专利名称：：一种羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类用放射性核素标记的化合物，以及这种化合物的制备方法和用途，具体讲本发明所涉及的是羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物。技术背景恶性肿瘤是导致人类非正常死亡的主要疾病之一，在我国和全世界的疾病死亡率和死亡原因上排在前列。乏氧是人和动物肿瘤共有的特征，实验观察与测定表明实体瘤中乏氧细胞的比例一般为10-20%，有的甚至高达50%。目前针对恶性肿瘤的治疗手段除手术外主要是放疗和化疗，但是乏氧导致肿瘤组织对放疗和化疗不敏感，大大提高了其对放疗和化疗的抵抗性；同时，乏氧使肿瘤内氧调节蛋白(ORP)、血管内皮生长因子(VEGF)等过度表达而使其自身的侵袭性增加；此外，肿瘤乏氧还可以导致细胞凋亡和诱发肿瘤血管生成。因此，肿瘤细胞氧水平的测定在临床上具有重要意义，有助于肿瘤的早期诊断、治疗方案的确定及疗效评价。放射性药物最重要的应用价值是研究生命过程中的生化变化；利用放射性核素标记的小分子进行PET或者SPECT显像可以活体非侵入性诊断各种疾病，是近年来分子影像学最活跃的研究领域。肿瘤乏氧显像剂是一类阳性显像剂，能选择性地滞留在乏氧组织或细胞中，并通过核医学显像探测组织缺氧及其程度，它是近年来放射性药物的研究热点之一。理想的肿瘤乏氧显像剂应具备以下一些条件①有足够的量选择性浓集于乏氧区并具有一定的滞留时间；②为探测组织氧压的细微变化，能提供可靠的正常组织与缺血组织的对照；③显像质量高，病人受辐照剂量小。目前已用于临床研究的肿瘤乏氧显像剂包括18FMISO，99mTc-HL91，64Cu-ATSM等，但是它们的临床显像性能并不理想，主要的问题包括肿瘤绝对摄取偏低，正常组织清除较慢，肝腹部放射性浓集等。国内外的研究人员为了获得显像性质更加优异的肿瘤乏氧显像剂，进行了广泛而深入的研究，探索了一系列18F、99mTc、123/125I和62/64Cu等标记的硝基咪唑类或非硝基咪唑类衍生物，但遗憾的是这些衍生物在临床显像价值方面并没有实质性突破。因此研究具有理想的临床显像效果的新型肿瘤乏氧显像剂仍是本
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的一个重要研究课题。99mTc是用于核医学SPECT显像的理想核素，羰基锝核心已广泛用于99mTc药物的研究。中国专利95108299.X公开了一种肿瘤阳性显像剂标记平阳霉素用药盒，该药物采用显像剂锝[Tc-99m]标记平阳霉素(PYM)专用药盒，采用抗癌药PYM、微量亚锡盐、盐酸、生理盐水及其他添加剂等为原材料，用Tc-99m作为放射性示踪原子，可用于核医学临床癌症诊断。中国专利96194172.3公开了可用作诊断心血管疾病，感染性疾病和癌症造影剂的新的放射药物。该放射药物由膦或胂结合锝-99m标记的肼或二嗪修饰的生物活性分子组成，所述活性分子可选择性地对疾病位点进行定位，从而通过Y闪烁照相法可得到所处位点的影像。中国发明专利申请200780024367.5公开一种锝标记的锡纳米胶体及其制备方法。所述胶体通过将放射性锝或其化合物的溶液与含有锡或其化合物、钠或其化合物、泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮的溶液混合来制备。
发明内容本发明提供一类用于肿瘤乏氧显像的放射性示踪剂或者说药物，以及这种示踪剂的制备方法及其用途。本发明的放射性示踪剂是羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其结构通式如式l所示式2中n=110。优选地本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物是n=3.本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的制备方法(示3)是a.将聚乙二醇和三乙胺溶于二氯甲烷中，再在其中缓慢滴加溶有对甲苯磺酰氯的二氯甲烷的溶液，充分反应后，抽滤除去固体，滤液经水洗后除去溶剂得粘稠液体状的化合物l，其中聚合度n为l10中的任一个；b.将化合物l和2-硝基咪唑，以及Na2C03加入到CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物2;c.将化合物2和NaN3加入到DMF中，加热反应，减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物3;d.