新型组合物和方法

专利名称：新型组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗或预防结核病、尤其用于治疗或预防潜伏性结核病和预防或延迟结核病再活化的多肽和多核苷酸(以及相关方法)。本发明还涉及包含所述多肽和多核苷酸的药物组合物和免疫原性组合物，以及用于诊断结核病(尤其潜伏性结核病)的方法。
背景技术：
结核病(TB)为由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和其它分枝杆菌感染引起的慢性传染病。其为发展中国家的主要疾病，以及世界发达地区日益增加的问题。据信超过20亿人感染了 TB杆菌，并且每年约920万新TB病例和170万人死亡。10% TB杆菌感染者将形成活动性TB，每年每个患活动性TB的人传染平均10-15个其它人。虽然全球每年发病率已达高峰，但由于人口增长，死亡和病例数仍然上升(世界卫生组织 Tuberculosis Facts 2008)。结核分枝杆菌通过呼吸途径感染个体。肺泡巨噬细胞吞噬该细菌，但其能通过抑制吞噬体与酸性溶酶体融合来存活和增殖。接着发生涉及CD4+和CD8+T细胞的复杂免疫应答，最终导致肉芽肿形成。结核分枝杆菌成功作为病原体的关键为以下事实该隔离但未根除的细菌可长期存留，使得个体易于以后形成活动性TB。在感染后的最初几年，少于5%的感染个体形成活动性TB。肉芽肿可存留数十年并认为其包括处于休眠期、缺乏氧气和营养物的活结核分枝杆菌。然而，最近有人提出处于休眠期细菌的大多数位于全身分布的非巨噬细胞细胞类型中(Locht等，Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11) 1665-1677)。活动性TB的形成发生在当宿主天然免疫力与病原体之间的平衡改变时，例如由于抑制免疫事件(Anderson P Trends in Microbiology 2007 15(1) :7-13 ；Ehlers S Infection 2009 37(2) :87-95)。也已提出描述潜伏性TB与活动性TB之间的平衡的动态假说(Cardana P-J Inflammation & Allergy-Drug Targets 2006 6 :27-39 ；Cardana P-J Infection 2009 37(2) :80-86)。尽管感染可在相当长期内无症状，但是活动性疾病最通常表现为肺的急性炎症， 导致疲劳、体重减轻、发热和持续咳嗽。如果不加以治疗，则通常导致严重并发症和死亡。通常可使用长期抗生素治疗来控制结核病，但这种治疗并不足以防止该疾病的蔓延。感染个体可为无症状的，但持续若干时间有传染性。此外，尽管治疗方案的顺应性为关键的，但是患者行为难以监测。某些患者并不完成疗程，这可导致无效治疗和产生耐药性。多重耐药TB(MDR-TB)为对一线药物无反应的一种形式。所有TB病例中的5%为 MDR-TB，估计每年出现490，000个新MDR-TB病例。广泛耐药性TB (XDR-TB)当在MDR-TB基础上形成的对二线药物的耐受性时出现。据估计每年出现40，000个几乎不能治疗的)(DR-TB 新病例(世界卫生组织Tuberculosis Facts 2008)。即使完成抗生素治疗的整个疗程，结核分枝杆菌的感染也可能不能从感染个体中根除，并可遗留为可再活化的潜伏性感染。
为了控制结核病的传播，该疾病的有效疫苗和准确早期诊断是最为重要的。通常使用结核菌素皮试实现对潜伏性TB感染的诊断，该测试涉及真皮内暴露至结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)。抗原特异性T细胞应答导致在注射后48-72小时于注射部位产生可测量的硬结，这表示对分枝杆菌抗原的暴露。然而，灵敏度和特异性为该测试的一个问题，并且已接种BCG的个体并不能总是容易地与感染个体区分(鉴于BCG并不保护潜伏性感染这个事实，这尤其重要)。通常，已接受BCG但未被结核分枝杆菌感染的个体显示小于IOmm直径的PPD反应，而具有大于IOmm直径PPD反应的人被认为已受到结核分枝杆菌感染。然而，该规则并不适用于由于HIV感染而免疫抑制的个体，HIV感染可导致小于IOmm 直径的PPD反应)；或其中由非结核分枝细菌感染的人可显示大于IOmm直径PPD反应的地方流行国家。最近几年的进展已见证体外T细胞基测定法的开发，所述测定法基于干扰素-Y 释放并使用比PPD更特异于结核分枝杆菌的抗原，即ESAT-6和CFP-10。这些高特异性测试似乎是至少与结核菌素皮试同样灵敏，并且还显示较低的BCG接种所致的交叉反应性。参 BPai M 等 Expert Rev. Mol. Diagn. 2006 6 (3) :413-422 关于潜伏性 TB 诊断的最新综述。 然而，由于ESAT-6/CFP-10为早期抗原，所以基于ESAT-6/CFP-10的测定法仅可在最近感染的人中表现最佳。因此，特异关联潜伏性结核病的新抗原的鉴定可有助于开发更灵敏的测定法，其可检测长期潜伏性感染。仍对治疗和预防结核病、尤其治疗和预防潜伏性TB以及预防TB的再活化的有效策略存在需要。发明简述本发明主要涉及Rv3616c作为潜伏性TB抗原的鉴定，在预防和治疗潜伏性TB以及预防或延迟TB再活化中的相关方法和用途。本发明提供用作治疗或预防潜伏性TB的药物的多肽，其包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。本发明另一个方面涉及用于治疗或预防潜伏性TB的方法，其包括给予安全且有效量的以下多肽至有需要的受试者，所述多肽包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段；其中所述多肽诱导免疫应答，尤其针对结核分枝杆菌的免疫应答。以下多肽在制备用于治疗或预防潜伏性TB的药物中的用途表示本发明的另一个方面，所述多肽包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。还提供用作治疗或预防潜伏性TB药物的多核苷酸，其包含编码以下多肽的核酸序列，所述多肽包含
(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。本发明另一个方面涉及用于治疗或预防潜伏性TB的方法，其包括给予安全且有效量的以下多核苷酸至有需要的受试者，所述多核苷酸包含编码以下多肽的核酸序列，所述多肽包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段；其中所述多核苷酸诱导免疫应答，尤其针对结核分枝杆菌的免疫应答。以下多核苷酸在制备用于治疗或预防潜伏性TB的药物中的用途表示本发明的另一个方面，所述多核苷酸包含编码以下多肽的核酸序列，所述多肽包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。此外，提供用作治疗或预防潜伏性TB的药物的药物组合物，其包含(a)以下多肽，其包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含编码(a)多肽的核酸序列的多核苷酸；以及(c)药学上可接受的载体或赋形剂。此外，提供用作治疗或预防潜伏性TB的药物的免疫原性组合物，其包含(a)以下多肽，其包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含编码(a)多肽的核酸序列的多核苷酸；以及(c)非特异性免疫应答增强剂。另外提供用于诊断潜伏性TB的特异结合至以下多肽的抗体或其片段，所述多肽包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。(例如用于诊断潜伏性结核病的方法，其包括测定来自测试受试者的生物学样品中的特异结合至本发明多肽的抗体或其片段的存在。)还提供用于治疗潜伏性TB的方法，其包括以下步骤
(i)鉴定具有潜伏性TB感染的受试者(例如通过PPD或T细胞基测定法)；以及(ii)给予所述受试者安全且有效量的如本文所述的多肽或多核苷酸(例如以药物组合物或免疫原性组合物形式)。还提供本发明多肽在制备用于鉴定测试受试者内的潜伏性TB的诊断试剂盒中的用途。在一个实施方案中，接受多肽、多核苷酸或组合物的受试者可具有活动性结核病 (例如结核分枝杆菌的活动性感染)。在第二个实施方案中，受试者可具有潜伏性结核病 (例如结核分枝杆菌的休眠性感染)。在第三个实施方案中，受试者可无结核病(例如没有结核分枝杆菌感染)。接受多肽、多核苷酸或组合物的受试者先前可已接受结核病接种(例如针对结核分枝杆菌感染接种)，例如已用卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)接种。或者，接受本发明多肽、多核苷酸或组合物的受试者先前可没有接受0结核病接种(例如未针对结核分枝杆菌感染接种)，例如未用卡介苗(BCG)接种。附图简述

图1 :Rv3616c肽全长序列比对。图 2 对 Rv3616c 肽的 PBMC 反应。图3 在第21天(即第二次免疫接种(immunisation) 天后)，来自表达IFN-Y 和/或IL-2和/或TNF- α细胞因子的免疫CB6F1小鼠的⑶4和⑶8细胞百分比。图4 在免疫CB6F1小鼠中抗原特异性CD4反应在第21天(即第二次免疫接种7 天后)的细胞因子概况。图5 在免疫CB6F1小鼠中抗原特异性CD8反应在第21天(即第二次免疫接种7 天后)的细胞因子概况。图6 在第35天(即第三次免疫接种7天后)，来自表达IFN- Y和/或IL-2和/ 或TNF-α细胞因子的免疫CB6F1小鼠的⑶4和⑶8细胞百分比。图7 在免疫CB6F1小鼠中抗原特异性CD4反应在第35天(即第三次免疫接种7 天后)的细胞因子概况。图8 在免疫CB6F1小鼠中抗原特异性CD8反应在第35天(即第三次免疫接种7 天后)的细胞因子概况。图9 在第21天(即第二次免疫接种7天后)，来自表达IFN-Y和/或IL_2和/ 或TNF-α细胞因子的免疫C57BL/6小鼠的⑶4和⑶8细胞百分比。图10 在免疫C57BL/6小鼠中抗原特异性⑶4反应在第21天(即第二次免疫接种7天后)的细胞因子概况。图11 在第35天(即第三次免疫接种7天后)，来自表达IFN-Y和/或IL_2和 /或TNF-α细胞因子的免疫C57BL/6小鼠的⑶4和⑶8细胞百分比。图12 在免疫C57BL/6小鼠中抗原特异性⑶4反应在35天(即第三次免疫接种7 天后)的细胞因子概况。图13 在免疫C57BL/6小鼠中抗原特异性⑶8反应在35天(即第三次免疫接种7 天后)的细胞因子概况。图14 无感染(naive)和潜伏性感染的人中的抗原特异性⑶4 T细胞应答。
