专利名称：一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及重组毕赤酵母菌林，特别是指一 种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌抹及其构建方法。
背景技术：
水蛭素是迄今为止所发现最强的天然的凝血酶特异抑制剂。动物试验与临床研 究表明，水蛭素能高效阻止血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板 反应等进一步血瘀现象。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内 源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝 血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。因此水蛭素可用 于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术 后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循 环和血液透析过程。1996年，Rosenfeld等首次在毕赤酵母中分泌表达了水蛭素蛋白，产量达到1.5g/L (Rosenfeld SA等,Protein Expr. Purif. 1996, 8: 476-482 ),但是在其文章中没有提到 水蛭素的降解问题。2002年张元兴、周祥山、周卫斌等在重组毕赤酵母发酵分泌表达 水蛭素时，发现虽然水蛭素的总产量比较高，但在发酵过程中水蛭素存在降解现象， 发酵过程中产生了4种具有较高比活的水蛭素异构体，它们分别是目的产物水蛭素 Hir65及Hir65的C-末端降解l-3个氨基酸的产物(Zhou XS等，Biotechnol. Lett. 2002, 24: 1449-1453; Zhou WB等，Preparative Biochemistry Biotechnology 2004， 34(3): 239-252 )。 这说明在毕赤酵母中存在一些降解水蛭素的蛋白酶，而且这些蛋白酶对水蛭素的降解 程度是比较厉害的，严重影响了水蛭素Hir65的产量，并影响了下游纯化。发明内容本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种有利于减少水蛭素 降解的重组毕赤酵母菌林及其构建方法，该菌抹能有效减少发酵过程中水蛭素的降 解，提高水蛭素的产量，并有助于下游的纯化，使得生产成本降低。在本发明的第 一方面，提供了 一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌抹，其特点是，所述重组毕赤酵母菌抹中含有失活的《五A7基因。相对于未失活的《五X/基因，所述的失活的K五JO基因的编码区及非编码区插入了或缺失了DNA片段。所述的失活的《￡W基因的编码区缺失了第289~1728位碱基序列，其编码的蛋白 酶缺失了第97 576位氨基酸。采用所述重组毕赤酵母菌抹表达水蛭素的发酵过程中，完整水蛭素占总水蛭素的 比例达到了 60% 90%,完整水蛭素产量达到了 2.9g/l。在本发明的第二方面，提供了一种制备上述重组毕赤酵母菌林的方法，其特点是， 包括步骤使一种毕赤酵母菌林含有的未失活的《五X7基因失活，从而获得所述重组 毕赤酵母菌林。在所述的未失活的K五JW基因的编码区及非编码区插入或缺失DNA片段。 采用Pop-In/Pop-Out的方法缺失了所述的未失活的基因编码区的第 289~ 1728位碱基序列，即缺失了其编码的蛋白酶的第97~576位氨基酸。 较佳地，包括步骤a. 构建ii:^0基因体外缺失片段；b. 构建含W We基因的pPOPBle载体；c. 将所述尤五A7基因体外缺失片段插入所述pPOPBle载体，获得pPOPBleAfex7 载体；d. 线性化所述pPOPBleAfex7载体，转化毕赤酵母菌GS115Hir。 本发明提供了的《EW基因缺失的重组毕赤酵母菌抹GS115HirAfex7,采用该菌抹表达水蛭素Hir65蛋白，在发酵诱导初期完整水蛭素占总水蛭素的比例达到了90%，到发酵 结束时也高于60%。而在相同的发酵条件下，KEA7基因未失活的毕赤酵母菌林中，完整 水蛭素占总水蛭素的比例一直只有40%左右。发酵结束后在K五X/基因失活的毕赤酵母菌 抹中完整水蛭素产量达到了2.9g/1，而在《EA7基因未失活的毕赤酵母菌抹中只有1.1 g/1。 所述本发明的m7基因缺失的重组毕赤酵母菌抹能有效抑制水蛭素降解，水蛭素表达量 显著提高，这样的结果并有助于下游的纯化，使得生产成本降低。
