专利名称：可逆转水蛭素的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，具体的说，涉及改造后的水蛭素突变体，该水蛭素突变体与 凝血酶结合后可被凝血酶酶解逆转；还涉及该水蛭素突变体的应用。
背景技术：
水蛭素是医用水蛭Hirudo medicinal s分泌至其唾液腺的一种活性多肽，由 Markwardt. F 于 1955 年最先发现并命名(Markwardt F. Naturwissenschaften. 1955. 42. 53 7-538.)。水蛭素有多种异构体，其中三种主要异构体HV1、HV2、HV3都有明显的抗凝血酶活 性，占总异构体的85%以上。HV1-3都含有65 66个氨基酸残基，相对分子质量约7000 ； pI3 3. 5为酸性多肽；一级结构中含有6个半胱氨酸，形成三对链内二硫键(Cys6-Cysl4， Cysl6-Cys28, Cys22-Cys39)，位于肽键N端，对分子构型起稳定作用；酸性氨基酸集中在C 端区域，在C端的最后九个氨基酸残基中有五个酸性氨基酸，并在第63位有一个硫酸化的 酪氨酸，肽键中无Arg、Met、Trp ；肽键中部有一个由Pro-LyS47-Pro组成的特殊结构，其在 水蛭素与凝血酶相互作用中起较重要作用。水蛭素对凝血酶具有高度亲和性和抑制性作用，对凝血酶的抑制作用以1 1摩 尔比方式进行，是目前已知的自然界中最强的抗凝血酶抑制物。根据这一特性，人们开始了 大规模的临床应用研究，研究发现水蛭素可用于抗凝抗栓、治疗不稳定性心绞痛、急性心肌 梗塞、血管成形术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血等等。其抗凝效果明 显优于肝素，且无肝素诱导的血小板减小症和血栓复形成、肾衰等并发症。虽然用生物化学分离纯化技术可以从大量医用水蛭中分离纯化出天然水蛭素， 但是应用这种技术产率低，且饲养困难，故不能满足临床需求。1984年，Harvey等人 (Haycraft JB. et al. , Arch Exp Pathol PHarmakol 1884. 18. 209—17)构建了水蛭素的 cDNA文库，分离出编码水蛭素HV2的cDNA并在大肠杆菌中表达，从而拉开了利用基因工程 方法大规模生产重组水蛭素的序幕(Dodt J.et al, [J]. FEBS Lett. 1986. 202 (2). 373.； 毕群等[J].北京大学学报(自然科学版).1997. 33(6) :737-742;吴洁等，中国生物化 学与分子生物学报.2005. 21 (3). 287-291. ；G. Loison, etal [J]. Biotechnology. 1988.6 72-77. ；M. -D. Kim. et al, Appl Microbiol Biotechnol. 2004. 65 :259_262· ；Stuart A. et al,Protein expression and purification. 1996. 8 476-482. ；Anfeng Xiao et al,Appl Microbiol Biotechnol. 2006. 72. 837-844)。重组水蛭素构型与天然产物基本一致，仅63 位Tyr无硫酸酯化。FDA和欧洲分别批准重组水蛭素1印irudin(Refludan，Schering)和 desirudin(Revasc, Aventis)上市，分别用于肝素诱发的血小板减少症(HIT)和预防髋关 节置换(术)深部静脉血栓形成。由于水蛭素与凝血酶结全后具有不可逆转性，在临床研究中，发现有出血的副作 用。文献 艮道(Greinacher A. . New York =Marcel Dekker, Inc. ,2004, pp 397-436..； Greinacher H et al. Blood 2000 ；96 846-851. ；Eichler P et al, . Blood 2002 ； 100 (supplement 1) :704a. ；Lubenow N etal. Blood 2002 ； 100 (supplement 1) :502a.Tardy B et al, Blood. 2006 Sep 1 ； 108 (5) 1492-6. Epub2006May 11.)在治疗 HIT 病人 中，出血率为18. 8-20.4%，而出血死亡率为2.5%。该副作用限制了重组水蛭素在临床上 的广泛应用。为此本专利通过对水蛭素的结构改造，使改造后的水蛭素与凝血酶的结合具 可逆转性，能逐步恢复被抑制凝血酶的活性。从而有效克服水蛭素的出血风险，增加其抗凝 作用的适用范围。
发明内容
本发明的目的是通过对水蛭素的结构进行改造，使改造后的水蛭素突变体与凝血 酶结合后可被凝血酶酶解逆转。同时，该改造后的水蛭素突变体可作为治疗或预防的抗凝 药物，该药物能有效克服水蛭素在临床应用中导致出血的风险。天然水蛭素有多种异构体，其中三种主要异构体分别为Hirudin variant 1 (HVl)、Hirudinvariant 2 (HV2)、Hirudin variant 3 (HV3)，其相应的天然氨基酸序列为
权利要求
水蛭素改造成具有可逆转功能的水蛭素突变体。
2.根据权利要求1所述的可逆转水蛭素突变体，其特征在于，所述水蛭素突变体与凝 血酶结合后可被凝血酶酶解逆转，逐渐失去对凝血酶的抑制作用。
3.根据权利要求1所述的水蛭素，其特征在于，所述水蛭素包括其不同变异体(HV1、 HV2.HV3)或其相应N末端缺失四个氨基酸的变异体。
4.根据权利要求1所述的水蛭素突变体，其特征在于，所述水蛭素突变体具有如下特征a)将权利要求3的水蛭素变异体的第45位至第52位氨基酸被苯丙氨酸-脯氨酸-精 氨酸_脯氨酸_甘氨酸_甘氨酸_甘氨酸_甘氨酸取代，或；b)将权利要求3的水蛭素变异体的第41位至第52位氨基酸被甘氨酸-甘氨酸-甘氨 酸_甘氨酸_苯丙氨酸_脯氨酸_精氨酸_脯氨酸_甘氨酸_甘氨酸_甘氨酸_甘氨酸取 代。
5.根据权利要求1、2、4任一项所述的水蛭素突变体，其特征在于，所述水蛭素突变体 是通过重组cDNA技术，由酵母表达系统表达所得。
6.权利要求1所述的水蛭素突变体的应用，其特征在于，所述水蛭素突变体可用于制 备治疗或预防的抗凝药物。
全文摘要
本发明提供了一类可逆转的水蛭素，其特征为，将野生型水蛭素的氨基酸进行改造突变，改造后的水蛭素突变体与凝血酶结合后可被凝血酶酶解逆转而逐渐失去抑制凝血酶活性的功能。同时，这一类可逆转水蛭素可用于制备抗凝药物。
文档编号C07K14/815GK101993489SQ20091010465
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月20日 优先权日2009年8月20日
发明者张兰, 张益 , 范开, 陈勇, 陈海容 申请人:重庆富进生物医药有限公司