所列序列简■述
SEQDNo1 来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c的多肽序列。
SEQDNo2 来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c的多核苷酸序列。
SEQDNo3 来自结核分枝杆菌⑶C1551菌株的Rv3616c的多肽序列。
SEQDNo4 来自结核分枝杆菌Fll菌株的Rv3616c的多肽序列。
SEQDNo5 来自结核分枝杆菌Haarlem A菌株的Rv3616c的多肽序列。
SEQDNo6 来自结核分枝杆菌C菌株的Rv3616c的多肽序列。
SEQDNo7 来自BCG的Rv3616c的多肽序列。
SEQDNo8 Mtb8. 4的多肽序列。
SEQDNo9 Mtb9. 8的多肽序列。
SEQDNo10:Mtb9. 9的多肽序列。
SEQDNo11:Ral2的多肽序列。
SEQDNO12:Ra35的多肽序列。
SEQDNo13:TbH9的多肽序列。
SEQDNo14:Mtb41的多肽序列。
SEQDNo15:ESAT-6的多肽序列。
SEQDNo16:Ag85A的多肽序列。
SEQDNo17:Ag85B的多肽序列。
SEQDNo18晶体蛋白的多肽序列。
SEQDNo19:ΜΡΤ64的多肽序列。
SEQDNo20:Mtb32A的多肽序列。
SEQDNo21:Ser/Ala突变的成熟Mtb32A的多肽序列。
SEQDNo22:TB10.4的多肽序列。
SEQDNo23:Mtb72f的多肽序列。
SEQDNo24:M72的多肽序列。
SEQDNo25:Mtb71f的多肽序列。
SEQDNo26:M92融合体的多肽序列。
SEQDNo27:M103融合体的多肽序列。
SEQDNo28:M114融合体的多肽序列。
SEQDNo29推定的人CD4细胞表位1。
SEQDNo30推定的人CD4细胞表位2。
SEQDNo31推定的人CD4细胞表位3。
SEQDNo32推定的人CD4细胞表位4。
SEQDNo33推定的人CD4细胞表位5。
SEQDNo34推定的人CD4细胞表位6。
SEQDNo35推定的人CD4细胞表位7。
SEQDNo36推定的人CD4细胞表位8。
SEQDNo37推定的人CD4细胞表位9。
SEQDNo38推定的人CD4细胞表位10。
SEQIDNo39推定的人CD4细胞表位11。
SEQIDNo40推定的人CD4细胞表位12。
SEQIDNo41推定的人CD4细胞表位13。
SEQIDNo42推定的人CD4细胞表位14。
SEQIDNo43推定的人CD4细胞表位15。
SEQIDNo44推定的人CD4细胞表位16。
SEQIDNo45推定的人CD4细胞表位17。
SEQIDNo46推定的人CD4细胞表位18。
SEQIDNo47推定的人CD4细胞表位19。
SEQIDNo48推定的人CD8细胞表位1。
SEQIDNo49推定的人CD8细胞表位2。
SEQIDNo50推定的人CD8细胞表位3。
SEQIDNo51推定的人CD8细胞表位4。
SEQIDNo52推定的人CD8细胞表位5。
SEQIDNo53推定的人CD8细胞表位6。
SEQIDNo54推定的人CD8细胞表位7。
SEQIDNo55推定的人CD8细胞表位8。
SEQIDNo56推定的人CD8细胞表位9。
SEQIDNo57推定的人CD8细胞表位10。
SEQIDNo58推定的人CD8细胞表位11。
SEQIDNo59推定的人CD8细胞表位12。
SEQIDNo60推定的人CD8细胞表位13。
SEQIDNo61推定的人CD8细胞表位14。
SEQIDNo62推定的人CD8细胞表位15。
SEQIDNo63推定的人CD8细胞表位16。
SEQIDNo64推定的人CD8细胞表位17。
SEQIDNo65推定的人CD8细胞表位18。
SEQIDNo66推定的人CD8细胞表位19。
SEQIDNo67推定的人CD8细胞表位20。
SEQIDNo68推定的人CD8细胞表位21。
SEQIDNo69推定的人CD8细胞表位22。
SEQIDNo70推定的人CD8细胞表位23。
SEQIDNo71推定的人CD8细胞表位M。
SEQIDNo72推定的人CD8细胞表位25。
SEQIDNo73推定的人CD8细胞表位沈。
SEQIDNo74推定的人CD8细胞表位27。
SEQIDNo75推定的人CD8细胞表位观。
SEQIDNo76推定的人CD8细胞表位四。
SEQIDNo77推定的人CD8细胞表位30。
SEQIDNo78推定的人CD8细胞表位31。
SEQIDNo79推定的人CD8细胞表位32。
SEQIDNo80推定的人CD8细胞表位33。
SEQIDNo81推定的人CD8细胞表位34。
SEQIDNo82推定的人CD8细胞表位35。
SEQIDNo83推定的人CD8细胞表位36。
SEQIDNo84推定的人CD8细胞表位37。
SEQIDNo85推定的人CD8细胞表位38。
SEQIDNo86推定的人CD8细胞表位39。
SEQIDNo87推定的人CD8细胞表位40。
SEQIDNo88推定的人CD8细胞表位41。
SEQIDNo89推定的人CD8细胞表位42。
SEQIDNo90推定的人CD8细胞表位43。
SEQIDNo91推定的人CD8细胞表位44。
SEQIDNo92推定的人CD8细胞表位45。
SEQIDNo93推定的人CD8细胞表位46。
SEQIDNo94推定的人CD8细胞表位47。
SEQIDNo95推定的人CD8细胞表位48。
SEQIDNo96推定的人CD8细胞表位49。
SEQIDNo97推定的人CD8细胞表位50。
SEQIDNo98推定的人CD8细胞表位51。
SEQIDNo99推定的人CD8细胞表位52。
SEQIDNo100推定的人CD8细胞表位53。
SEQIDNo101推定的人CD8细胞表位M。
SEQIDNo102推定的人CD8细胞表位55。
SEQIDNo103推定的人CD8细胞表位56。
SEQIDNo104 推定的人⑶8细胞表位57。
SEQIDNo105推定的人CD8细胞表位58。
SEQIDNo106推定的人CD8细胞表位59。
SEQIDNo107推定的人CD8细胞表位60。
SEQIDNo108推定的人CD8细胞表位61。
SEQIDNo109推定的人CD8细胞表位62。
SEQIDNo110推定的人CD8细胞表位63。
SEQIDNo111推定的人CD8细胞表位64。
SEQIDNo112推定的人CD8细胞表位65。
SEQIDNo113推定的人CD8细胞表位66。
SEQIDNo114 推定的人⑶8细胞表位67。
SEQIDNo115推定的人CD8细胞表位68。
SEQIDNo116推定的人CD8细胞表位69。
SEQIDNo117推定的人CD8细胞表位70。
SEQIDNo118推定的人CD8细胞表位71。
SEQIDNo119推定的人CD8细胞表位72。
SEQIDNo120推定的人CD8细胞表位73。
SEQIDNo121推定的人CD8细胞表位74。
SEQIDNo122推定的人CD8细胞表位75。
SEQIDNo123推定的人CD8细胞表位76。
SEQIDNo124推定的人CD8细胞表位77。
SEQIDNo125推定的人CD8细胞表位78。
SEQIDNo126推定的人CD8细胞表位79。
SEQIDNo127肽1。
SEQIDNo128肽2。
SEQIDNo129肽3。
SEQIDNo130肽4。
SEQIDNo131肽5。
SEQIDNo132肽6。
SEQIDNo133肽7。
SEQIDNo134肽8。
SEQIDNo135肽9。
SEQIDNo136肽10。
SEQIDNo137肽11。
SEQIDNo138肽12。
SEQIDNo139肽13。
SEQIDNo140肽14。
SEQIDNo141肽15。
SEQIDNo142肽16。
SEQIDNo143肽17。
SEQIDNo144肽18。
SEQIDNo145肽19。
SEQIDNo146肽20。
SEQIDNo147肽21。
SEQIDNo148肽22。
SEQIDNo149肽23。
SEQIDNo150肽24。
SEQIDNo151肽25。
SEQIDNo152肽26。
SEQIDNo153肽27。
SEQIDNo154肽28。
SEQIDNo155肽29。