将PPh3(三苯基磷)、化合物3和水溶解于THF中，充分反应后除去溶剂，并用硅胶柱过柱纯化，得化合物4;e.将化合物4溶于甲酸乙酯，回流充分反应，除去溶剂，并用硅胶柱过柱式l中R如式2所示纯化，得化合物5;f.冰浴条件下，将含有SOCl2的无水THF溶液缓慢滴加到化合物5溶于THF的溶液中，经充分反应后，将溶液调节为弱碱性后除去溶剂，并用硅胶柱过柱纯化，得配体NC-PEGn-NIM;TsCITsO2-硝基咪唑OTsOTsNaN，1:n=1~101a:n=32:n=1~102s:n=3HCOOEt3:n=1~103a:n=34:n=1~104a:n=3SOCI,N-CHO3H5:n=1~105a:n=3NC-PEGn-國n=1~10NC-PEG3-NIM:n=3式3:各中间体和2-硝基咪唑配体的合成路线g.将配体NC-PEGn-NIM与新鲜制备的pH值己调节为9~10的["mTc(CO)3(H20)3]+中间体(参考文献AlbertoR.,SchibliR.,EgliA.,Schubiger,AP.JAmChemSoc,1998(120),7987-7988)在沸水浴中加热反应，得到羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物["，c(CO)3(NC-PEGn-NIM)3;T(见式l)。以上制备方法中所用的聚乙二醇聚合度为iio。作为本发明的最佳实施例的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的制备方法是；a.将三縮四乙二醇30mmol和三乙胺90mmol溶于30mL二氯甲垸，缓慢滴加对甲苯磺酰氯66mmol溶于二氯甲烷30mL的溶液，完成后继续室温反应4小时后，抽滤除去固体，滤液水洗后干燥处理再除去溶剂得粘稠状液体的化合物la;b.将化合物la(15.6mmol)、2-硝基咪唑(13mmol)和Na2C03(15.6mmo1)加入到50mL乙腈中，回流反应，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体2a;c.将化合物2a(4.51mmol)、NaN3(5.41mmol)加入到2mLDMF中，加热到IO(TC充分反应，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物3a;d.将PPh3(5.35mmo1)，化合物3a(4.20mmol)和水0.8g溶解于10mLTHF中，在30-40'C充分反应，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物的化合物4a;e.将化合物4a(0.347mmol)溶于5mL甲酸乙酯，回流反应充分后，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物的化合物5a;f.在冰浴条件下，将含有14uLSOCl2的lmL无水THF溶液缓慢滴加到化合物5a(0.215mmol)溶于lmLTHF的溶液中，在搅拌条件下继续室温反应充分后，用氨水将溶液调节为弱碱性，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物的配体NC-PEGrNIM;g.将新鲜制备的["，c(CO)3(H20)3]+中间体溶液调节p1^910，再在其中加入0.1mL浓度为1mg/mL的NC-PEGrNIM配体溶液，摇匀后在沸水浴中加热反应充分得羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物[99mTc(CO)3(NC-PEG3-NIM)3]+(见式4)。本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物可在制备肿瘤乏氧显像剂中的应用。本发明涉及的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，从结构上，该类配合物的靶向基团是2-硝基咪唑，三个配体分子通过异腈(-NC)基团参与羰基锝配位。改变会影响配体及配合物的水溶性，进而影响到"mTc标记产物的药代动力学等;但是它不会影响配体的锝标记性能，也不会影响2-硝基咪唑的肿瘤乏氧靶向特性；因此，本发明对连接基团的PEG的聚合度n没有特别要求，n的数目可在1-10之间，它们对应的羰基锝标记产物都会具有亲肿瘤特性，可通过SPECT进行肿瘤乏氧显像。由于2-硝基咪唑是靶向作用于乏氧细胞的的生物分子，聚乙二醇(PEG)是一种广为应用的药效调节基团，同时本发明的配合物中含有三个耙向分子，因此["mTc(CO)3]+标记的聚乙二醇化(PEGykted)2-硝基咪唑配合物具有良好的肿瘤乏氧细胞亲和力，可提高肿瘤对药物的摄取，达到更好的显像诊断结果。