图1 a为制备本发明的 一具体实施例时扩增出的部分A&jd片段的电泳示意图一。 图1 b为制备本发明的 一具体实施例时扩增出的AA:ejc/片段的电泳示意图二 。 图2为PCR验证重组质粒pPOPBle的电泳示意图。 图3为PCR验证重组质粒pPOPBleA)te;c/的电泳示意图。图4为PCR验证/:iX7基因缺失的毕赤酵母菌抹GS 115HirAA:ex7的电泳示意图。 图5为GS115Hir菌抹和GS115HirAA;e;c7菌林发酵过程中菌体湿重和完整水蛭素Hir65的变化示意图。图6为GS115Hir菌抹和GS115HirAfex/菌抹发酵过程中完整水蛭素ffir65占总水蛭素比例的变化示意图。
具体实施方式
《EA7基因序列如GenBank登陆号Accesion No. AF095574所示，该基因编码一种类 似于羧肽酶B的蛋白酶。本发明通过失活毕赤酵母的^EJO基因从而减少水蛭素的降 解。术语"失活"指的是毕赤酵母的《&W基因"失活"后，不编码产物或编码的产 物不具有KEX1蛋白酶活性。本领域的技术人员知晓，任何在该K&W基因的编码区及 非编码区插入或缺失任何DNA片断，均可用于使该毕赤酵母菌林的《五X7基因失活。本发明具体采用Pop-In/Pop-Out的方法缺失该毕赤酵母菌林中《五X7基因编码区 的第289 1728位碱基序列，即缺失了其编妈的蛋白酶的第97 576位氨基酸。先对常规 的Pop-In/Pop-Out的基因缺失方法(Soderholm J等，说orec/zm々w^ 31: 306-312 )进行 了改进，用W We抗性基因替代原pPOP载体(Soderholm J等，5/or"/mz々wes 31: 306-312)上的^ C^基因。通过使用改进的Pop-In/Pop-Out方法，成功地构建出蛋白 酶KEA7基因缺失的重组毕赤酵母菌抹(GS115HirAfex7 )。通过采用Pop-In/Pop-Out的方法导致该重组毕赤酵母菌抹中失活的《五JW基因编 码的蛋白酶缺失第97~576位氨基酸后，所获得的GS115HirAfex7菌抹在发酵诱导初期 完整水蛭素占总水蛭素的比例达到了卯％，到发酵结束时高于60%。而在相同的发酵 条件下，K五义7基因未失活的毕赤酵母菌林中，完整水蛭素占总水蛭素的比例一直只 有40%左右。发酵结束后在《￡义7基因失活的毕赤酵母菌抹中完整水蛭素产量达到了 2.9g/l,而在尺五X 基因未失活的毕赤酵母菌林中只有l.l g/l。为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一 步说明。 实施例l JTEA7体外缺失片断的构建
以表达水蛭素的毕赤酵母GS115Hir菌抹(Zhou XS等,Biotechnol. Lett. 2002, 24:1449-1453; Zhou WB等，Preparative Biochemistry Biotechnology 2004， 34(3): 239-252 )染色体DNA作为模板，首先使用引物K1和K2用于扩增Afex7片段5'端的区域 (KEXl-up),扩增产物的大小为761bp (如图la所示)；引物K3和K4用于扩增Afe;d 片段3'端的区域(KEXl-down),扩增产物的大小为457bp (如图la所示)，将两个 片段分别回收。以回收的两个片段作为模板，以K1和K4为引物，进行第二轮PCR，最终得到Afex7 片段，大小为1200bp (如图lb所示)。引物K1: 5，- CCGTGCTCTAGAAACACAAGACCTT -3，； 引物K2: 5，- CTTATCGTCGACAAGGCACCATCCATAGA -3，； 引物K3: 5，- TGCCTTGTCGACGATAAGAAGGACAATAG -3，； 引物K4: 5，- CCGGAATTCGTAGATTGGCTGTTCG -3，。