)而言，最小的炔模块(16)浓度是1. 57mM(50yg)。图3表示了在不同的炔(16)浓度和温度，使用模块化合物(16)和2_[18F]氟乙基 叠氮化物(11)所形成的三唑产物(17)的放射化学产率的HPLC图。实施例3 在肽上形成三唑[18F] (S) -6-氨基-2- (2- {(S) _2_ [2_ ((S) _6_ 氨基 _2_ {[4_ (2_ 氟乙基)-[1，2，3] 三唑-1-羰基]-氨基} _己酰基氨基)-乙酰基氨基]-3-苯基-丙酰基氨基}-乙酰基氨 基)_己酸(19)的制备 反应方案7在氮气下，向五水硫酸铜(II) (4. 3mg，17ymol)/水(50 μ L)溶液中加入抗坏血 酸钠(3.4mg，17ymol)/水(50 μ L)溶液。在室温大约1分钟之后，加入炔肽前体(18)的 溶液(2π^，3.4μπι01，在磷酸钠缓冲液中，ρΗ6.0,0. 5Μ，50 μ L)，随后加入2_[18F]氟乙基叠 氮化物(11) (24-32MBq)/MeCN(50yL)溶液。将该混合物在室温保持15分钟，并且用HPLC 流动相A(水，0. 1% TFA) (0. 3mL)稀释。将该标记的肽(19)使用半制备HPLC(在216nm的 UV, Rt = 6 24)进行分离。实施例4 :Mal-炔双官能连接剂(1)的合成 反应方案8Ν-[β-马来酰亚胺丙氧基]琥珀酰亚胺酯(50mg，1. 25当量)溶解在1. OmL的无 7jC DMF中。将3- 丁炔-1-胺盐酸盐(16mg，1. 0当量)溶解在0. 5mL的无水二甲基甲酰胺 (DMF)和26μ L的二异丙乙基胺(DIEA)中。将该胺溶液逐滴加入到琥珀酰亚胺酯中，同时 将该酯溶液保持在冰浴中。将该混合物在0°C搅拌lOmin。将该溶液升温到室温，并且搅拌 ISh0真空蒸发溶剂，残留物溶解到5mL的CH2Cl2中。用盐水(3x5mL)萃取该有机溶液，并 且用MgSO4干燥。减压下除去溶剂，将粗料使用快速色谱法(二氧化硅，MeOH/CH2Cl2)进行 净化。产物(1)是如下来脱脂净化的将该样品溶解到最小量的CH2Cl2 (大约2mL)中，随 后用己烷清洗三次。产物(1)是作为绒毛状白色固体而沉淀的。使用1H-NMR来表征产物。 产率8. 2mg(25% )。IH-WR(500MHz，CDCl3) δ 2. 02 (s, 1)，2· 41 (t, J = 5Ηζ，2)，2· 57 (t,J = 5Hz，2)，3. 42 (td, J = 5Hz,2) ,3. 88 (t, J = 5Hz)，5. 90 (bs, 1)，6. 73 (s，2)。实施例5 2-氟乙基三唑-马来酰亚胺(参考化合物)(21)的制备 反应方案9将磷酸钠缓冲液(20μl,250mM, pH6. 0)，DMF(50 μ 1)和铜粉(lOOmg, 40 目， Aldrich Cat. No. 26，608-6)的混合物用氮气(10ml/min)吹扫5分钟。在加入2-氟乙基叠 氮化物(20) (10ymol)/DMF(9. 2μ 1，如 Glaser 和人rstad2007 中所述来制备)和 3-(N-马 来酰亚胺基)-N-(3-炔丙基)丙酰胺(1) (2. Img, 9. 5 μ mol)/DMF (20 μ 1)溶液之后，将该容 器在室温搅拌1小时。减压下除去溶剂(lmbar，8(TC)。通过制备HPLC净化来得到氟乙基 三唑(21)化合物(1. 2mg,41% )。HR ESI-MS =C13H16N5O3F (计算值 m/z = 310. 1310，实测值 m/z = 310.1314)。通过制备HPLC的净化(梯度在15min的5-80%溶剂B，其中A = H20/0. 1%TFA, B = MeCN/0. 1 % TFA,流速15mL/min ；柱=Luna 5 μ mC18 (2) (Phenomenex)，75x30mm,探测 UV 216nm。实施例6 亲和体炔基化和与Mal-炔双官能连接剂的反应
