专利名称：Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶及其制备方法与应用,其多克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体涉及一种用于定点整合的蛋白酶Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶及其制备方法和应用，其多克隆抗体及其应用。
技术背景噬菌体Phi BT1整合酶作为丝氨酸重组酶家族的一员，具有在生物体外和体内识别特 异性核酸序列，进行不可逆的DNA重组反应的能力。在哺乳动物细胞中，噬菌体Phi BT1整合酶可将外源核苷酸序列定点整合到基因组的 特异性位点上，近年来已成为在哺乳动物细胞中进行转基因位点特异性重组操作和基因治 疗的有用工具。在生物体外的基因操作中，噬菌体Phi BT1整合酶可以将带有特定核酸序列(attB，attP) 的大片段核酸分子，进行分子间和分子内的重组，构建出新的核酸分子，从而成为DNA 重组的工具。本发明以原核表达系统表达纯化了毫克级的Phi BTl-TAT-NLS -HIS6整合酶，在体内 外建立了应用重组Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的方法。并以纯化的Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白为抗原，制备了动物抗Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的多克隆抗体， 抗体特异性检测证明其可以特异性识别Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶，可以用于检测Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白和封闭Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的作用。 发明内容本发明的目的在于提供一种Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白的功能性表达和多克 隆抗体制备方法与应用。1.本发明提出的表达重组Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白的方法如下 使用大肠杆菌表达Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白并用NTA树脂纯化Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白。利用基于PCR引物末端修饰的技术，通过多轮PCR操 作在Phi BT1整合酶表达框架3、附加表达编码-TAT -NLS -HIS6的序列，从而形成Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶标大框架，将其克隆到原核表达载体pET22b(+) (Novagen, USA) 上，经测序鉴定正确后，转化到BL21(DE3)菌株(Promega,USA)中，进行大量诱导表达和 纯化。为保证其活性，探索到条件为低温诱导(15-25QC， 12-24小时)，采用含咪唑的 高盐缓冲液(0.5-2MNaCl)梯度洗脱收集纯化蛋白。 2. 表达纯化Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白的应用Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白应用Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白在体外可以用于介 导两个含有PhiBTl特异性的分子之间的DNA片段之间的互换，实现体外常规基因操作； Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白可以与含有Phi BT1特异性att序列的基因片段共同转染细 胞，并且可以介导该外源基因整合到宿主染色体DNA。3. 制备Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白多克隆抗体及抗体应用利用原核表达的噬菌体Phi BTl-TAT-NLS -HIS6整合酶蛋白，按常规方法与福氏佐剂 (Sigma)混合免疫新西兰大白兔，第一次Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白与完全福氏佐 剂(Sigma)混合免疫，然后每1-2周用Phi BTl-TAT -NLS .HIS6整合酶蛋白与不完全福氏佐剂 (Sigma)强化免疫，最后常规放血植被血清，该血清为用蛋白A-S印harose (Amersham Pharmacia Biotech AB)从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG即为制备的抗Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的多克隆抗体，此抗体可以特异性识别真核与原核表达的Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶。并能够在免疫组织化学方面定位Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白 及封闭Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的作用。
