专利名称：一种富集血清中低丰度蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种富集血清中低丰度蛋白的方法。
背景技术：
人体血清中因疾病而引起的蛋白质的含量及种类变化是临床上各种病症 早期诊断及评价病情、判断预后等常规检验的一个重要指标，应用现代生物技 术如蛋白质组学等寻找与疾病相关的特异蛋白质变化是当前研究的热点。然 而，由于血清中的蛋白质种类超过一万种之多，其中高丰度蛋白如白蛋白、球
蛋白、纤维蛋白原等就多达22种，占据了蛋白质总量的99%左右，从而掩盖 了可能含有特异分子的低丰度蛋白质，造成其难于被检测，因此，预先有效地 去除血清中高丰度蛋白质，富集低丰度蛋白，可以提高应用蛋白质组学技术寻 找疾病诊断的敏感性分子标志物的可能性。
目前在科研中虽然应用许多方法选择性地去除1 2种高丰度蛋白，但这些 方法普遍纯化率偏低，操作复杂。现有的商业化产品使用成本高，而且易于去 除与高丰度蛋白有相互作用的低丰度蛋白，故应用性不大，如MARS纯化柱 价格昂贵，需要应用成本较高的HPLC高效液相色谱技术，该纯化过程只能去 除其中6种丰度最高的蛋白质，仍然留下不少高丰度的蛋白，且由于MARS 纯化柱是在非变型条件下进行纯化的，在天然构象状态下能与白蛋白等蛋白结 合的蛋白也会被同时去除，导致蛋白损失过多，影响实验的结果。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种重复性好、操作简单、 纯化成本低，能够有效地去除血清中的高丰度蛋白并富集大量低丰度蛋白的方 法。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
一种富集血清中低丰度蛋白的方法，该方法是利用肝素与血清中许多高丰 度蛋白质相互作用的特性，将肝素琼脂糖作为纯化柱的填料，采用本领域技术 人员进行亲和层析时的常规操作进行装柱、平衡和上样，由于不同的洗脱液会 收集得到不同的洗脱成分，洗脱液的选择对洗脱效果影响很大，因此本发明人
对洗脱液进行了实验研究，结果发现当采用浓度为1.5mol/L的NaCl做为洗脱 液时，洗脱得到的组分中含有大量富集的低丰度蛋白，而高丰度蛋白含量很低。
上述方法中，用1.5mol/L的NaCl做为洗脱液时，可采用Tris-HCl缓冲液 调节NaCl溶液的pH，如洗脱液的配方可以为10 mmol/L Tris-HC1禾口 1.5 mol/LNaCl， pH7.0。
上述方法中，采用1.5mol/L的NaCl做为洗脱液，得到的洗脱产物还可以 采用蛋白G琼脂糖凝胶(Protein Gsepharose)进一步去除其中的IgG。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
l.本发明的方法选择肝素琼脂糖作为纯化材料，材料本身价格便宜，利用 肝素与血清中许多高丰度蛋白质相互作用的特性，应用普通的亲和层析的方法 便可获得低丰度血清蛋白，而且层析过程简单易行，大大降低纯化成本，且与 MARS纯化柱相比，肝素琼脂糖纯化的效果更好，能得到种类更多的血清蛋白， 而且肝素琼脂糖可重复利用，也节约了成本；2. 本发明的方法能够有效去除血清中高丰度蛋白，解决血清中高丰度蛋白 的干扰问题，进而高效富集大量的低丰度蛋白，获得研究中所需的目的种类的 低丰度蛋白，为进一步深入研究确诊疾病的高效、特异性的低丰度蛋白标识物
提供了研究条件；
3. 本发明的方法为应用蛋白质组学进行疾病研究，得到所需的高效、特异
性的低丰度蛋白标志物提供了研究基础，利用该方法还可以制作成商品化的蛋
白纯化柱，对于在应用功能蛋白质组学进行疾病诊断标志物的寻找和疾病发病
机制的研究以及药物开发的机构推广具有较大意义，产业化后也能带来良好的
经济效益，同时也具有良好的社会效益。