SEQ ID No :156 月太 30。SEQ ID No :157 来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rvl753c的多肽序列。SEQ ID No 158 来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQ ID No 159 来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv2707c的多肽序列。发明详述目前，活细菌接种为用于诱导保护性免疫的最有效方法。用于此目的的最常用的分枝杆菌为卡介苗(BCG)，牛分枝杆菌(Ebovis)的无毒株，其于60多年之前开发出。然而，BCG的安全性和有效性为争议的来源——尽管在儿童中针对严重疾病表现提供保护，但是BCG并不在成人生命中预防潜伏性TB的建立或肺部疾病的再活化。此外，某些国家例如美国并不用该制剂接种公众。几乎所有的目前在临床开发中的新一代TB疫苗已设计为暴露前疫苗 (pre-exposure vaccine) 0它们包括亚单位疫苗，其尤其有效于加强由先前BCG接种诱导的免疫；以及改进的活分枝杆菌疫苗，其旨在用更有效和/或更安全的菌株代替BCG。尽管这些疫苗旨在促进对感染的抗性，但是它们作为暴露后或治疗性疫苗在潜伏性TB情况中很可能较不有效(Lin MY 等 Endocrine, Metabolic & Immune Disorders-Drug Targets 20088 :15-29)。在分枝杆菌感染早期期间强烈表达的数种蛋白在动物接种模型中已表现出提供强保护效能。然而，用感染初期强烈表达的抗原接种可能不能为处理感染晚期提供最优免疫应答。感染晚期的充分控制可能需要特异于在该时间表达的特定抗原的T细胞。直接靶向持久休眠细菌的暴露后疫苗(post-exposure vaccnine)可能有助于针对TB再活化提供保护，从而增强TB控制或甚至能够清除该感染。因此，靶向潜伏性TB的疫苗可显著且经济地降低全球TB感染率。基于晚期抗原的亚单位疫苗也可与早期抗原联合使用以提供多阶段疫苗。或者， 晚期抗原可用于补充和改进BCG接种(通过加强BCG反应或通过开发改进的重组BCG菌株)。Rv3616c，也称为Mtb40或HTCC1，先前已显示涉及与结核病有关的免疫应答(参见，例如 W098/53075)。Al-Attiyah 等 Clin. Exp. Immunol. 2004 138 :139-144 已表明 Rv3616c被肺结核患者良好识别(通过PMBC增殖和IFN- Y产生)。Mustafa等Infect. Immun. 2006 74(8) :4566-4572已研究牛分枝杆菌感染且BCG接种的牛对Rv3616c的识别。最近，已基于全基因组结核分枝杆菌基因组的生物信息学分析(Zvi等BMC Medical Genetics 2008 1 :18)和基于在活动性和潜伏性感染个体中差异表达蛋白的测试 (Schuck SD等PLoS ONE 2009 4(5) :e5590)提出一系列结核分枝杆菌候选疫苗。虽然已表明巨噬细胞充当分枝杆菌免疫的主要效应物，但是T细胞为所述免疫的主导诱导物。T细胞针对结核病提供保护的关键作用通过在人免疫缺陷病毒感染的个体中 CD4+T细胞的相关耗竭所致的TB再活化的速率增加来阐明。此外，已表明在对结核分枝杆菌的初次免疫应答最盛时获得的CD4+T细胞的过继转移赋予T细胞缺陷型小鼠针对结核分枝杆菌的保护(Orme 等 J. Exp. Med. 1983 158 :74-83)。已表明分枝杆菌反应性⑶4+T细胞为Y-干扰素(IFN-Y)的强有力的产生者， 还已表明IFN-Y引发小鼠中的巨噬细胞的抗-分枝杆菌作用(Flyrm等J. Exp. Med. 1993178:2249-2254)。尽管IFN-γ在人类中的作用较不明确，但是研究已表明1，25-二羟基-维生素D3单独或者与IFN-γ或肿瘤坏死因子-α联合，都活化人巨噬细胞抑制结核分枝杆菌感染。此外，已知IFN-γ刺激人巨噬细胞产生1，25-二羟基-维生素D3。同样，已表明白介素-12(IL-12)在刺激抗结核分枝杆菌感染中起作用。有关结核分枝杆菌感染免疫学的综述参见 Chan 禾口 Kaufmann, Tuberculosis !Pathogenesis, Protection and Control (Bloom 编著，1994) >Tuberculosis (第 2 版，Rom 禾口 Garay 编著，2003)禾口 Harrison 的 Principles of Internal Medicine,第 150 章，第 953-966 页(第 16 版，Braunwald 等编著，2005)。本发明主要涉及Rv3616c作为与潜伏性TB关联的TB抗原的鉴定，在预防和治疗潜伏性TB以及预防或延迟TB再活化中的相关方法和用途。因此，本发明提供用于治疗或预防潜伏性TB的Rv3616c蛋白、其变体或其免疫原性片段或者编码所述蛋白、变体或片段的多核苷酸。合适的是，所述用途可具体为治疗潜伏性TB。或者，所述用途可为预防或延迟TB再活化(尤其是延迟TB再活化，例如延迟数月、 数年或甚至无限期地延迟)。术语“结核分枝杆菌复合群菌种”包括传统认为引起疾病结核病的分枝杆菌以及在免疫缺陷患者例如AIDS患者中引起结核病和肺疾病的环境和机会性分枝杆菌，例如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或非洲分枝杆菌(M. africanum)、BCG、鸟分枝杆菌(M. avium)、 胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、隐藏分枝杆菌(M. celatum)、日内瓦分枝杆菌 (M. genavense)、嗜血分枝杆菌(M. haemophilum)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、猿分枝杆菌(M. simiae)、母牛分枝杆菌(M. vaccae)、偶发分枝杆菌(M. fortuitum)和瘰疬分枝杆菌(M. scrofulaceum)(参见例如 Harrison 的 Principles of Internal Medicine,第 150 章，第953-966页(第16版，Braunwald等编著，2005)。本发明尤其针对结核分枝杆菌感
^fe ο术语“活动性感染”是指表现出疾病症状和/或损伤(与所表现出的疾病症状相称的)的感染(例如结核分枝杆菌感染)。术语“非活动性感染” “休眠性感染”或“潜伏性感染”是指未表现出疾病症状和/ 或损伤(与未表现出疾病症状相称的)的感染(例如结核分枝杆菌感染)。术语“原发性结核病”是指直接在感染(例如结核分枝杆菌感染)后的临床疾病 (疾病症状的表现)。参见 Harrison 的 Principles of Internal Medicine，第 150 章，第 953-966 页(第 16 版，Braunwald 等编著，2005)。术语“继发性结核病”或“原发后结核病(postprimary tuberculosis) ”是指休眠性、非活动性或潜伏性感染(例如结核分枝杆菌感染)的再活化。参见Harrison的 Principles of Internal Medicine,第 150 章，第 953-966 页(第 16 版，Braunwald 等编著，2005)。术语“结核病再活化(tuberculosis reactivation) ”是指感染(例如在结核菌素皮试中，合适地在体外基于T细胞的测定中)测试呈阳性、但没有明显疾病症状的个体在以后表现出疾病症状。阳性诊断测试表明所述个体已被感染，然而，所述个体先前可表现出或未表现出活动性疾病症状，所述症状已被充分治疗以使结核病进入非活动性或潜伏性状态。应认识到的是，用于预防、延迟或治疗结核病再活化的方法可在表现疾病活动性症状的个体中开始。术语“耐药性”结核病是指以下感染(例如结核分枝杆菌感染)其中一种或多种有效治疗结核病的所谓“前线”化疗药(例如异烟胼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺)不能抑制或杀伤感染菌株(即对所述化疗药有抗性)。术语“多重耐药性”结核病是指以下感染(例如结核分枝杆菌感染)其中感染菌株对两种以上有效治疗结核病的“前线”化疗药具有抗性。“化疗药”是指本领域已知并用于治疗结核病(例如结核分枝杆菌感染)的药物。 用于治疗结核病的例示性药物包括但不限于阿米卡星、氨基水杨酸、卷曲霉素、环丝氨酸、 乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟胼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素(即利福平、利福喷汀和利福布汀)、链霉素、氧氟沙星、环丙沙星、克拉霉素、阿奇霉素和氟喹诺酮类。用于治疗非耐药性结核病的“一线”或“前线”化疗药包括异烟胼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺。 用于治疗已显示对一种或多种“一线”药物具有耐药性的结核病的“二线”化疗药包括氧氟沙星、环丙沙星、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。这类药物综述于 Goodman 禾口 Gilman 的 The Pharmacological Basis of Theraputics,第 48 章， Hardman 禾口 Limbird 编著，2001。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合体。该术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合体，以及适用于天然存在氨基酸聚合体和非天然存在氨基酸聚合体。合适的本发明多肽仅由天然存在氨基酸残基、尤其是由遗传密码编码的氨基酸组成。术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在氨基酸为由遗传密码编码的氨基酸， 以及随后被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团连接的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜(methionine sulfoxide)、甲硫氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这类类似物具有修饰R基团(例如正亮氨酸)或修饰肽主链，但保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸一般化学结构不同的结构、但以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的化合物。合适的氨基酸为天然存在氨基酸或氨基酸类似物，尤其是天然存在氨基酸和特别是由遗传密码编码的氨基酸。“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合体。