专利名称：定向基因去除的制作方法
技术领域：
本发明涉及从植物尤其是转基因植物中除去可选择的标志基因或外源辅助核酸的方法，为此的装置及其产物。
背景技术：
在植物转化中广泛使用耐受抗菌素或除草剂的重组基因作为选择性标记。一旦按其抗性选择了转基因材料，标志基因就不必要了。在转基因植物中抗菌素或除草剂抗性标记的存在使人担忧耐性品种可能会扩散到野生型植物品种1或其它品种2。
由于许多原因非常期望能从转基因植物中除去抗性标志基因。相关品种间的异花授粉可能会导致抗性特征传递给种子3，从而危及转基因作物的长期使用并造成潜在的生态问题。例如，编码抗菌素或除草剂抗性的标志可能将转基因植物变成杂草型害物，从而破坏生态平衡。消费者们担忧在食品中广泛使用抗性标志，理论上有可能横向将转基因送递给肠道细菌的危险。如果理论上的危险成为现实，则标志基因可能转化入微生物并增加人和/或动物肠中抗性病原微生物的数量。
期望从转基因植物中除去抗性标志基因的另一个原因是，由于能用于植物转化的标志基因的选择数量有限，通过不同转基因品系的杂交多种转基因特征的组合经常使植物产生含有连接于不同效应基因的相同选择标志的许多拷贝。由于转基因中特定标志基因的存在排除了该标志在随后组合中的使用，这就使得每次组合都需要使用不同的选择标志系统。因此从长远观点来看，可能会需要引入比涉及可获得的合适的可检测标志数量更多的转基因。另一问题是植物中存在的多个同源序列将增加同源-依赖性基因的抑制4，这将严重限制转基因作物的可靠的长期使用。
由如上给出的需要从转基因植物除去抗性标志的原因，已开发了许多系统来确保除去可选择的标志基因。例如，两种不同构成物的共转化可以得到整合有这两种转基因的转基因品系5，但这种方法的应用是有限的，因为其取决于这两种转基因插入不同基因组区域的效率(这是将它们在遗传杂交中分开所需要的)。另外，这种方法的另一缺陷是由于需要遗传杂交所以费时费力。
作为共转化的替代，用一些转座因子系统和位点特异性重组系统来除去标志6。这些系统需要介导重组或转座靶序列间所包括区域缺失的转座酶或重组酶的表达，随后通过基因分离除去此辅助基因，这使得这些系统相对比较耗时。另外，删去的片段还可再插入其它基因组位置，且重组酶或转座酶蛋白质有可能会造成不良的副作用。
另一种除去可选基因标志的方法是基于两个同源序列间染色体内的同源重组(ICR)诱导DNA缺失。虽然通过刺激修复系统能增加ICR，但ICR的固有的缺陷是它的频率太低不足以使该系统有效地应用于产生转基因区域的缺失。例如在烟草中，在6周龄的烟草植物的所有细胞中平均少于10个ICR事件是可以检测到的。
除了上述ICR方法的局限性外，我们还开发了基于λ噬菌体至今未开发区域重组的ICR策略，而且我们能产生惊人的且足够高效率的ICR，从而可以简化缺失转基因标志基因组织的鉴定。
发明概述本发明一方面提供了一种在转基因整合入基因组后去除转基因部分的方法，包括步骤将λ噬菌体的附着P区域(attP)置于所述转基因部分的两侧，和诱导染色体内发生各侧翼attP区域之间的同源重组，从而除去位于其间的所述的转基因部分。
本文附着P区域(attP)指包括与高重组效率相关的λ噬菌体DNA区域。
较佳地，所述的转基因的所述部分包括标志基因和/或载体序列和/或其它外源辅助核酸。
较佳地，该基因组是植物基因组。
较佳地，标志基因指针对抗菌素的抗性和/或除草剂的抗性。
可以理解术语标志基因指包括参与特异性生物合成途径的基因和/或参与环境忍耐力的基因。
较佳地，标志基因选自nptII、Ble、dhfr、cat、aphIV、SPT、aacC3、aacC4、bar、EPSP、bxn、psbA、tfdA、DHPS、AK、sul、crsl-1和tdc。
较佳地，该方法能删除两个attP区域间至多10kb的区域，更佳地为7kb的区域。
较佳地，在除去一个以上标志基因和/或载体序列和/或其它辅助核酸时，待删除转基因各不合需要部分的侧翼都有attP区域。因此可以理解本发明的方法可以在相同时间同时除去基因组一个以上不合需要的部分。
较佳地，attP区域含有位于λ噬菌体27492位和27844位间的3052bp。
较佳地，attP区域含有SEQ ID NO1所示的核酸序列或其功能相当的片段、或在严格条件下能与SEQ ID NO1杂交且具有作为attP区域功能的核酸，或因遗传密码简并性而与SEQ ID NO1的DNA有差异且起attP区域作用的核酸。