图1表达纯化PhiBTl-TAT-NLS-His6。图片上方序号为泳道，右侧数值为分子量。1:阴性对照；2:表达Phi BT1-TAT-NLS-His6 细菌全菌裂解液；3:表达PhiBTl-TAT-NLS-His6细菌裂解液可溶部分；4:洗柱液，第一 次；5:洗柱液，第二次；6， 7:含纯化Phi BT1-TAT-NLS-His6的洗脱液；8:低分子量蛋 白标准品。图2制备Phi BT1多克隆抗体的滴度与特异性A:连续稀释滴定PhiBTl多克隆抗体的滴度；B:用Phi BT1多克隆抗体检测表达Phi BT1-TAT-NLS-His6细菌全菌裂解液westernblots。图3 Phi BT1多克隆抗体检测PhiBTl细胞内定位1:表达Phi BT1的细胞用DAPI染色；2:同一视野用Phi BT1多克隆抗体-罗丹名染色。
具体实施方式
1.构建表达Phi BTl-TAT -NLS -HIS6的质粒(1)使用附加Nde I位点PhiBTl整合酶基因特异性5、引物(SEQ n")和附加TAT 编码序列的phiBTl整合酶基因特异性3、引物(SEQ Nq2)，采用常规PCR方法(分子克隆) 从Phi BT1基因组中扩增产生含3'附加TAT编码序列的Phi BT1整合酶阅读框。PCR体系(引物(SEQ M"2l;SEQ W2)， PfU DNA polymerase lu(lul, Sagon)， Pfo DNA polymerase buffer 5ul (Sagon), Phi BT基因组DNA lul, H20 39ul), PCR循环(94。C lmin， 94°C 30sec-55 °C 30sec-72°C lmin循环25次，72°C 5min)。常规纯化PCR产物(Qiagen PCR purification kit)。采用Qiagen PCR extract kit纯化(反应物加PB Buffer (Qiagen) 500ul并混匀，混合物 加到PCR extract column (Qiagen) 1200rpm离心lmin,用0.5ml PE buffer (Qiagen) 1200rpm 离心lmin清洗一次，再1200rpm离心lmin —次，PCR extract column力B 50ul Elute buffer (Qiagen), 1200rpm离心lmin洗脱)收集产物。(2) 使用附加Nde I位点phiBTl整合酶基因特异性5'引物(SEQ N")和附加部分 NLS编码序列，TAT特异性3、引物(SEQ Ns3)，以(1)纯化的PCR产物为模板，常规 PCR，条件同上(1)，扩增产生编码C端附加TAT和部分NLS序列的Phi BT1整合酶阅读 框，如(1)所描述的常规方法纯化PCR产物(Qiagen PCR purification kit)。(3) 使用附加NdeI位点PhiBTl整合酶基因特异性5'引物(SEQ N21)和附加其余 部分NLS和His6表达标签和Xho I酶切位点的NLS特异性引物(SEQ Ns4)，以(2)纯 化PCR产物为模板，常规PCR扩增产生编码C端附加TAT - NLS -HIS6序列的Phi BT1 整合酶阅读框，如(1)所描述的常规方法纯化PCR产物(Qiagen PCR purification kit)。(4) 按分子克隆描述的常规方法，pET22b和(3)纯化PCR产物分别常规用Nde I 和Xho I双酶切。酶切体系PCR纯化产物44ul或pET22b 44ul (lug), Nde I 5u (Bio lab. lul), Xho I 5 u (Bio lab.), 10X buffer II 5ul(Bio lab.), 37°C 12h。采用切胶回收试剂(Qiagen gel extraction kit)回收，l%argarose gel电泳分离酶切片段，目的片段切胶后用buffer QG 55°C 溶解lOmin,混合物加到PCR extract column (Qiagen) 1200rpm离心lmin，用0.5ml PE buffer (Qiagen) 1200rpm离心lmin清洗一次，再1200rpm离心lmin —次，extract column力B 50ul Elute buffer (Qiagen)， 1200rpm离心lmin洗脱收集产物。用T4连接酶将表达Phi BTl-TAT -NLS -HIS6的框架插入pET22b (连接体系连接pET22b质粒骨架4ul，表达Phi BTl-TAT -NLS -HIS6的框架片段4ul， T4 ligase lul (Bio Lab.)， 10X T4 ligase buffer lul, 16°C, 12h)。 常规转化细菌感受态细胞，鉴定阳性克隆，抽提质粒以及重组质粒测序验证。连接产物用 分子克隆所提供的常规方法转化DH5 alpha感受态细胞，筛选阳性(抗氨苄青霉素)克隆 10个，使用分子克隆所描述的常规方法抽提相应的质粒。质粒测序鉴定采用序列pET22 通用引物作为引物对上述质粒在ABI3700上测序分析，所得序列结果常规作Blastn分析确 定插入序列。2.表达纯化Phi BTl-TAT-NLS-11186蛋白及应用 (1 )表达纯化Phi BTl-TAT-NLS-HIS6蛋白pET-22b-OC31常规转化fco乃'BL21