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰主链残基或键的核酸，其为合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参比核酸相似的结合特性，而且其以与参比核苷酸相似的方式代谢。这类类似物的实例包括而不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、 2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。合适的是，术语“核酸”是指天然存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合体。除非另有说明，否则特定核酸序列也隐含包括其保守修饰变体(例如简并密码子取代物)和互补序列，以及所明确指出的序列(合适的是，其是指明确指出的序列)。具体而言，可通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第3位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列，得到简并密码子取代物(Batzer等，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991)；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8 91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。氨基酸在本文中可用它们公知的三字母符号表示，或者可用IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的一字母符号来表示。同样， 核苷酸也可用它们公知的单字母码来表示。本文所用术语“Rv3616c蛋白序列”意指SEQ ID No 1提供的多肽序列或其来自以下分枝杆菌的同源物，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌复合群菌种例如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或非洲分枝杆菌，或者为环境或机会性的并在免疫缺损宿主(例如AIDS患者)中引起机会性感染例如肺部感染的分枝杆菌例如BCG、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、猿分枝杆菌、母牛分枝杆菌、偶发分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌(参见，例如Harrison的Principles of Internal Medicine，第 150 章，第 953-966 页(第 16 版，Braunwald 等编著，2005)。为在接种宿主之间确保高有效率(efficacy rate)，疫苗的组分应在临床上重要的菌株间充分保守。合适的是，Rv3616c蛋白来源于结核分枝杆菌H37Rv(即SEQ ID No 1 提供的多肽序列)或其来自另一种结核分枝杆菌菌株(例如⑶C1551、Fll、Haarlem A和C 菌株)的同源物。具有耐药性(例如MDR或尤其)(DR)的结核分枝杆菌菌株为Rv3616c蛋白序列的特别有价值的基础。引人关注的菌株包括⑶C1551-可传播且有毒力的菌株Haarlem家族(例如Haarlem A)-在密集人群中发现的耐药性菌株。结核分枝杆菌菌株的Haarlem家族成员已在世界许多地方发现。该家族的第一个代表在荷兰Haarlem 发现。KZN4207-来自南非KwaZulu-Natal患者的药物敏感性分离群KZN1435-来自南非Kwa^ilu-Natal患者的多重耐药性(MDR)分离群KZN605-来自南非KwaZulu-Natal患者的广泛耐药性O(DR)分离群C-在纽约市高度传播。在一个研究中发现该菌株在注射药物使用者中更为常见且对活性氮中间体具有抗性(Friedman 等 J. hfect. Dis. 1997 176(2) :478-84)94_M4241A_在1994年于旧金山分离自出生于中国的患者。先前通过基因组缺失分析来分析该菌株(Gagneux 等，PNAS 2006 103(8) J869-2873)。02_1987_在2002年于旧金山分离自出生于韩国的患者。先前通过基因组缺失分析来分析该菌株(Gagneux 等，PNAS 2006 103(8) :2869-2873).T92-在1999年于旧金山分离自出生于菲律宾的患者。该菌株公布于Hirsh等 PNAS 2004 101 :4871-4876)。T85-在1998年于旧金山分离自出生于中国的患者。该菌株公布于Hirsh等PNAS 2004 101 :4871-4876)。EASOM-在1993年于旧金山分离自出生于印度的患者。先前通过基因组缺失分析来分析该菌株(Gagneux 等.，PNAS 2006 103(8) :2869-2873)。Gagneux 等，PNAS 2006 103(8) :2869-2873 和 Herbert 等 Infect. Immun. 2007 75(12) =5798-5805对已知存在的结核分枝杆菌菌株的范围提供了有价值的背景。最合适的是，Rv3616c蛋白选自SEQ ID No :1和3-7、尤其是SEQ ID No :1和3-6(例如SEQ ID No 1)提供的多肽序列。特别引人关注的多核苷酸为包含以下序列(例如由其组成)的多核苷酸，所述序列编码(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。多核苷酸适宜包含编码Rv3616c蛋白的免疫原性片段的SEQ ID NO 2变体或SEQ ID N0:2片段(例如由其组成)。组合用于本发明中的Rv3616c相关多肽还可包含设计以增强其免疫原性或在其它方面改进这些抗原的其它组分。例如，可通过向抗原的一端添加一段组氨酸残基(公知为 his-标记)以有利于多肽抗原的分离改进。术语“his-标记”是指一串插入参比序列内的组氨酸残基，通常6个残基。为使参比序列活性的破坏最小化，his-标记通常在N端插入，通常紧接起始甲硫氨酸残基之后， 或者在C端插入。它们通常与天然序列异源，但由于它们通过提高蛋白与固定化金属亲和层析树脂(IMAC)的结合来促进分离而将其插入。一般而言，从引起针对参比蛋白的所需免疫应答的角度来看，his-标记存在与否是不重要的。然而，为避免针对his-标记本身的不利反应的风险，据认为最好减少his-标记的长度例如至4个以下的残基，尤其是2个残基 (或者完全不使用his-标记)。为提高所引发的免疫应答的强度和/或幅度，组合物、多肽和核酸可包含多拷贝的本发明抗原和/或来自分枝杆菌(尤其是结核分枝杆菌)的其它异源多肽(或其编码多核苷酸)。本领域技术人员认识到的是，当联合使用多种组分时，确切存在形式可变化。例如，Rv3616c组分和其它拷贝的抗原或其它异源抗原组分可存在为(1)两种独立的多肽组分；(2)包含两种多肽组分的融合蛋白；(3) 一种多肽组分和一种多核苷酸组分；(4)两种独立的多核苷酸组分；(5)编码两种独立多肽组分的单个多核苷酸；或者(6)编码包含两种多肽组分的融合蛋白的单个多核苷酸。该灵活性同样适用于联合使用三种或更多种组分的情形。然而，为了方便，理想的是，通常当存在许多组分时将它们包含在单个融合蛋白或编码单个融合蛋白的多核苷酸内。在本发明的一个实施方案中，所有抗原组分作为多肽提供(例如在单个融合蛋白内)。 在本发明的备选实施方案中，所有抗原组分作为多核苷酸提供(例如单个多核苷酸，例如编码单个融合蛋白的单个多核苷酸)。术语“异源的”当用于提及核酸的部分时，是指所述核酸包含彼此在自然界不存在相同关系的两个或更多个亚序列。例如，核酸通常是重组产生的、具有两个或更多个来自排列以得到新功能核酸的无关基因的序列，例如一个来源的启动子与另一来源的编码区。同样，异源蛋白是指所述蛋白包含彼此在自然界不存在相同关系的两个或更多个亚序列(例如融合蛋白)。“融合多肽”或“融合蛋白”是指具有至少两个直接或通过氨基酸接头共价连接的异源多肽(例如至少两个分枝杆菌多肽)的蛋白。形成融合蛋白的多肽通常是C端与N端连接，但它们也可以是C端与C端、N端与N端、或N端与C端连接。融合蛋白的多肽可呈任何顺序。该术语也指构成融合蛋白的抗原的保守修饰变体、多态变体、等位基因、突变体、免疫原性片段和种间同源物。结核分枝杆菌抗原描述于Cole等，Nature 393:537(1998)中， 该文献公开了完整的结核分枝杆菌基因组。可例如使用本文所述的序列比较算法或本领域技术人员已知的其它方法(例如杂交测定法和抗体结合测定法)，来鉴定来自其它分枝杆菌的、对应于结核分枝杆菌抗原的抗原。术语“融合的，，是指融合蛋白内的两个多肽间的共价连接。所述多肽通常通过肽键直接相互连接或通过氨基酸接头连接。任选的是，所述肽可通过本领域技术人员已知的非肽共价键连接。可与Rv3616c组合的例示性结核分枝杆菌抗原包括以下抗原中的一种或多种(例如1-5种，例如1-3种，尤其是1种)(例如⑴至(xi)中的一种或多种)(i)Mtb8.4(也称为 DPV 和 Rvll74c)，其多肽序列描述于 TO97/09428 的 SEQ ID No :102(cDNA 描述于 SEQ ID No :101 中)禾Π Coler 等 Journal of Immunology 1998 161 :2356-2364中。尤其引人关注的是成熟Mtb8. 4序列，其不存在前导信号肽(即来自 W097/09428 SEQ ID No :102的氨基酸残基15-96)。Mtb8. 4的全长多肽序列示于SEQ ID No 8 ；(ii)Mtb9. 8(也称为 MSL 和 Rv0287)，其多肽序列描述于 W098/53075 的 SEQ ID No:109(MSL片段公开于TO98/53075 的SEQ ID No 110-124，SEQ ID No :119 和 120 尤其引人关注)以及Coler等Vaccine 2009 27 :223-233 (具体地，活性片段示于其中的图2中) 中。Mtb9. 8的全长多肽序列示于SEQ ID No 9 ；(iii)Mtb9. 9(也称为 Mtb9. 9A、MTI、MTI-A 和 Rvl793)，其多肽序列描述于 W098/53075 的 SEQ ID No 19 和 Alderson 等 Journal of Experimental Medicine 2000