本发明的方法提供了一种在转基因整合入植物基因组后删除该转基因不合需要和/或其它部分的新型策略。本发明的方法开发了λ噬菌体附着P区域(attP)至今未识别的潜在的高重组效率，在两个attP区域的染色体内重组后进行删除。已证明attP系统从已插入两个不同基因组区域的重组载体中删除了一个5.9kb区域。与其它基于细菌重组系统或使用转座因子6的系统不同，attP系统无需重组辅助蛋白质的表达来引发缺失。因此，本发明的这种attP删除方法是一种简单而有效的工具来改善植物转化的潜力和解决许多问题(包括担忧抗性标志使用的消费者)。
较佳地，attP区域是在序列盒中的。
较佳地，该盒还包括提高同源性和异常重组的转化增强序列(TBS)或其片段。
通常从碧冬茄(Petunia hybrida)衍生TBS。
较佳地，该很还包括效应基因如oryzacystastin-I或其功能等同物。
本发明的另一方面提供了一种用本文所述的方法产生的植物，除去了转化入其基因组的一个部分，且该植物任选地还具有本文所述的优选特征。
较佳地，该植物是生长的，并从其收获植物产物。
本发明的另一方面提供了一种用本文所述的方法产生的植物细胞，从而除去了转化入该细胞的一部分，且任选具有本文以下所述的优选特性。
较佳地，该植物是生长的，并从其收获植物产物。
本发明的另一方面提供了一种attP重组盒，其含有标志基因和/或载体序列和/或其它侧翼于attP区域各端的外源辅助核酸。
较佳地，该盒还具有本文所述的任一优选特性。
本发明的另一方面提供了含有重组attP区域的植物或植物细胞或植物组织。另外本发明还包括种子。
本发明的另一方面提供了attP重组盒，用于除去整合入植物基因组的部分且任选地具有本文所述的任一优选特性。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒，用于当转基因整合入包含如本文上述attP重组盒的植物基因组后除去该转基因的部分，且任选地具有本文所述的优选特性。
本发明的另一方面提供了一种植物或植物细胞或植物组织，其含有整合入其基因组的重组转基因，该转基因与λ噬菌体attP区域相连。
较佳地，植物或植物细胞或植物组织包含至少一个λattP区域和一个效应转基因(整合入其基因组)。可以看出所述的植物或植物细胞或植物组织理想地包含至少两个影响ICR的attP区域，但所述的植物或植物细胞或植物组织可包含第一attP区域，而第二attP区域可以随后引入从而侧接于该转基因。
较佳地，植物或植物细胞或植物组织的特征为λattp区域和一个转基因不与标志基因和/或载体序列和/或外源辅助核酸连接。
较佳地，该转基因还可与能提高同源和异常重组的转化增强序列或其片段连接。
发明详述现以实施例并参考附图进一步说明本发明。
图1显示了pattP-ICR的T-DNA区域。
图2显示了无标志转基因烟草植物的选择。
图3显示了对km-抗性和km-敏感性植物的PCR分析，而且包括了λ噬菌体attP区域的核酸序列(SEQ ID NO1)；和图4显示了对km-抗性和km-敏感性植物的Southern印迹分析。
图1显示了pattP-ICR的T-DNA区域。在载体pPCV0028中的NPTII的两端插入两个attp区域的352bp区域(位于λ噬菌体基因组的27492和27844间)。在attP盒中，我们插入了tms-2的编码区域和聚腺苷酸区域9和GFP的编码区域10(连接于nos聚腺苷酸区域)。由双1’-2’启动子转录这两个基因。将attP盒包埋于0.6kb DS元件，在活性Ac转座酶5’存在下使能除去此完整的盒，并在attP盒中插入TBS片段(从而提高异常和同源重组)和以oryzacystatin-I基因为例作为效应基因。箭头指明由效应基因(PE1和PE2)、NPTII基因(PN1和PN2)和attP盒(P5’和P3’)的引物特异性删除扩增的区域。在两个attP区域间的ICR将产生5.9kb的缺失，仅保留一个区域而除去在attP间的一个区域。黑色箭头编码用于Southern印迹杂交的探针(图4)。
图2显示了无标志转基因烟草植物的选择(A)。
图1和2在含有km的培养基上培养了绿色和白色芽。进一步分析潜在缺失NPTII标志的白色组织的tms-2基因的活性(B)。在含有NAM的培养基上具有tms2活性的芽产生大量愈伤组织而不是根(左)，而自缺失tms2基因的白色组织再生的芽生成正常的根(右)。
图3显示了对
图1(泳道2)和图2(泳道4)衍生的km抗性组织以及自
图1(泳道3)和图2(泳道5)白色组织衍生的km-敏感性植物的PCR分析。泳道1含有HindIII消化的λDNA作为尺寸标志。以bp表示PCR片段的尺寸。
A.用引物PE1和PE2的PCR显示所有四条泳道都含有效应基因。