具体实施例方式以下给出本发明的一个具体实施例，在这一实施例中所用聚乙二醇连接基团的聚合度n为3。聚乙二醇化2-硝基咪唑配体的合成化合物la(Tetraethyleneglycoldi(p-toluenesulfonate)):将三縮四乙二醇(5.82g，30mmo1)和三乙胺(9.1g，90mmo1)溶于30mL二氯甲垸，缓慢滴加对甲苯磺酰氯(12.6g，66mmo1)溶于二氯甲烷(30mL)的溶液，完成后继续室温反应4小时后，抽滤除去固体，滤液水洗4次，有机相干燥后真空除去溶剂得粘稠状液体12.67g(25.2mmol，84%)。'HNMR(400MHz,CDC13):5=2.45(s,6H,OC坊)，3.57(s,8H),3.68(t,4H,/=4.5Hz),4.15(t,4H,■/=4.5Hz),7.34(d，4H，8.1Hz),7.79(d,4H，/=8.1Hz)，ppm.化合物2a(2-(2-(2-(2-(2-nitro國]H-imidazol-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl4-methylbenzenesulfonate):将化合物1(7.8g，15.6mmol)、2-硝基咪唑(1.5g，13mmol)禾卩Na2C03(1.65g，15,6mmol)加入到50mLCH3CN中，回流反应15h;旋干除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体2.70g(6.09mmol，46.8%)。EI-MS:442(M十)化合物3a(1醫(2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-2-nitro-lH-imidazole):将化合物2a(2g，4.51mmol)禾口NaN3(351.8mg,5.41mmol)加入到2mLDMF中，加热到10(TC反应2h;减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体1.32g(4.20mmol，93.1%)。&NMR(400MHz,CDC13):3=3.40(t，2H),3.60-3.70(m,10H),3.86(t,2H),4.63(t,2H),7.13(s,1H)，7.29(s，1H),ppm.ESI-MS:315.1(MH+)化合物4a(2-(2-(2-(2-(2-nitro-lH-imidazo1-l-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethanamine):将PPh3(1.40g，5.35mmo1)，化合物3a(1.32g，4.20mmo1)和水(0.8g)溶解于10mLTHF中，30-40。C反应36小时；减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物1.04g(3.61mmol，86.0%)。&NMR(400MHz,CDC13):3=2.87(t,2H),3.49-3.61(m,10H),3.86(t,2H),4.63(t,2H)，7.13(s,1H)，7.28(s，1H),ppm.ESI-MS:289.1(MlT)化合物5a(N-(2-(2-(2-(2-(2-nitro-lH-imidazol-l-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)formamide):将化合物4a(100mg，0.347mmol)溶于5mL甲酸乙酯，回流反应8个小时，减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物68mg(0.215mmol,62.0%)。'HNMR(400MHz,CDC13):2.12(s,1H),3.49-3.62(m,12H),3.86(t,2H),4.66(t,2H),7.14(s,1H),7.25(s，1H),8.20(s,1H),ppm.ESI-MS:317.2(Mtf)。酉己体NC-PEGrNIM(l-(2-(2-(2-(2國isocyanoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-2-nitro-lH-imidazole):冰浴条件下，将含有14wLSOCl2的lmL无水THF溶液缓慢滴加到化合物5a(68mg，0.215mmol)溶于lmL无水THF的溶液中，完成后继续室温反应3小时，用氨水将溶液调节为弱碱性，减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物10mg(0.0335mmo1，15.6。