7:551-559(MTI 片段公开于 W098/53075 的 SEQ ID No 17 和 51-66，SEQ ID No :17、51、52、 53、56和62-65尤其引人关注)中。许多MTI多肽变体描述于W098/53075 SEQ ID No :21、 23、25、27、29和 31 以及Alderson等 Journal of Experimental Medicine 2000 7:551-559 中。Mtb9. 9的全长多肽序列示于SEQ ID No :10 ；(iv)Ral2(也称为Mtb32A C端抗原)，其多肽序列描述于W001/98460的SEQ ID No 10 和 Skeiky 等 Journal of Immunology 2004 172 :7618-7682 中。Ral2 的全长多肽序列示于 SEQ ID No 11 ；(v)Ra35(也称为Mtb32A N端抗原)，其多肽序列描述于W001/98460的SEQ ID No
8和 Skeiky 等 Journal of Immunology 2004 172 :7618-7682 中。Ra!35 的全长多肽序列示于 SEQ ID No 12 ；(vi)TbH9(也称为 Mtb39、Mtb39A、TbH9FL 禾Π Rvl 196)，其多肽序列描述于 W097/09428 的 SEQ ID No 107 以及 Dillon 等 hfection and Immunity 1999 67(6) 2941-2950 和 Skeiky 等 Journal of Immunology 2004 172 :7618-7682 中。TbH9 的全长多肽序列示于SEQ ID No 13 ；
(vii)Mtb41(也称为 MTCC2 和 Rv0915c)，其多肽序列描述于 W098/53075 的 SEQ ID No :142 (cDNA 描述于 SEQ ID No 140 中)和 Skeiky 等 Journal of Immunology 2000 165 7140-7149。Mtb41的全长多肽序列示于SEQ ID No 14 ；(viii)ESAT-6 (也称为 esxA 和 Rv3875)，其多肽序列描述于 1097/094 的 SEQ ID No :103 (cDNA 描述于 SEQ ID No 104 中)和 Sorensen 等 hfection and Immunity 1995 63(5) :1710-1717 中。ESAT-6 的全长多肽序列示于 SEQ ID No 15 ；(ix)Ag85 复合抗原(例如 Ag85A，也称为 fbpA 和 Rv3804c ；或 Ag85B，也称为 fbpB 和 Rvl886c)，其论述于例如 Content 等 hfection and Immunity 1991 59 :3205-3212 和 Huygen 等 Nature Medicine 1996 2(8) :893-898 中。Ag85A 的全长多肽序列示于 SEQ ID No :16(残基43-338(即缺少信号肽)的成熟蛋白尤其引人关注)。Ag85B的全长多肽序列示于SEQ ID No :17(残基41-325(即缺少信号肽)的成熟蛋白尤其引人关注)；(χ) α -晶体蛋白(也称为hspX和Rv2031c)，其描述于Verbon等Journal of Bacteriology 1992 174 1352-1359 禾口 Friscia 等 Clinical and Experimental Immunology 1995 102 :53-57 (特别引人关注的为对应于残基71-91、21-40、91_110和 111-130的片段)中。α -晶体蛋白的全长多肽序列示于SEQ ID No 18 ；(xi)Mpt64(也称为 Rvl980c)，其描述于 Roche 等 kandinavian Journal of Immunology 1996 43 :662-670 中。MPT64 的全长多肽序列示于 SEQ ID No :19(残基对-2观(即缺少信号肽)的成熟蛋白尤其引人关注)(xii)Mtb32A，其多肽序列描述于 W001/98460 的 SEQ ID No :2(全长)和 SEQ ID No:4(成熟)的残基8-330中，尤其是具有至少一个催化三联体突变(例如催化丝氨酸残基，其可例如突变为丙氨酸)的变体。Mtb32A的全长多肽序列示于SEQ ID No :20。具有 Ser/Ala突变的Mtb32A的成熟形式示于SEQ ID No 21 ；(xiii)TBlO. 4，TB10. 4 的全长多肽序列示于 SEQ ID No 22 ；(xiv) Rvl753c，来自结核分枝杆菌H37Rv的Rvl753c的全长多肽序列示于SEQ ID No 157 ；(xv)Rv2386c，来自结核分枝杆菌H37Rv的Rv2386c的全长多肽序列示于SEQ ID No 158 ；禾口 / 或(xvi) Rv2707c，来自结核分枝杆菌H37Rv的Rv2707c的全长多肽序列示于SEQ ID No :159。或它们的组合，例如(例如(a)-(g)的组合)(a)Ral2、TbH9和Ra35组分的例如以融合蛋白(例如Mtb72f)形式的组合。Mtb72f 的多肽序列描述于W02006/117240 的 SEQ ID No :6 (cDNA描述于 SEQ ID No :5 中)和 Skeiky 等Journal of Immunology 2004 172 :7618-7682 (其中其掺入了任选的His-标记以有助于纯化，当用于本发明时，合适的是Mtb72f不存在所述任选的组氨酸残基)中。Mtb72f的多肽序列示于SEQ ID No 23 ；(b)Ral2、TbH9*kr/Ala突变Ra35(即其中催化丝氨酸残基已被丙氨酸置换)组分的例如以融合蛋白(例如M72)形式的组合。M72的多肽序列描述于W02006/117M0的 SEQ ID No :4(cDNA描述于SEQ ID No :3中)，其中其掺入了任选的双组氨酸以有助于制备， 当用于本发明时，M72也可掺入双组氨酸，但合适的是M72不存在所述任选的双组氨酸(即W02006/117240 SEQ ID No 4的残基4-725尤其引人关注)。M72的多肽序列示于SEQ ID No 24 ；(c)Mtb8. 4、Mtb9. 8、Mtb9. 9和Mtb41组分的例如以融合蛋白(例如Mtb71f)形式的组合。Mtb71f的多肽序列描述于TO99/051748的SEQ ID No 16 (cDNA描述于SEQ ID No: 15中)，其中其掺入了任选的His-标记以有助于纯化，当用于本发明时，合适的是Mtb71f 对应于W099/051748 SEQ ID NO 16的氨基酸残基9-710。Mtb71f的多肽序列示于SEQ ID No 25 ；(d)Mtb72f或M72(合适的是，没有任选的组氨酸残基以有助于表达)与Mtb9.8和 Mtb9. 9的例如以融合蛋白的组合。M72-Mtb9. 9_Mtb9. 8融合体的多肽序列示于SEQ ID No 26 (M92融合体)，当用于本发明时，M72-Mtb9. 9_Mtb9. 8融合体可任选在起始甲硫氨酸残基后面掺入双组氨酸以有助于制备；(e)Mtb72f或M72(合适的是，没有任选的组氨酸残基以有助于表达)与Ag85B 的例如以融合蛋白(例如Mtbl03f)的组合。Mtbl03f的多肽序列描述于W003/070187的 SEQ ID No :18(cDNA描述于SEQ ID No :10中)，其中其掺入了任选的His-标记以有助于纯化，当用于本发明时，合适的是Mtbl03f对应于W003/070187 SEQ ID No 18的氨基酸残基 8-1016。同样尤其引人关注的是M103，即在Ra35组分中掺入Ser/Ala突变的Mtbl03f，当用于本发明时，合适的是M103对应于W003/070187 SEQ ID No 18的氨基酸残基8-1016， 其中在第710位的Ser残基已用Ala置换。M103的多肽序列示于SEQ ID No:27，当用于本发明时，M72-Mtb9. 9-Mtb9. 8融合体可任选在起始甲硫氨酸残基后掺入双组氨酸以有助于制备；(f)Mtb72f或M72(合适的是，没有任选的组氨酸残基以有助于表达)与Mtb41的例如以融合蛋白(例如Mtbll4f)的组合。MtblHf的多肽序列描述于W003/070187的SEQ ID No :16(cDNA描述于SEQ ID No :9)，其中其掺入了任选的His-标记以有助于纯化，当用于本发明时，合适的是Mtbll4f对应于W003/070187 SEQ ID No :16的氨基酸残基8_1巧4。 同样尤其引人关注的是M114，即在Ra35组分中掺入Ser/Ala突变的Mtbll4f，当用于本发明时，合适的是M114对应于来自W003/070187的SEQ ID No :16的氨基酸残基8_1巧4，其中在第710位的Ser残基已用Ala置换。M114的多肽序列示于SEQ ID No:28，当用于本发明时，M72-Mtb9. 9-Mtb9. 8融合体可任选在起始甲硫氨酸残基后掺入双组氨酸以有助于制备；(g)Ag85B 与 ESAT-6 组分的组合，例如以在 Doherty 等 Journal of Infectious Diseases 2004 190 :2146-2153所述融合体的组合；和/或Qi) Ag85B 与 TB10. 4 组分的组合，例如以在 Dietrich 等 Journal of Immunology 2005 174(10) :6332-6339 190 :2146-2153 所述融合体的组合。Rv3616c组分与Rvl753c组分的组合尤其引人关注。显而易见的是，这种组合可任选包含其它另外的抗原组分(例如M72组分)。另一种引人关注的组合包含Rv3616c组分和M72组分。另一种引人关注的组合包含Rv3616c组分和Rv2386c组分。其它引人关注的组合包括包含Rv3616c组分与Rv2707c组分的组合。另外的引人关注的组合包含Rv3616c组分和α -晶体蛋白组分。