(DE3)。单个克隆接种到含氨苄青霉素(25ug/ml)的LB培养基，250rpm, 37'C培养到 0D6。。=0.8，加0. 1 mM IPTG在250 rpm低温(如15-25 。C)诱导表达12-24 h。常规离心 收集细菌，重悬于细菌裂解缓冲液(20 mM Tris-Cl, pH 8， 1 M NaCl, 20 mM imidazole)， 超声波破菌，12, 000 g离心40 min，收集上清液，上清液通过0. 25um滤膜后加到Ni-NTA agarose亲和纯化柱，用细菌裂解缓冲液充分洗涤，然后用洗脱缓冲液(20 mM Tris-Cl， pH 8， 0.5-2 M NaCl, 500 mM imidazole)洗脱，收集物为Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白。 进一步用超滤方法浓縮到保存缓冲液(5 mM Tris-Cl， pH 8， 1 M NaCl， 10% glycerol)。 -70'C保存。(2 ) Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白应用① Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白体外介导框架互换一在pBCFX+和pBCFX-定向插入 目的DNA片段5、引物合成按常规方法设计基因特异性引物，在设计的基因特异性引物5'附加序列 (SEQW5)，常规合成引物。3'引物合成按常规方法设计基因特异性引物，在设计的基 因特异性引物3'附加序列(SEQM6， pBCFX+; SEQ pBCFX-)，常规合成引物。制备 插入目的基因片段使用上述l)/2)所描述的引物和适当的模板，DNA聚合酶以及PCR条 件常规扩增插入片段，采用Qiagen PCR extract kit纯化。框架交换维持pBCFX+或pBCFX-与插入片段的分子数约1:1，每种分子质量不少于100ng，在50 ul整合酶反应物(50 mM glycine-NaOH, pH 8.5, 100 mM KC1, 10 mM DTT， 0.01 % bovine serum albumin, and 0.1 <DC31 integrase和0.1 ①BT1 integase) 22 'C作用30 min -12h。也可以常规用插入片段与 pBCFX+或pBCFX-以及OC31 integmse和OBTl共转染实现框架交换。阳性克隆筛选10ul 框架交换产物常规转化DH5 alpha感受态细胞，涂布含X-gal和氯霉素的LB细菌培养板，37 'C生长12-20h,常规蓝白筛选阳性克隆。含插入片段的克隆由于丢失LacZ而表现为白色克 隆，常规抽提质粒继序列测定确定重组子的正确性。② Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白介导细胞外源基因染色体整合在一对基因特异性引物两侧附加恰当的酶切位点，依据目的和载体质粒的特性在其中 一个引物的酶切位点内侧与基因特异性序列之间附加Phi BTl特异性attB序列(SEQ NS6 或SEQ Na7),常规限制性酶切，连接到含哺乳动物表达NeoR的质粒(如pcDNA3. 1 myc-his-, invitrogen),重组质粒常规转染HEK细胞，Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白常规转导HEK细 胞，24h后用G418常规筛选2-3周。据有稳定表达的细胞为有目的基因染色体插入的细胞， 通过常规质粒拯救试验确定插入的具体位点。3.制备PhiBTl蛋白多克隆抗体及抗体应用(1) 制备PhiBTl多克隆抗体多克隆抗体的生产可用纯化的PhiBTl蛋白直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大 鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。抗Phi BT1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术以及免疫学的试验中，也可以检测活检标本中 的PhiBTl蛋白和突变修饰的PhiBTl蛋白及跟踪其位置和分布。用0. lmg上述PhiBTl蛋白加上完全弗氏佐剂免疫家兔，每隔7-14天后再用PMBTl 蛋白加不完全弗氏佐剂加强免疫四次。采用经10ixg/ml的Phi BT1蛋白包被的滴定板做 ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-S印harose从抗体阳性的家兔血清中分离总 IgG。将多肽结合于溴化氰活化的S印harose 4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多 肽抗体。ELISA实验的抗体效价分析表明，抗体达到要求。蛋白免疫印记实验证明多克隆 抗体可特异性地与Phi BT1结合(2) PhiBTl多克隆抗体的应用---检测PhiBTl的亚细胞分布特性对经Phi BT1整合酶DNA、 RNA转染和蛋白转导的哺乳动物细胞，用PBS清洗，多 聚甲醛固定后，用制备的PhiBTl的多克隆抗体包被，罗丹明偶联的抗兔第二抗体作用后， DAPI染核。标本利用蔡司公司的双光子激光共聚焦显微镜检测细胞图像表明PhiBTl多克 隆抗体能够用免疫细胞组织化学的方法，很好的定位和跟踪各种途径表达的PhiBTl整合 酶。