图1为SDS-PAGE考染和银染电泳其中，l为考染电泳图，2为银染电泳图，3为Marker, 4为洗脱组分，5 为进一步去除IgG后组分，6为IgG， 7为IgG重链，8为IgG轻链； 图2为MARS column处理所得的蛋白组分的2D-PAGE电泳图； 图3为肝素亲和富集的低丰度蛋白组分的2D-PAGE电泳图； 图4为洗脱条件优化SDS-PAGE电泳其中，1为Marker, 2为未处理过的血清，3为清洗组分(即肝素不结合 的组分)，4为洗脱液配方(1) ， 5为洗脱液配方(2) ， 6为洗脱液配方(3)， 7为洗脱液配方(4) ， 8为洗脱液配方仅含有1.5mol/LNaCl。 具体事实方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地解释，但具体实施例并不对本发 明做任何限定。实施例l肝素亲和层析
本实施例以肝素琼脂糖作为纯化柱的填料，对样品进行肝素亲和层析，其 具体步骤如下
1. 样品预处理
收集10mL正常人血液于不抗凝试管中，室温静置30min，然后1500g离 心30min，取上清液再次5000g， 4。C离心20min，去除沉淀收集上清液，取该 上清液IO(VL，用60jiL纯净水和40pL的乙腈稀释，40。C温浴15min， 14 OOOg 离心10min去除沉淀，收集上清液即为本实施例的血清上样品。
2. 亲和层析
本实施例的亲和层析釆用本领域技术人员的常规操作，所用到的仪器和试 剂均为市售。
装柱将lmL肝素琼脂糖装入5mL的BIO-RAD层析柱； 平衡用5mL平衡液(含有IO mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH 7.0)平衡柱子；
上样将180pL上述血清上样品用lmL平衡液(含有10mmol/L Tris-HCl 和50 mmol/L NaCl， pH 7.0)稀释后，上柱；
平衡上柱后再次用5mL平衡液(含有IO mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH7.0)平衡；
洗脱用2.5mL洗脱液(含有IO mmol/L Tris-HCl和1.5 mol/LNaCl， pH 7.0) 洗脱柱子，收集洗脱产物。
层析结束后依次用Cleaning Buffer 1 (含有0.1mol/L硼酸盐和l mol/LNaCl， pH9.8) 、 Cleaning Buffer 2 (含有0.1mol/L硼酸盐，pH9.8) 、 Cleaning Buffer3 (超纯水，MilliQ Water)和Cleaning Buffer 4 (含有2.0 mol/L NaCl)这四
种清洗液各5mL清洗柱子后，则可重复利用柱子。 3.IgG的去除
用PBS清洗两遍Protein G sepharose (市售)，并将其储存于等体积的PBS
中；
将上述洗脱产物浓縮于500pLPBS中，加入200^L Protein G sepharose，于 恒温震荡器上4i:震荡3h后，14000g离心10min去除ProteinG，吸取上清作为后 续试验的样品。
4.SDS-PAGE
采用本领域技术人员的常规操作，进行SDS-PAGE电泳，电泳结果用考染 及银染染色，如图1所示，
4为肝素亲和层析所得的洗脱组分，即肝素结合蛋白组分，其中仍存在较 浓的IgG条带，5为进一步去除IgG后的洗脱组分，IgG条带大幅变淡，6为被去 除的IgG组分，7和8分别为IgG的重链和轻链条带。
5.2D-PAGE
对上述步骤3中去除IgG后的上清样品进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2D-PAGE)，其具体操作采用本领域技术人员的常规操作，电泳结果用银 染显示。
6.图像分析处理
将上述SDS-PAGE和2D-PAGE的银染染色胶都进行Image Scanner (Amersham Biosciences)扫描，过程中使用软件Lab Scan 3.00进行操作，扫 描后图像用Image Master 2D Elite Software 4.01 (Amersham Biosciences)软件分析。