B.用引物PN1和PN2的PCR显示km-敏感性植物缺失了NPTII基因。
C.用引物P5’和P3’的PCR显示两个km抗性泳道含有完整的attP盒，而两个约6kb的km-敏感性植物则缺失了attP盒。
D.PCR产物测序显示C中的泳道3表明重组精确地在5’和3’区域间保留了一个attP区域。
图4显示了对自km-抗性(泳道2)和图3的km-敏感性(泳道3)组织分离的DNA的Southern印迹分析。
A.用ScaI消化的基因组DNA作区域“a”(见
图1)探针，以标记整合的T-DNA的左连接片段。
B.用ScaI消化的基因组SDNA作区域“b”(见
图1)探针，以标记整合的T-DNA的右连接片段。
在km敏感性组织中，左末端片段保持不变(A)，而右末端片段则由于两个attP区域(B)间区域的缺失而短了约6kb。
材料和方法植物转化按Koncz等人所述12的接合，将pattP-ICR共聚物引入根癌土壤杆菌(A.tumefacien)菌株GV3101(pMP90PK)中。按Horsch等人所述13，进行叶子小圆片转化烟草(Nicotiana tabacum)与Petit Havana SR1。
DNA的制备和分析在小型制备DNA后14，在50μl含有10mM TRIS-HCl PH 8.3，50mMKCl，2mM MgCl2，0.1％w/v明胶，0.2mM各核苷酸，25pmol各引物和1U Taq聚合酶(Promega)的反应体积中进行PCR。检测效应基因所用的PCR循环为94℃4分钟；94℃，30轮1分钟；55℃30秒；72℃30秒；和72℃10分钟；用于扩增NPT II基因的PCR循环为94℃4分钟；94℃30轮1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟；72℃10分钟。为了扩增attP盒，按制造商说明用ExpandTM LongTemplate PCR System(Boehringer Mannheim)进行长模板PCR。用于PCR的引物序列为PE1 TCA TCA GAC GGA GGA CCA GTT TTG G (SEQ ID NO2)PE2 ATC CAT GGT TTT TCC CAA ACT TTA G (SEQ ID NO3)PN1 CCA TGA TCA TGT CGA TTG AAC AAG ATG (SEQ ID NO4)PN2 CCA TTT TCC ACC ATG ATA TTC GGC AAG (SEQ ID NO5)P5’GAA TTC TAA TTC GGG ATG ACT GCA ATA TGG(SEQ ID NO6)P3’GGA TCC AAC GGG ATA TAC CGG TAA CGA AAA GG(SEQ ID NO7)Southern印迹分析如van Bloklad等人15所述分离基因组DNA。用ScaI消化15μg基因组DNA，并在0.7％琼脂糖凝胶上进行电泳分级。电泳后，将DNA点样于Nybond N滤器上，用UV辐射交联，并按Kose等人16所述，在65℃用32P标记的效应基因的0.3kb Eco RI/Sac I DNA片段杂交。
结果通过噬菌体连接区域(attP)和细菌连接区域(attB)间的重组，将λ噬菌体整合入大肠杆菌(E.coli)基因组中。在attP整合中需要细菌整合宿主因子(IHF)和病毒编码的整合(Int)基因，而切割时需要加入病毒切除酶(Xis)蛋白质。三种重组蛋白质结合于250bp attP片段17中所限定的DNA。IHF具有辅助功能、使attP区域18弯曲而且可能协助生物体attP中的Int进入核小体类的结构(这是与attB有效联会所需的)19。由具有拓扑异构酶I活性的Int蛋白介导在attP和attB核心区域间7bp的同源中所发生的实际链的交换。Int的酪氨酸残基结合于DNA的3’端，与哺乳动物拓扑异构酶I型类似而与大肠杆菌拓扑异构酶I(结合于DNA的5’端)相反20。
在本发明中，我们设计和构建了植物转化载体pattP-ICR，其中我们插入两个352bp侧翼于NPTII抗性标志、GFP基因和tms2基因的attP区域(