/。)？HNMR(400MHz，CDC13):3.61—3.67(m，10H),3.76(t,2H)，3.84(t,2H)，4.20(t,2H),7.14(s,1H),7.28(s,1H),ppm.ESI画MS:297.3(M-H+)。以上反应参见式3.羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的制备+(式4)的制备将新鲜制备的["，c(CO)3(H2O)3]+中间体溶液调节pH二910;在一西林瓶中加入O.lmL1mg/mL的NC-PEG3-NIM配体溶液和0.4mL已经调节pH值的中间体溶液(10mCi)，摇匀后在沸水浴中加热反应15min。羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的检测采用薄层层析(TLC)法鉴定以聚酰胺薄片为支持体，展开体系为丙酮/生理盐水=1/1，待展开结束后，将聚酰胺薄片等分成10段，用Y-计数仪测定各段的放射性计数，羰基锝标记的各2-硝基咪唑配合物的Rf值在0.40.7之间，而["，c(CO)3(H20)3]+中间体的Rf值为0。TLC分析结果表明按照上述方法制备的[，Tc(CO)3(NC-PEG3-NIM)3]+的放化纯大于95%;并且室温放置6h放化纯无明显变化，表明配合物具有良好的稳定性。羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的脂水分配系数将正辛醇与磷酸盐缓冲液(25mM，pH=7.4)等体积混合，加入适量待测标记配合物，充分振摇后，高速离心分层，取等体积有机相和水相，分别测定两相的放射性计数，待测配合物的分配系数P为有机相与水相放射性计数的比值，多次重复该操作，求均值。脂水分配系数一般以LogP表示。测定结果表明配合物为水溶性，["mTc(CO)3(NC-PEG3-NIM)3]+的LogP值为1.48±0.34。羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的荷瘤小鼠体内分布荷S180肉瘤小鼠模型于雌性昆明小鼠(体重约20-22g)左前腋下植入2xl(^个S180肿瘤细胞，饲养约10天后，肿瘤直径生长至6-10mm，质量约为0.4-1.0g。通过荷S180肉瘤小鼠尾静脉注射适量待测配合物，注射后5、30、60、120min将小鼠断头处死，取其肿瘤、血、心、肝、脾、肺、肾、小肠、脑、骨、肌肉等感兴趣的器官与组织，分别称重后测量其放射性计数，结果以每克组织或器官的百分摄取剂量表示(％ID/g)。标记药物的荷瘤小鼠体内分布结果示于表1。[99mTc(CO)3(NC-PEGrNIM)3]+具有非常好的肿瘤摄取与滞留，注射后5、30、60和120min的肿瘤摄取(ID。/。/g)分别达到6.02±4.17、2.05±0.39、2.52±0.15禾B2.18±0.41;在靶/非靶比值方面，["mTc(CO)3(NC-PEGrNIM)3]+的肿瘤/肌肉比较好，注射后5、30、60和120min分另lj为11.04土3.90、2.56±0.87、2.04±0.10禾口1.28±0.60。表l:["mTc(CO)3(NC-PEG3-NIM)3]+在荷瘤小鼠体内分布结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其结构通式如式1所示式1其中R如式2所示式2式2中n＝1～10。2、根据权利要求l所述的一种羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，其特征是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式2中rrf。3、根据权利要求l所述的一种羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的制备方法，其特征是a.将聚乙二醇和三乙胺溶于二氯甲烷中，再在其中缓慢滴加溶有对甲苯磺酰氯的二氯甲烷的溶液，充分反应后，抽滤除去固体，滤液经水洗后除去溶剂得粘稠液体状的化合物l，其中聚合度n为l10中的任一个；b.将化合物1和2-硝基咪唑，以及Na2C03加入到CH3CN中，回流反应充分后除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物2;c.