(MkDa)PBS,rt,2h.反应方案10将抗-Her-2亲和体，14kDa(lmg,作为冻干粉末)溶解在460 μ L的磷酸盐缓冲盐 水(PBS)。将该溶液的ρΗ保持在7. 4。向该溶液中加入40 μ L的二硫苏糖醇(DTT)的0. 5Μ 的PBS溶液；将ρΗ保持在7. 4。将所形成的混合物在室温搅拌2h。将该还原的亲和体通过 凝胶过滤进行净化。向该纯净部分的还原亲和体中加入12 μ L等分部分的Mal-炔双官能 连接剂溶液(1) (0. 15Μ的DMSO溶液)。将该反应混合物在室温培养2h，并且适度搅拌。将 反应混合物使用凝胶过滤进行净化，随后使用离心超滤(Amicon)，MWCO 5kDa(Millipore) 来获得净化的炔基化亲和体(22)。使用(MALDI-TOF-MS)和HPLC，随后使用LC(ESI)-MS来表征所形成的净化的炔基 化的亲和体(22)。产率(％ ) 78 ；MS (MH+计算值14260，实测值14260)。图4表示炔基 化的亲和体(22)的MALDI-TOFMS数据。用于炔基化的亲和体(22)的HPLC分析的标准条件^fCiraceVydac Protein C4柱 用于 HPLC 分析。溶剂 A 100% H20,0. 1% TFA，溶剂 B 100% MeCN, 0. 1% TFA ；探测:UV216 和280nm ；流速lmL/min。溶剂浓度随着时间的变化表示在下表1中。
表1 用于炔基化的亲和体(22)的典型洗提时间是大约11分钟t实施例7 在冷却条件下在生物结合物上形成三唑。
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CuSO4,抗坏血酸纳 ^ O65 0C, 0.75 h
W0.1 MNa2HPO4, pH 8反应方案11使用叠氮基_PEG(23)来标记炔基化的亲和体(22)。向36 μ L的磷酸钠水溶液 (100mM,pH8)中加入3 μ L等分部分的储备炔基化的亲和体(22)溶液(0. 6mM, 8mg/mL的 磷酸盐缓冲盐水溶液，PH7. 4)。向该溶液中加入1 μ L等分部分的刚刚制备的ISmM的11-叠 氮基-3，6，9-三氧(trioxa) i^一烷-1-胺(叠氮基-PEG)溶液(23)(在IOOmM磷酸钠中 稀释，PH8)。然后向该溶液中加入5 μ L等分部分的刚刚制备的10mM(2mg/mL)抗坏血酸钠 溶液(在IOOmM的磷酸钠中，pH8)。最后，将5 μ L等分部分的刚刚制备的10mM(l. 6mg/mL) 的硫酸铜(II)悬浮液(在IOOmM的磷酸钠中，pH8)加入到该反应混合物中。这些添加因 此产生了下面的试剂和基物的最终浓度炔基化的亲和体(22) (36 μ M)，叠氮基PEG(23) (360 μ Μ)，抗坏血酸钠(ImM)和 CuSO4 (ImM)。将所形成的溶液在65°C和适度搅拌下混合0. 75h。然后将该反应混合物立即在 纯水(MilliQ)中稀释到4mL，并且使用Amicon离心超滤装置MWCO 5kDa(Millipore)浓 缩到<100yL。将该水稀释浓度次序重复进行另外两次，目的是除去多余的试剂。使用 MALDI-T0F-MS和高性能液相色谱，随后使用LC(ESI)-MS来表征所形成的净化的结合物 (24)。产率(％) :42o MS (MH+计算值14478，实测值14492)。实施例8 使用Cy5_标记的叠氮基PEG (25a)来标记炔基化的亲和体(22) 反应方案12向36 μ L的磷酸钠水溶液(lOOmM，pH8)中加入3 μ L等分部分的储备炔基化的亲 和体(22)溶液(0. 6mM, 8mg/mL的磷酸盐缓冲盐水，pH7. 4)。接着加入1 μ L等分部分的 刚刚制备的18mM的Cy5-标记的叠氮基-PEG溶液(25a)(在IOOmM磷酸钠中稀释，pH8)。然 后向该溶液中加入5 μ L等分部分的刚刚制备的10mM(2mg/mL)抗坏血酸钠溶液(在IOOmM 的磷酸钠中，PH8)。