图1)。在一个attP旁我们安置了转化增强序列(TBS)(增强同源和异常重组21)和oryzacystastin-I基因22(作为‘效应’基因的例子，最终通过attP系统转化入基因组)。两个attP区域间的ICR能除去attP区域间的5.9kb区域，并产生保留效应基因和TBS序列的转基因。用叶子小圆片转化，将此构建物引入烟草，并在卡那霉素(km)培养基上选择抗性愈伤组织。转化后2个月，将11个km抗性愈伤组织(0.5cm直径)转移到无km的培养基中。当愈伤组织长到5-6cm直径时，将它们切成较小的部分再转移到含有km的芽再生培养基中。3-5个月后，在所有这11个愈伤组织上都长出了多个新芽，我们发现有两个克隆(无性繁殖系)混合产生绿色和白色新芽。进一步研究这两个克隆(图2中的泳道1和2)来评估白色新芽是否含有缺失NPTII抗性标志和tms2基因的组织。
将这两个系列的白色叶片置于无km的再生培养基上，将产生的新芽置于补充有萘烟酰胺(NAM)的培养基上。由于tms2的活性将NAM转化成生长素NAA9，表达tms2基因的植物产生高水平的生长素从而防止了根的发育取而代之的则是诱导了愈合组织的产生。两个attP片段间缺失区域的组织也缺失tms2基因，从而可由其在含有NAM培养基上形成根的能力进行鉴定。系列1的20个新芽中11个而系列2的32个新芽的12个产生根，将这23株小苗作为缺失NPTII基因和tms2基因的候选物进一步分析。PCR分析显示所有这23株小苗确实都丢失了NPTII基因和tms2基因。系列1的11株小苗中有2株和系列2的12株小苗中有1株还保留效应基因，所有其它系列都缺失了效应基因。
将代表系列1和系列2保留效应基因的作为进行进一步鉴定来分析其缺失事件的精确程度。我们用系列1和系列2的km-抗性新芽作为对照。用对效应基因、NPTII基因和侧翼于attP二聚物盒区域特异性的引物进行的PCR分析显示保留了效应基因，而缺失了NPTII基因且在2个attP片段间的区域被减少了约6kb(正如所料的2个attP区域重组)(图3)。两种克隆都产生相同的PCR模式，表明它们都是由相同缺失产物产生的。对一个PCR片段测序，表明在侧翼于attP盒的5’和3’区域间精确保留了一个attP区域，这与预计的相一致即在两个attP片段间的ICR删除了这两者间的5.9kb区域。Southern印迹分析系列1的绿色和白色组织显示了PCR数据(图4)。
事实上大部分缺失NPTII/tms2区域的小苗也缺失在attP盒外的转基因区域，表明ICR不与两个attP间精确的同源重组相关，但可能会因为异常重组而产生大量缺失。但ICR可以清楚地鉴定在2个attP区域间的何处发生精确的染色体内重组。由于在两个不同的转化体中可以发现相同的缺失，attP区域间的有效重组似乎不仅仅发生在整合入特异性基因组整合区域的转基因中。我们的数据表明以相对数量较小的愈合组织启示，可以选择精确缺失的同源材料，而且由于PCR技术的可行性易将它们与不良缺失(除两个attP位点间的缺失外还有其它缺失)相区分开。至少35％新芽是自白色显示缺失的组织再生的，用tms2基因来预选缺失看来是不必要的，可以用PCR来替代它。
attP片段相对高ICR效率的原因尚不清楚，但预计这种作用可能是因为attP区域改善的可接近性。烟草体细胞染色体内的重组是由DNA受损刺激修复机制的一部分7。植物中ICR的效率通常比染色体外的重组低几个数量级，这表明将DNA包装入染色质内显著保护了其免受修复/重组机制23。由于染色质结构的改变而改善的DNA区域的可接近性，对ICR的效率有明显影响。这种假设的支持来源于人成纤维细胞瘤的实验，其表明超乙酰化的核小体中DNA修复合成的提高比乙酰化降低的核小体具有更开放的染色质结构24。
attP片段具有相对高的AT含量(67％)，这可能就潜在地改善了其易接近性。已将富含AT的区域视为异常重组介导的转基因整合入植物基因组的优选靶位，且预计高AT含量会增加通过染色体DNA结构的空间弯曲进行DNA整合的可能性。如为解释attP位点高重组效率的可使用假设，我们认为由于attP区域的序列组合物或与attP区域相连的核蛋白质一起经历了构象的改变，attP区域改善了其对修复/重组酶的可接近性。在细菌中，由IHF介导attP区域的弯曲，小的碱性蛋白质构成两个不相似的亚基。这两种亚基都表现出类组蛋白的细菌蛋白质26特性，而且可以假设attP区域与植物组蛋白或类组蛋白的蛋白质的间的相互反应可以同样导致弯曲结构。
虽然引起attP区域的高ICR效率的分子机制尚未能确定，但对这种意外作用的发现提供了一种有用的工具，来迅速和有效地从转基因植物中除去抗性标志基因或任何其它不良的转基因区域。
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权利要求