实施例2含"A/e基因的pPOPBle栽体的构建用引物B1和B2从含有抗性基因A We的质粒pPICZA (Invitrogen公司)上扩增出W We基因，大小为1300bp左右。将得到的A We基因用限制性内切酶Bg/ II和Sca I酶切， 然后回收酶切产物。将pPOP载体(Soderholm J等，说orec/ m々w^ 31: 306—312)用5g/ II and Sca I进行双 酶切，回收3.3kb大片段。将回收的W We基因酶切片段和pPOP载体大片段在16。C下进行连接反应，转化大 肠杆菌感受态细胞后，涂布于含Zeocin的LB平板，37。C过夜培养。在转化后长出的菌 落中随机挑选了几个菌落，摇瓶培养后抽质粒，用B1和B2引物做PCR验证(如图2所 示)。经初步验证正确的克隆送去测序，最终将此载体命名为pPOPBle。 引物B1: 5 ， - GAAAGTACTTGGTATTTCCCACTCC -3 ，； 引物B2: 5 ， - GAAGATCTTAGTCCTGTCGGGTTT -3 ，。实施例3 pPOPBleAAex 载体的构建将pPOPBle载体用S附a I进行单酶切，回收5.5kb线性化的载体片段。将回收的 pPOPBle栽体与Afe;c7片段在16。C下进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布 在含有Zeocin+IPTG+X-Gal的LB平板，37。C过夜培养。挑选长出的白色菌落，摇瓶培
养后抽质粒用K1和K4引物做PCR验证，扩增得到大小约1.3kb的片段(如图3所示)， 而理论阳性片段约为1.3kb。将筛选到的2号阳性克隆送去测序，测序正确后将载体命 名为pPOPBleAfe;c7。用限制性内切酶7YW11 I将pPOPBleAi^;c7进行单酶切线性化，然 后回收线性化的载体片段。实施例4转化和Zeocin抗性菌林的筛选取线性化的pPOPBleAfeW载体0.5mg,电击转入宿主毕赤酵母菌GS115Hir,涂布 在含有Zeocin的YPD平板上，大约2-3天后长出转化菌落，从中挑选8个单菌落，将这8 个菌摇瓶扩增后，抽提每个菌的染色体，然后用引物K1和K4，以及K1和V2验证。阳 性克隆用引物K1和K4验证时能扩增出两条带；而用K1和V2验证时，阳性克隆理论上 有一条6.2kb条带(常规PCR扩不出)，还能扩增出一条1.3kb条带。结果在挑选的8个 菌落中只有7号菌是阳性的，该菌抹命名为GS115HirA&x7Zeo 。 引物V2: 5，- TTACTCCGTCAGCAAAAACGTCTAG -3，。实施例6 Methomyl敏感菌林的筛选将上面筛选到的GS115HirA&x7Zeo菌林在摇瓶中培养过夜，取一定量的菌体，用 无菌水菌体稀释到一定浓度浓度，使每块YPD+Methomyl平板上涂布l(^个细胞，28°C 下培养2天。从平板上挑选7个单菌落，摇瓶扩增后，抽提每个菌的染色体，然后用引 物V1和V2验证。请参见图4，在这7个菌中，其中l、 2、 5、 6四个菌发生了《五JW基因 的缺失，有3个菌回复了野生型。将其中经PCR初步验证正确的1号克隆菌送去测序， 结果和理论吻合，确实发生了/:五u基因的缺失，将这林缺失菌抹命名为 GS115HirMe丄引物V1: 5，- AGATTCTGAGTGGAACTTTTGGTGA -3，。实施例6 GS115Hir和GS115HirA/^W生长和水蛭素表达情况分别取表达水蛭素的毕赤酵母GS115Hir和GS115HirAybjd菌抹，按照文献(ZhouXS等，Biotechnol. Lett. 2002， 24:1449-1453 )中的步骤，采用相同的发酵控制策略，在5-L发酵罐中发酵表达水蛭素，结果如图5所示在细胞湿重近似相同的情况下，蛋白酶缺失菌林GS115Hir Afe;d的完整水蛭素Hir65表达量明显比未缺失菌抹高，GS115HirMe;c/的最高Hir65表达量可达2.9 g/1,而GS115Hir只有l.lg/1。这说明蛋白酶 缺失菌林GS115HirAfe;d在较好地抑制了水蛭素的降解。两株菌抹发酵过程中完整水蛭素占全部水蛭素的比例(完整水蛭素浓度Hir65与 水蛭素总量的比值)的变化情况如图6所示，初始诱导阶段(10h内)，菌抹GS115Hir 的完整水蛭素比例迅速从100%降至45%左右，到发酵后期最低达到33% 。