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本领域技术人员应认识到的是，组合无需依赖于上述(i)-(xvi)和(a)-(h)中描述的特定序列，以及所述序列的保守修饰变体(例如具有至少70%同一性，例如至少80% 同一性、尤其是至少90%同一性和特别是至少95%同一性)或免疫原性片段(例如全长抗原的至少20%，例如该抗原的至少50%、尤其是至少70%和特别是至少80% )可用于获得相同的实施效果。上述独立抗原序列中的每一个还公开于Cole等Nature 1998 393 :537-544和 Camus Microbiology 2002 148 J967-2973中。结核分枝杆菌H37Rv的基因组为公众可获得的，例如在 Welcome Trust Sanger Institute 网页(www.sanger.ac.uk/Projects/M_ tuberculosis/)禾口其它地方。许多上述抗原还公开于美国专利申请号08/523，435,08/523, 436,08/658, 800、 08/659，683,08/818, 111,08/818, 112,08/942,341,08/942,578,08/858, 998,08/859,381、 09/056，556,09/072,596,09/072, 967,09/073,009,09/073,010,09/223,040,09/287,849 和 PCT 专利申请 PCT/US98/10407、PCT/US98/10514、PCT/US99/03265、PCT/US99/03268、 PCT/US99/07717.W097/09428 和 W097/09429、W098/16645、W098/16646，上述任一参考文献都通过引用结合于本文中。本发明组合物、多肽和核酸还可包含来自其它来源的其它多肽。例如，本发明组合物和融合蛋白可包含多肽或编码多肽的核酸，其中所述多肽增强抗原的表达，例如NS1、流感病毒蛋白的表达(参见，例如W099/40188和W093/04175)。本发明核酸可根据所选物种例如人类(在体内表达的情况下)或特定细菌(在多肽制备的情况下)偏好的密码子来进行改造。Rv3616c组分还可与一种或多种有效抗结核病(例如结核分枝杆菌感染)的化疗药一起给予。这类化疗药的实例包括但不限于阿米卡星、氨基水杨酸、卷曲霉素、环丝氨酸、 乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟胼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素(即利福平、利福喷汀和利福布汀)、链霉素、氧氟沙星、环丙沙星、克拉霉素、阿奇霉素和氟喹诺酮类。这类化学疗法由治疗医师判断使用优选药物组合来确定。用于治疗非耐药性结核病(例如结核分枝杆菌感染)的“一线”化疗药包括异烟胼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺。用于治疗已显示对一种或多种“一线”药物具有耐药性的结核病(例如结核分枝杆菌感染)的“二线”化疗药包括氧氟沙星、环丙沙星、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。常规化疗药通常在相对长时期(大约9个月)内给予。常规化疗药与本发明 Rv3616c组分的给药的组合能够缩短化疗治疗期(例如至8个月、7个月、6个月、5个月、4 个月、3个月或更短)而不会降低有效性。尤其引人关注的是将Rv3616c组分与卡介苗(BCG)联用，例如以重组表达 Rv3616c (或如本文所述的其变体或片段)的修饰BCG形式。或者，Rv3616c组分可通过同时给药或通过加强先前的BCG接种，用于增强受试者对BCG接种的反应。当用于增强受试者对BCG接种的反应时，Rv3616c组分显然可以多肽或多核苷酸的形式提供(任选与如上文所述的其它抗原组分一起)。本领域技术人员应认识到的是，组分的组合无需一起给予，并可如下施用单独或联合；同时、序贯或在短期内；通过相同途径或通过不同途径。然而，为了方便，通常理想(当给药方案可配伍时)的是，作为单个组合物给予组分的组合。通常将本发明多肽、多核苷酸和组合物给予人，但也有效于包括家养哺乳动物 (例如狗、猫、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、栗鼠)和农业哺乳动物(例如牛、猪、绵羊、山羊、 马)在内的其它哺乳动物。免疫原性片段T细胞表位为短的连续氨基酸段，其被T细胞(例如⑶4+或⑶8+T细胞)识别。T细胞表位的鉴定可通过表位作图实验实现，表位作图实验为本领域技术人员所熟知(参见，例如 Paul，Fundamental Immunology，第三版，243-247 (1993) ；Bei β barth 等 Bioinformatics 2005 21 (增刊 1) :i29_i37)。或者，可使用实施例中论述的方法预测表位。由于T细胞应答在结核病中的决定性参与，所以显而易见的是，全长Rv3616c多肽的包含至少一个T细胞表位的片段具有免疫原性，并且可有助于免疫保护。这类片段在本文中称为免疫原性片段。本发明免疫原性片段通常包含来自全长多肽序列的至少9个连续氨基酸(例如至少10个)，例如至少12个连续氨基酸(例如至少15个或至少20个连续氨基酸)，尤其是至少50个连续氨基酸，例如至少100个连续氨基酸(例如至少200个连续氨基酸)。合适的是，免疫原性片段为全长多肽序列长度的至少20 %，例如至少50 %、至少70 %或至少80 %。应理解的是，在多样远系群体例如人类中，不同的HLA型意指特定表位可能不被该群体的所有成员识别。因此，为使对多肽的识别水平和免疫应答规模最大化，通常需要免疫原性片段包含来自全长序列的多个表位(适宜全部表位)。Rv3616c蛋白的可用的具体片断包括含至少一个⑶4+表位、适宜至少两个⑶4+表位和尤其所有CD4+表位的片段(例如在实施例和SEQ ID No :29-47中描述的表位，尤其是与多个HLA等位基因关联的表位，例如与2、3、4、5或更多个等位基因关联的表位)。Rv3616c蛋白的可用的其它片断包括含至少一个⑶8表位、适宜至少两个⑶8表位和尤其所有CD8表位的片段(例如在实施例和SEQID No :48-126中描述的表位，尤其是与多个HLA等位基因关联的表位，例如与2、3、4、5或更多个等位基因关联的表位)。当使用全长多肽的单个片段时，当其引起以下反应时认为这类片段是免疫原性的在用特定抗原体外再刺激(restimulation)PBMC或全血的测定(例如再刺激数小时至高达两周的时期，例如高达1天、1天至1周或1-2周)中，所述反应为参比序列活性的至少20%、适宜至少50%和尤其至少75% (例如至少90% )，所述测定通过淋巴组织增生、在培养上清液中细胞因子的产生(由ELISA、CBA等测量)测量细胞的活化，或者通过胞内和胞外染色(例如使用特异于免疫标志物(例如CD3、CD4、CD8、IL2、TNFa、IFNg、CD40L、CD69 等)的抗体)接着用流式细胞仪分析，来表征T和B细胞应答。合适的是，当其引起以下反应时认为片段是免疫原性的在T细胞增殖和/或IFN-Y产生测定中，所述反应为参比序列活性的至少20%、适宜至少50%和尤其至少75% (例如至少90% )。在某些情况下，可使用全长多肽的多个片段(其可重叠或不重叠并且可覆盖或不覆盖整个全长序列)以得到与全长序列本身等效的生物反应。例如，组合中的如上所述的至少2个免疫原性片段(例如3、4或5个)，在PBMC或全血的体外再刺激测定(例如T细胞增殖和/或IFN-γ产生测定)中提供参比序列活性的至少50%、适宜至少75%和尤其至少90%。SEQ ID No =127-156的肽为特别引人关注的片段(尤其是SEQ ID No :127-133和 143-156 的肽)。变体“变体”或“保守修饰变体”适用于氨基酸序列和核酸序列两者。对于特定核酸序列而言，保守修饰变体是指编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或者在核酸并不编码氨基酸序列时，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何既定蛋白。例如，密码子 GCA、GCC、GCG和G⑶都编码氨基酸丙氨酸。因此，在被密码子指定为丙氨酸的每个位置，可将该密码子改为任何所述相应密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异导致产生 “沉默”或“简并”变体，其为保守修饰变异中的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也都描述了所述核酸的每种可能的沉默变异。技术人员应认识到核酸中的各密码子(除了 AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密码子)之外)都可被改变，以得到功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸中的每个沉默变异都隐含在每个所述序列中。与参比序列相比，本发明多核苷酸可包含许多沉默变异(可改变例如1-50个，例如1-25个、尤其1-5个和特别1个密码子)。与参比序列相比，本发明多核苷酸可包含许多非沉默保守变异(可改变例如1-50个，例如1-25个、尤其1-5个和特别1个密码子)。非沉默变异为导致所编码氨基酸序列改变的变异(通过氨基酸残基的取代、缺失或添加)。本领域技术人员应认识到特定多核苷酸序列可包含沉默和非沉默保守变异两者。对于蛋白序列的变体而言，技术人员应认识到的是，当一个或多个改变导致功能类似的氨基酸对氨基酸的取代或者不会实质影响变体生物功能的残基取代/缺失/添加时，对多肽进行的改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸的单个取代、缺失或添加为“保守修饰变体”。提供功能类似的氨基酸的保守取代表为本领域所熟知。这类保守修饰变体作为多态变体、种间同源物和等位基因的补充(并且不排除这些变体)。与参比序列相比，本发明多肽可包含许多保守取代(可改变例如1-50个，例如 1-25个、尤其1-10个和特别1个氨基酸残基)。一般而言，这类保守取代将落入以下指定的氨基酸分组的一个中，但在某些情况下，在不会实质影响抗原的免疫原性的条件下，其它取代是可能的。以下8个组别每一个都含通常相互之间为保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)；(参见例如 Creighton, Proteins (1984))。