1.一种在转基因整合入基因组后去除转基因部分的方法，其特征在于，包括步骤将λ噬菌体的附着P区域(attP)置于所述转基因部分的两侧，和诱导染色体内发生各侧翼attP区域之间的同源重组，从而除去位于其间的所述的转基因部分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转基因含有标志基因和/或载体序列和/或其它外源辅助核酸。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的标志基因赋予针对抗菌素和/或除草剂的抗性。
4.如权利要求1、2或3任一所述的方法，其特征在于，所述的标志基因参与特异性生物合成途径和/或参与环境忍耐力。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的标志基因选自nptII、Ble、dhfr、cat、aphIV、SPT、aacC3、aacC4、bar、EPSP、bxn、psbA、tfdA、DHPS、AK、sul、crsl-1和tdc。
6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的方法从转基因除去一个以上的标志基因和/或载体序列和/或外源核酸部分，且每个被删除部分的侧翼都有attP区域。
7.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的attP区域含有位于λ噬菌体的27492和27844之间的352个碱基对或其功能相当的片段。
8.如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的attP区域含有SEQID NO1所示的核酸序列或其功能相当的片段、或在严格条件下能与SEQ IDNO1杂交且具有作为attP区域功能的核酸，或因遗传密码简并性而与SEQ IDNO1的DNA有差异且起attP区域作用的核酸。
9.如权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述的attP区域是在盒内的。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的盒还含有转化增强序列或其片段，以增强同源和异常重组。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述的盒还含有效应基因如oryazcyctastin-I或与其功能等同物。
12.如权利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述的基因组是植物基因组。
13.一种用权利要求1-12任一所述的方法产生的植物、植物细胞或植物组织。
14.一种包括进行权利要求12所述的方法产生植物或提供权利要求13所述的植物或植物细胞或植物组织的方法，其特征在于，所述的方法包括生长植物和/或收获其产物。
15.含有重组attP区域的植物或植物细胞或植物组织。
16.attP重组盒，其特征在于，包含侧翼是attP区域的标志基因和/或载体序列和/或外源辅助核酸。
17.权利要求16所述的attP重组盒的用途，其特征在于，用于除去整合入植物基因组的部分。
18.一种待转基因整合入植物基因组后将其除去的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求16所述的attP重组盒。
19.含有整合入基因组的重组转基因的植物或植物细胞或植物组织，其特征在于，所述的转基因在其各端与λ噬菌体attP区域相连。
20.如权利要求19所述的植物或植物细胞或植物组织，其特征在于，还包含一个所示的λ噬菌体attP区域和一个整合入其基因组的效应转基因。
21.如权利要求20所述的植物或植物细胞或植物组织，其特征在于，所述的λ噬菌体attP区域和一个转基因不与标志基因和/或载体序列和/或其它外源辅助核酸相连。
22.如权利要求19-21任一所述的植物或植物细胞或植物组织，其特征在于，所述的转基因还与能增强同源和异常重组的转化增强序列或其片段相连。
全文摘要
本发明公开了一种在转基因整合入基因组后去除转基因部分的方法,包括:将λ噬菌体的附着P区域(attP)置于所述转基因部分的两侧,和诱导染色体内发生各侧翼attP区域之间的同源重组,从而除去位于其间的所述的转基因部分。
文档编号C12N15/82GK1375010SQ00813040
公开日2002年10月16日 申请日期2000年9月15日 优先权日1999年9月17日
发明者P·迈耶, E·祖布科 申请人:利兹大学