而对于蛋白 酶缺失菌林GS 115HirAfe;d ，其完整水蛭素比例在初始诱导阶段几乎维持在100 %左 右。随着诱导时间的延长，完整水蛭素比例也没有出现明显下降，直到诱导后期才迅 速下降，但也高达62%。通过完整水蛭素比例的比较进一步说明了使用KEX1蛋白酶 缺失菌抹很好的抑制了水蛭素的降解。综上所述，本发明的有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌林能有效减少发酵 过程中水蛭素的降解，提高水蛭素的产量，并有助于下游的纯化，使得生产成本降低。需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每 一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例 及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对 本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发 明的范围内。
权利要求
1.一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌株中含有失活的KEX1基因。
2. 如权利要求i所述的重组毕赤酵母菌林，其特征在于，相对于未失活的K五;o基因，所述的失活的^07基因的编码区及非编码区插入了或缺失了DNA片段。
3. 如权利要求2所述的重组毕赤酵母菌抹，其特征在于，所述的失活的《￡义7基因的 编码区缺失了第289 1728位碱基序列，其编码的蛋白酶缺失了第97 576位氨基酸。
4. 如权利要求3所述的重组毕赤酵母菌抹，其特征在于，采用所述重组毕赤酵母菌抹 表达水蛭素的发酵过程中，完整水蛭素占总水蛭素的比例达到了 60%~卯％,完整 水蛭素产量达到了2.9g/1。
5. —种制备如权利要求l所述的重组毕赤酵母菌抹的方法，其特征在于，包括步骤 使一种毕赤酵母菌林含有的未失活的尺EX7基因失活，从而获得所述重组毕赤酵母 菌抹。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述的未失活的《￡义7基因的编码区及 非编码区插入或缺失DNA片,殳。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，采用Pop-In/P叩-Out的方法缺失了所述的 未失活的《五U基因编码区的第289~1728位碱基序列，即缺失了其编码的蛋白酶的 第97 576位氨基酸。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括步骤a. 构建i:五JO基因体外缺失片段；b. 构建含W We基因的pPOPBle栽体；c. 将所述《5LW基因体外缺失片段插入所述pPOPBle载体，获得pPOPBleAfex7 载体；d. 线性化所述pPOPBleA^;d载体，转化毕赤酵母菌GS115Hir。
全文摘要
本发明提供了一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株，其内含有失活的KEX1基因，相对于未失活的KEX1基因，失活的KEX1基因的编码区及非编码区插入了或缺失了DNA片段，更具体地，失活的KEX1基因的编码区缺失了第289～1728位碱基序列，即其编码的蛋白酶缺失了第97～576位氨基酸，采用该重组毕赤酵母菌株表达水蛭素的发酵过程中，完整水蛭素占总水蛭素的比例达到60％～90％，完整水蛭素产量达到2.9g/l。还提供了一种制备上述重组毕赤酵母菌株的方法。本发明有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株能有效减少发酵过程中水蛭素的降解，提高水蛭素的产量，并有助于下游的纯化，使得生产成本降低。
文档编号C12N1/19GK101157896SQ20071004623
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月21日 优先权日2007年9月21日
发明者倪振华, 周祥山, 张元兴 申请人:华东理工大学;山东东阿阿胶股份有限公司