最后，将5μ L等分部分的刚刚制备的10mM(l. 6mg/mL)的硫酸铜(II)悬 浮液(在IOOmM的磷酸钠中，pH8)加入到该反应混合物中。这些添加产生了下面的试剂和 基物的最终浓度炔基化的亲和体(22) (36 μ Μ)，Cy5-标记的叠氮基-PEG(25a) (360 μ Μ)， 抗坏血酸钠(ImM)和CuSO4(ImM)。将所形成的溶液在65°C和适度搅拌下混合0. 75小时。然后将该反应混合物立即 在纯水(MilliQ)中稀释到4mL，并且使用Amicon离心超滤装置MWCO 5kDa(Millipore)浓 缩到<100yL。将该水稀释浓度次序重复进行另外两次，目的是除去多余的试剂。使用 HPLC和监控染料荧光发射的SDS-PAGE蛋白质凝胶来表征所形成的净化的结合物(26)(图 5)。实施例9 在热条件下在炔基化的亲和体(22)上形成三唑 反应方案13用18F标记抗-Her2亲和体(22)。将硫酸铜(II)水溶液(5 μ L，0. 0249mg, 0. 1 μ mol)与抗坏血酸钠(0. 198mg, 1 μ mol) / 磷酸钠缓冲液(5 μ L，IOOmM, ρΗ8· 0)和 炔基化的亲和体(22) (50 μ g，3. 57nmol) /PBS (5 μ L)进行混合。在加入2-[18F]氟 乙基叠氮化物(11) (264 μ Ci, 9. 8MBq,如 Glaser，M.，和 Arstad，Ε. (2007)，“Click labeling"with2-[18F]fluoroethylazide for Positron Emission Tomography. Bioconj. Chem. 18,989-993所述来制备，其在此引入作为参考)/MeCN(20 μ 1)之后，将该混合物在 60°C加热30min。用2-[18F]氟乙基叠氮化物(11)标记，反应混合物的HPLC分析显示了用 亲和体(27)共洗提的放射性峰UV信号。用制备HPLC净化(梯度在15min内5-80%溶剂B，其中A = H20/0. 1% TFA, B=MeCN/0. 1 % TFA,流速lmL/min ；柱=Luna 3 μ mC18 (2) (Phenomenex)，50x4. 6mm,探测 UV280nm。图1表示了非最佳的系统的反应混合物的HPLC分析，其表示了 18F click标记的 抗-Her2亲和体(27) (a,放射性通道；b, 280nm UV通道)。 本发明可以体现为其他具体的形式，而不脱离其主旨或者基本特征。前述的实施 方案因此被认为在全部的方面中是示例性的，而非对此处所述的本发明的限制。本发明的 范围因此是通过附加的权利要求来表述的，而非通过前述的说明书来表述，并且因此目的 是将处于与该权利要求等价的含义和范围内的全部的变化包含在其中。
权利要求
一种将氟原子引入到生物分子上的方法，其包含(i)提供连接剂，该连接剂包括硫醇反应性末端和叠氮基或者炔反应性末端；(ii)将该连接剂的硫醇反应性末端与包含至少一个硫醇基团或者其反应性衍生物的生物分子进行反应；和(iii)随后将该连接剂的叠氮基或者炔反应性末端与氟取代的叠氮化物或者炔基进行反应。
2.权利要求1的方法，其中该生物分子具有大于50个的氨基酸残基。
3.权利要求1或者2的方法，其中该生物分子是亲和体。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中该硫醇反应性末端选自马来酰亚胺基团，卤代 脂肪族基团，卤代芳香族基团，卤代脂环族基团，(卤代乙酰基)烷基基团，(卤代乙酰基) 环烷基基团，(卤代乙酰基)芳族基团，乙烯基砜基团，丙烯酰基团，环氧基团，氮丙啶基团， 和能够与硫醇基团进行硫醇交换反应的二硫化物基团。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中该至少一个硫醇基团包括半胱氨酸残基或者含 有硫醇的非天然氨基酸。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中该连接剂的硫醇反应性末端是马来酰亚胺基团。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中该生物分子的反应性衍生物是用还原剂处理该 生物分子来产生的。中任一项的方法，其中该连接剂选自