将化合物2和NaN3加入到DMF中，加热反应，减压除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得化合物3;d.将PPh3(三苯基磷)、化合物3和水溶解于THF中，充分反应后除去溶剂，并用硅胶柱过柱纯化，得化合物4;其中R如式2所示式2中n=110。e.将化合物4溶于甲酸乙酯，回流充分反应，除去溶剂，并用硅胶柱过柱纯化，得化合物5;f.冰浴条件下，将含有SOCl2的无水THF溶液缓慢滴加到化合物5溶于THF的溶液中，经充分反应后，将溶液调节为弱碱性后除去溶剂，并用硅胶柱过柱纯化，得配体NC-PEGn-NIM;g.将配体NC-PEGn-NIM与新鲜制备的pH值已调节为910的[99mTC(CO)3(H20)3]，间体在沸水浴中反应，得到羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物[衡Tc(CO)3(NC國PEGn-NIM)3;T。以上制备方法中所用的聚乙二醇聚合度为110。4、根据权利要求2所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的制备方法，其特征是；a.将三缩四乙二醇30mmol和三乙胺90mmol溶于30mL二氯甲垸，缓慢滴加对甲苯磺酰氯66mmol溶于二氯甲烷30mL的溶液，完成后继续室温反应4小时，抽滤除去固体，滤液水洗后干燥处理再除去溶剂得粘稠状液体的化合物la;b.将化合物la(15.6mmol)、2-硝基咪唑(13mmol)和Na2C03(15.6mmol)加入到50mL乙腈中，回流反应，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体2a;c.将化合物2a(4.51mmol)、NaN3(5.41mmol)力卩入至lj2mLDMF中，加热到IO(TC充分反应，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得淡黄色粘稠状液体的化合物3a;d.将PPh3(5.35mmo1)，化合物3a(4.20mmol)和水0.8g溶解于10mLTHF中，在30-40。C充分反应，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物的化合物4a;e.将化合物4a(0.347mmol)溶于5mL甲酸乙酯，回流反应充分后，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物的化合物5a;f.在冰浴条件下，将含有14"LSOCl2的lmL无水THF溶液缓慢滴加到化合物5a(0.215mmol)溶于lmL无水THF的溶液中,在搅拌条件下继续室温反应充分后，用氨水将溶液调节为弱碱性，除去溶剂并用硅胶柱过柱纯化，得浅黄色油状物的配体NC-PEG3-NIM;g.将新鲜制备的["mTc(CO)3(H20)3]+中间体溶液调节pH=9~10，再在其中加入0.1mL浓度为lmg/mL的NC-PEGrNIM配体溶液，摇匀后在沸水浴中反应充分得羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物["，c(CO)"NC-PEG3-NIM)3]+。5、权利要求1或2所述的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物在制备肿瘤乏氧显像剂的应用。全文摘要本发明公开一类用放射性核素标记的化合物——羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物，以及这种化合物的制备方法和用途。本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物的制备方法是首先合成配体NC-PEG<sub>n</sub>-NIM，再将配体与新鲜制备的pH值已调节为9～10的[<sup>99m</sup>Tc(CO)<sub>3</sub>(H<sub>2</sub>O)<sub>3</sub>]<sup>+</sup>中间体在沸水浴中加热反应，得到羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物。本发明的羰基锝标记的2-硝基咪唑配合物通过硝基咪唑的靶向作用浓集于乏氧肿瘤细胞，可用于乏氧肿瘤的SPECT显像诊断。文档编号C07F13/00GK101654465SQ20091017323公开日2010年2月24日申请日期2009年9月11日优先权日2009年9月11日发明者吴王锁,汪建军,牛婷婷,谈存敏申请人:兰州大学