本发明所涉及的序列 SEQ. Nq1:5"'-ggaattccatatgtcgcccttcatcgctccc-3 SEQ.Nq2:5、 -aaccttcctcttcttcttagggcggcggcgctggcggcgtttcttgcg-3 、 SEQ.Ns3:5' -gctggcggc gtttcttgcgtccgtacagcgccgcaagctcccgctcag-3 、 SEQ.Na4:5'-ccgctcgagctagtggtggtggtggtggtgaaccttcctcttcttc-3、 SEQ. Na5:5 、 -ccgcggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactcc-3' SEQ. N26:5'-gcccgctgccgtccttgaccaggtttttgacgaaagtgatccagatgatccagctccacaccccgaacgcgag-3 SEQ. Nq7:5 、 -gagcgcaagccccacacctcgacctagtagacctagtgaaagcagtttttggaccagttcctgcc gtc gccc g-权利要求
1.一种表达重组Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白的方法，其特征在于具体步骤使用大肠杆菌表达Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白并用NTA树脂纯化PhiBT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白，利用基于PCR引物末端修饰的技术，通过多轮PCR操作在Phi BT1整合酶表达框架3′附加表达编码-TAT-NLS-HIS6的序列，从而形成PhiBT1-TAT-NLS-HIS6整合酶标大框架，将其克隆到原核表达载体pET22b(+)上，经测序鉴定正确后，转化到BL21菌株中，进行大量诱导表达和纯化；条件为诱导温度15-25℃，时间12-24小时，采用含咪唑的高盐缓冲液梯度洗脱收集纯化蛋白。
2、 一种重组Phi BT1-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白，由权利要求1所述方法表达。
3、 一种如权利要求2所述重组Phi BT1-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白的的应用，其特 征在于该项蛋白在体外用于介导两个含有Phi BT1特异性的分子之间的DNA片段之间的 互换，实现体外常规基因操作；或者Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白与含有Phi BT1特异性 att序列的基因片段共同转染细胞，并且介导该外源基因整合到宿主染色体DNA。
4、 一种PhiBTl-TAT-NLS-HIS6蛋白多克隆抗体，由下述方法获得 利用原核表达的噬菌体PWBT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白，与福氏佐剂混合免疫新西兰大白兔，第一次Phi BT1-TAT-NLS -HIS6整合酶蛋白与完全福氏佐剂混合免疫，然后每 1-2周用Phi BT1-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白与不完全福氏佐剂强化免疫,最后常规放血植 被血清，该血清为用蛋白A-S印harose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG即为制备的抗 Phi BT1-TAT -NLS -HIS6整合酶的多克隆抗体。
5、 如权利要求4所述的多克隆抗体在特异性识别PhiBTl整合酶蛋白质的应用。
全文摘要
本发明属生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种用于定点整合的蛋白酶Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶及其制备方法，其多克隆抗体及其应用。首先表达纯化Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白质，该蛋白质保持PhiBT1整合酶的基本特性，但是其可以通过蛋白转导进入高等生物细胞，并增加蛋白向细胞核转移的能力，同时适用于细胞外体系以及活细胞体系中介导特异性附加在attP与attB上的DNA分子之间的交换与转移等基因操作。用Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白质直接与佐剂相混合，注射免疫动物，制得Phi BT1整合酶多克隆抗体。该抗体可以用于特异性识别Phi BT1整合酶蛋白质。
文档编号C12N1/21GK101157906SQ200710046170
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月20日 优先权日2007年9月20日
发明者丁晓明, 姚纪花, 聆 田, 薛京伦, 赵国屏, 陈金中 申请人:复旦大学