8.权利要求1-7
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中该连接剂是通过这样一种方法来生产的，该方 法包含将胺化合物与羧酸或者活化的酯化合物进行反应，来形成该连接剂；其中该胺化合物包括叠氮基或者炔反应性官能基团，该羧酸或者该活化的酯化合物包括硫醇反应性官能基团。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中该氟取代的叠氮化物或者炔包含18F取代的叠 氮化物或者炔或者19F取代的叠氮化物或者炔，优选18F取代的叠氮化物或者炔。
11.一种将氟原子引入到生物分子上的方法，其包含(i)将Mal-炔双官能连接剂的硫醇反应性末端与包括至少一个硫醇基团的生物分子 进行反应；和( )随后将所述炔基与氟取代的叠氮化物基团进行反应。
12.一种将氟原子引入到生物分子上的方法，其包含(i)将Mal-叠氮化物双官能连接剂的硫醇反应性末端与包括至少一个硫醇基团的生 物分子进行反应；和( )随后将所述叠氮化物基团与氟取代的炔基进行反应。
13.权利要求11的方法，其中该氟取代的叠氮化物基团包含18F取代的叠氮化物或者 19F取代的叠氮化物基团，优选18F取代的叠氮化物基团。
14.权利要求12的方法，其中该氟取代的炔基包含18F取代的炔或者19F取代的炔基， 优选18F取代的炔。
15.一种生物结合物，其包含衍生自下面的结构单元 (i)包含至少一个硫醇基团的生物分子；和( )连接剂；其中该连接剂是通过这样一种方法来制备的，该方法包含将包含叠氮基或者炔反应性 官能基团的胺化合物与包含硫醇反应性官能基团的羧酸或者活化的酯进行反应。
16.权利要求15的生物结合物，其中该活化的酯包含结构=L-M-COR2；其中L包含硫醇 反应性官能基团，或者其受保护的衍生物；M是二价连接单元；和R2是OH或者活化基团。
17.权利要求15的生物结合物，其中该胺化合物包含结构=G-J-R1；其中G是胺，J是二 价连接单元，和R1是叠氮基或者炔反应性官能基团。
18.权利要求15的生物结合物，其中该生物分子是亲和体。
19.权利要求17的生物结合物，其中该连接单元是通过这样一种方法来制备的，该方 法包括将包含叠氮基或者炔反应性官能基团的胺化合物与包含硫醇反应性官能基团的羧 酸或者活化的酯化合物进行反应。
20.一种连接剂复合物，其包含式L-M-CO-NH(R1)-J-G, 其中L是硫醇反应性官能基团；M和J是二价连接单元；R1是H、脂肪族基团、芳香族基团或者脂环族基团；和 G是叠氮基或者炔反应性官能基团。
21.权利要求20的连接剂复合物，其中该连接剂选自
全文摘要
本文中提供了一种将氟原子引入到生物分子上的方法，其包含(i)提供连接剂，该连接剂包含硫醇反应性末端和叠氮基/炔反应性末端；(ii)将该连接剂的硫醇反应性末端与包含至少一个硫醇基团或者其反应性衍生物的生物分子进行反应；和(iii)随后将该连接剂的叠氮基/炔反应性末端分别与氟取代的叠氮化物或者炔进行反应。还提供了用于合成双官能连接剂和生物结合物以及包含氟标记的生物分子的放射性诊断剂的复合物和方法。
文档编号C07B59/00GK101903047SQ200880121657
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月20日
发明者E·W·科瓦奇, E·阿斯塔, F·A·休德, M·E·格拉泽, O·L·帕迪拉德耶稣 申请人:通用电气公司;哈默史密斯网上成像有限公司