合适的是，这类取代不发生在表位区，因而不会对抗原的免疫原性产生显著影响。与参比序列相比，蛋白变体还可包括其中插入另外的氨基酸的变体，例如这类插入可在1-10个位置(例如1-5个位置，适宜1或2个位置，尤其是1个位置)出现，并且可例如涉及在各个位置插入50个或更少的氨基酸(例如20个或更少，尤其是10个或更少， 特别是5个或更少)。合适的是，这类插入不发生在表位区，因而不会对抗原的免疫原性产生显著影响。插入的一个实例包括一小段组氨酸残基(例如2-6个残基)以有助于目标抗原的表达和/或纯化。与参比序列相比，蛋白变体还可包括其中已缺失氨基酸的变体，例如这类缺失可在1-10个位置(例如1-5个位置，适宜1或2个位置，尤其是1个位置)出现，并且可例如涉及在各个位置缺失50个或更少的氨基酸(例如20个或更少，尤其是10个或更少，特别是5个或更少)。合适的是，这类缺失不发生在表位区，因而不会对抗原的免疫原性产生显
著影响。技术人员应认识到特定蛋白变体可包含取代、缺失和添加(或其任何组合)。确定抗原表位区的方法描述且例示于实施例中。变体优选显示与相关参比序列的至少约70%同一性、更优选至少约80%同一性和最优选至少约90%同一性(例如至少约95%、至少约98%或至少约99% )。关于两个或更多个核酸或多肽序列的术语“同一的”或百分比“同一性”是指如利用以下序列比较算法中的一种或者通过人工比对和目测检查所测定，当在比较窗或指定区域内进行比较和比对最大一致性时，相同或者具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸 (即在指定区域内有70%同一性、任选75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性) 的两个或更多个序列或亚序列。那么这类序列就称为“基本同一的”。该定义也涉及测试序列的互补序列(compliment)。任选的是，同一性存在于长度至少约25个至约50个氨基酸或核苷酸的区域内，或任选在长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域内。合适的是，在对应于参比序列的完整长度的窗口内进行比较。对于序列比较，通常将一个序列用作参比序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列都输入计算机中，必要时指定亚序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或者可以指定备选参数。然后根据程序参数，序列比较算法计算出测试序列相对于参比序列的百分比序列同一性。本文所用的“比较窗”是指以下区段其中在将一个序列与具有相同数目连续位置的参比序列进行最佳排列之后，可将该序列与参比序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。可以按照诸如以下的方法等进行用于比较的序列最佳比对局部同源性算法，Smith和Waterman，Adv. App 1. Math. 2 :482(1981)；同源性比对算法，Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)；相似性搜索方法，Pearson 和 Lipman, Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85 :2444(1988)；这些算法的计算机工具(Wisconsin Genetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI)；或者人工比对和目测检查(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等编著，1995 增刊))。有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP运用渐近配对比对，从一组相关序列中创建多重序列比对，以显示相互关系和百分比序列同一性。其也绘出显示聚类关系的树状图或分枝图(dendogram)，所述聚类关系用于创建所述比对。PILEUP采用!^ng和Doolittle， J. Mol. Evo 1. 35 :351-360(1987)的渐近比对法的简化法。所使用的方法类似于Higgins和 Sharp, CABIOS 5:151-153(1989)描述的方法。所述程序可比对多达300个序列，每个序列最大长度为5，000个核苷酸或氨基酸。所述多重比对法始于两个最为相似序列的配对比对，产生一组两个经比对的序列。然后该组序列与下一个最相关的序列或下一组经比对的序列进行比对。通过两个单独序列的配对比对的简单延伸，将两组序列进行比对。通过一系列渐近配对比对，完成最终比对。通过对序列比较区指定具体序列及其氨基酸或核苷酸坐标并通过指定程序参数，运行该程序。运用PILEUP，采用以下参数缺省空位加权(default gap weight) (3. 00)、缺省空位长度加权(default gap length weight) (0· 10)和加权末端空位(weighted end gap)，可将参比序列与其它测试序列进行比较，以确定百分比序列同一性关系。PILEUP可得自GCG序列分析软件包，例如7. 0版本(Devereaux等，Nuc. Acids Res. 12 :387-395(1984)。适用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一个实例是BLAST和 BLAST 2. 0 算法，其分别在 Altschul 等，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402 (1977)和 Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990)中有描述。用于进行BLAST分析的软件公众可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(网址在 www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。该算法包括首先通过鉴定在查询序列中与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某些正阈值分数T的长度W的短字串，来鉴定高分序列对(HSP)。T被称为邻近字串分数阈值(Altschul等，见上文)。这些起始邻近字串命中作为用于起始搜索以发现含有其的更长HSP的种子。只要累积比对分数可增加，字串命中则以两个方向沿每个序列延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(对匹配残基对的奖分(reward score)；总是>0)和N(对错配残基的罚分(penalty score)；总是< 0)，计算累积分数。 对于氨基酸序列，使用计分矩阵来计算累积分数。字串命中在每个方向的延伸当遇到下述情况时终止累积比对分数比其获得的最大值低数量X ；累积分数为零或零以下，这是由于一个或多个负计分残基比对的累加所致；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、 T和X决定所述比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为 11，期望值(E)为10，M = 5，N = -4作为缺省值，并且比较两条链。对于氨基酸序列而言， BLASTP程序作为缺省值使用字长(W)为3和期望值(E)为10，以及BL0SUM62计分矩阵(参见 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 10915 (1989))比对(B)为 50， 期望值(E)为10，M = 5，N = -4，并且比较两条链。BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Kar 1 in和 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 90:5873-5787(1993))。BLAST 算法提供的相似性的一种衡量是最小总和概率(smallest sum probability) (P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列偶然发生匹配的概率的指标。例如，如果测试核酸与参比核酸比较中的最小总和概率小于约0. 2、更优选小于约0. 01和最优选小于约0. 001，则认为核酸与参比序列相似。本发明还涉及用于治疗或预防潜伏性TB的多核苷酸，其包含第一核苷酸序列， 该序列在中等严格条件下(例如在高度严格条件下)与第二核苷酸序列的互补序列 (complement)选择性杂交，所述第二核苷酸序列编码以下多肽，其包含