扫描结果运用MARS column处理所得的蛋白组分的2D-PAGE电泳图 如图2所示；运用该实施例肝素亲和所富集的低丰度蛋白组分的2D-PAGE电泳 图如图3所示；从图2和图3可以看出用MARS处理后，2D-PAGE显示561个点， 而用肝素琼脂糖和ProteinGsepharose处理后，显示622个点，说明本方法能够 比MARS纯化柱分离到更多的蛋白。
实施例2肝素亲和洗脱条件优化
本实施例对本发明的样品洗脱条件进行优化，对实施例1中的洗脱液进行 一系列不同的配方，对比洗脱效果，从而选出最优洗脱条件。 洗脱液配方
(1) 10mmol/LTris-HCl和0.5mol/LNaCl， pH7.0;
(2) 10mmol/LTris-HCl和1.0mol/LNaCl， pH7.0;
(3) 10 mmol/L Tris匿HCl和1.5 mol/L NaCl， pH 7.0;
(4) 10mmol/LTris-HCl和2.0mol/LNaCl， pH7.0。
同时本实施例还设置了对比组未处理的血清，肝素不结合组分，洗脱液
配方仅有1.5 mol/LNaCl。
将上述不同处理后的结果进行SDS-PAGE电泳，如图4所示，
1为Marker, 2为未处理的血清，3为肝素不结合组分，4 7分别为使用
洗脱液配方1 4进行梯度洗脱的结果，8为仅使用10 mmol/L Tris-HCl和1.5
mol/LNaCl， pH 7.0配方进行洗脱的结果，可见使用该洗脱液配方基本可将肝
素结合组分全部洗脱下来。
因此，本实施例选择配方(3) : 10mmol/LTris陽HCl和1.5mol/LNaClpH7.0，作为优选的洗脱液配方,
权利要求
1、一种富集血清中低丰度蛋白的方法，其特征在于该方法是采用肝素琼脂糖作为纯化柱的填料，NaCl做为洗脱液，对血清进行低丰度蛋白的富集。
2、 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述洗脱液的配方为10mmol/L Tris — HC1和1.5 mol/L NaCl， pH 7.0。
3、 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述肝素琼脂糖经Cleaning Buffer 1 、 Cleaning Buffer2、 Cleaning Buffer 3和Cleaning Buffer 4这四种清洗 液清洗后，可多次使用；所述Cleaning Buffer 1含有0.1 mol/L硼酸盐和1 mol/L NaCl， pH9.8;所述Cleaning Buffer2含有0.1 mol/L硼酸盐，pH 9.8;所述 Cleaning Buffer 3为超纯水；所述Cleaning Buffer 4含有2.0 mol/L NaCl。
4、 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述纯化柱的平衡液为10 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH 7.0。
5、 根据权利要求1所述方法，其特征在于该方法采用洗脱液洗脱后，洗 脱产物再采用蛋白G琼脂糖凝胶进一步处理。
全文摘要
本发明公开一种富集血清中低丰度蛋白的方法，该方法采用肝素琼脂糖作为纯化柱的填料，1.5mol/L的NaCl做为洗脱液，洗脱得到的组分中含有大量富集的低丰度蛋白，而高丰度蛋白含量很低，解决了血清中高丰度蛋白的干扰问题，获得研究中所需的目的种类的低丰度蛋白，为进一步深入研究诊断疾病的高效、特异性的低丰度蛋白标识物提供了研究条件。本发明选择肝素琼脂糖作为纯化材料，材料本身价格便宜，层析过程简单易行，纯化效果好，能得到种类更多的血清蛋白，且肝素琼脂糖可重复利用。利用本发明方法还可制作商品化的蛋白纯化柱，对于在应用功能蛋白质组学进行疾病诊断标志物的寻找和疾病发病机制的研究以及药物开发推广具有较大意义。
文档编号C07K14/435GK101575370SQ200910040389
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者何庆瑜, 霆 雷 申请人:暨南大学