(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。措词“高度严格杂交条件”是指以下条件在该条件下探针将杂交至通常在核酸的复杂混合物中的其靶亚序列，但不会杂交至其它序列。高度严格条件为序列依赖性的并且在不同情况下不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详细指南 bJ#JAL Ti jssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology__Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of Nucleic Acid assays (杂交原理和核酸测定策略的综述)”(1993)。通常，将高度严格条件选择在限定的离子强度、PH下，比特定序列的热解链温度(Tm)低约5-10°C。Tm为(在限定的离子强度、PH和核酸浓度下)平衡时50%与靶互补的探针杂交至靶序列的温度(由于靶序列过量存在，所以在Tm下，50%探针在平衡时被占用)。高度严格条件是以下条件 其中pH 7. 0-8. 3，盐浓度低于约1.0M钠离子、通常约0.01-1. OM钠离子浓度(或其它盐)， 温度对短探针(例如10-50个核苷酸)至少约30°C和对长探针(例如超过50个核苷酸) 至少约60°C。高度严格条件也可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来达到。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的两倍，任选为背景杂交的10倍。例示性的高度严格杂交条件可为如下50%甲酰胺，5\55(和SDS，于42°C保温，或者 5XSSC，1% SDS，于 65°C保温，在 0. 2XSSC 和 0. SDS 中于 65°C洗涤。如果核酸所编码的多肽基本同一，则在高度严格条件下彼此不杂交的核酸仍然在功能上等同。这发生于例如当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时。 在此情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。例示性的“中等严格杂交条件”包括在40%甲酰胺、IM NaClU % SDS的缓冲液中于37°C杂交，然后在IXSSC中于45°C洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。普通技术人员容易认识到可采用备选的性杂交和洗涤条件以提供类似严格性的条件。措词“选择性(或特异性)杂交至”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与该序列结合、双链化或杂交。在任何情况下，多肽序列的变体具有与参比序列基本相同的活性(在多核苷酸的情况下，变体多核苷酸序列编码具有与参比序列活性基本相同的多肽)。基本相同的活性意指在用特定抗原体外再刺激PBMC或全血的测定(例如再刺激数小时至高达两周的时期， 例如高达1天、1天至1周或1-2周)中的参比序列活性的至少50%、适宜至少75%和尤其至少90%，所述测定通过淋巴组织增生、在培养上清液中细胞因子的产生(由ELISA、CBA 等测量)测量细胞的活化，或者通过胞内和胞外染色(例如使用特异于免疫标志物(例如 CD3、CD4、CD8、IL2、TNFa, IFNg, CD40L、CD69等)的抗体)接着用流式细胞仪分析，来表征 T和B细胞应答。合适的是，基本相同的活性意指在T细胞增殖和/或IFN-Y产生测定中的参比序列活性的至少50%、适宜至少75%和尤其至少90%。多核苷酸组合物本文所用术语“多核苷酸”是指已分离、无特定物种总基因组DNA的分子。因此， 编码多肽的多核苷酸是指含一个或多个编码序列、但基本上从获取所述多核苷酸的物种总基因组DNA中完全分离或纯化的多核苷酸区段。
本领域技术人员应理解的是，用于本发明的多核苷酸可包括基因组序列、基因组外序列和质粒编码的序列以及较小的改造的基因区段，其表达或可适于表达蛋白、多肽、肽等。这类区段可以是天然分离的，或人工合成修饰的。本文所用的“分离的”是指多核苷酸基本上与其它编码序列分开并且所述多核苷酸不含大部分无关编码DNA，例如大染色体片段或其它功能基因或多肽编码区。分离核酸与其它可读框分离，所述可读框位于基因侧翼并编码除该基因外的蛋白。当然，这是指最初分离的DNA区段，并不排除以后通过人工向该区段添加的基因或编码区。技术人员应认识到，多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其包含内含子并以一对一方式对应于DNA分子)和mRNA分子(其不包含内含子)。额外的编码或非编码序列可以(但并非必需)存在于本发明多核苷酸内，并且多核苷酸可以(但并非必需)与其它分子和/或支持材料连接。多核苷酸可包含天然序列(即编码分枝杆菌抗原或其部分的内源序列)或可包含所述序列的变体或者生物学等同物或功能等同物。如下文进一步描述，多核苷酸变体可含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，相对于参比蛋白来说，优选使得所编码多肽的免疫原性并未减少。对所编码多肽的免疫原性的影响通常可如本文所述进行评价。在另外的实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸和多肽，其包含与本文所公开的一个或多个序列相同或互补的不同长度的连续序列段。例如，本发明提供的多核苷酸包含本文所公开的参比序列的至少约30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000个或更多个连续核苷酸以及它们之间的所有中间长度。容易理解的是，在该范围之内，“中间长度”是指所给出的数值间的任何长度，例如30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103 等；150、151、152、153 等；包括 200-500 ；500-1，000 等的所有整数。此外，本领域普通技术人员应认识到的是，由于遗传密码的简并性，所以存在许多编码本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的某些具有与任何天然基因的核苷酸序列的相对低的同一性。尽管如此，因密码子使用差异而不同的多核苷酸都明确由本发明所考虑，例如为人和/或灵长类密码子选择而最优化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也在本发明范围之内。等位基因是因一个或多个突变而改变的内源基因，所述突变为例如核苷酸的缺失、添加和/或取代。所得mRNA和蛋白可以(但并非必需)具有改变的结构或功能。等位基因可以用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)进行鉴定。多肽鉴定和表征可用多种已良好建立的技术中的任一种，来鉴定、制备和/或操作多核苷酸。 例如，如下文更详细描述，可通过筛选cDNA微阵列来鉴定多核苷酸。可例如按照生产商的说明书(以及基本如以下文献所述Jchena等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 10614-10619(1996)和 Heller 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :2150-2155 (1997))，使用 Synteni微阵列(Palo Alto，CA)，进行这样的筛选。或者，可以从表达本文所述蛋白的细胞 (例如结核分枝杆菌细胞)制备的cDNA中扩增多核苷酸。可通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这样的多核苷酸。对于该方法，可根据本文提供的序列来设计序列特异性引物，也可购买或合成引物。
使用众所周知的技术，可将多核苷酸的扩增部分用于从合适文库(例如结核分枝杆菌cDNA文库)中分离出全长基因。在这样的技术中，用适合扩增的一个或多个多核苷酸探针或引物筛选文库(cDNA或基因组文库)。优选的是，文库经大小选择以包含较大的分子。也可优选将随机引物文库用于鉴定基因的5’和上游区。优选将基因组文库用于获取内含子和延伸5’序列。对于杂交技术，可以使用众所周知的技术标记部分序列(例如通过切口平移或末端标记32P)。然后一般通过使含有变性菌落(或含有噬斑的菌苔)滤膜与经标记的探针杂交，筛选细菌文库或噬菌体文库(参见Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (2000))。选择并扩增杂交菌落或噬斑，然后分离DNA用于进一步分析。可通过例如 PCR，使用来自部分序列的引物和来自载体的引物，分析cDNA克隆以确定额外序列的量。可产生限制图谱和部分序列，以鉴定一个或多个重叠克隆。然后可使用可包括产生系列缺失克隆的标准技术，确定完整序列。然后可将所得重叠序列装配成单个连续序列。可使用众所周知的技术，通过连接合适片段产生全长cDNA分子。或者，存在大量的扩增技术用于根据部分cDNA序列得到全长编码序列。这些技术中，一般通过PCR进行扩增。多种市售试剂盒中的任一种都可用于进行扩增步骤。可使用例如本领域众所周知的软件来设计引物。引物优选长度为22-30个核苷酸，GC含量至少为 50%并且在约68°C _72°C的温度下退火到靶序列上。可如上所述对扩增区进行测序，并将重叠序列装配成连续序列。一种这样的扩增技术是反向PCR(参见Triglia等，Nucl. Acids Res. 16 8186(1988))，该技术使用限制酶在基因已知区内产生片段。再通过分子内连接使片段环化，并用作使用来自已知区的反向引物(divergent primer)的PCR模板。在备选方法中， 邻接部分序列的序列可通过用接头序列的引物和对已知区具有特异性的引物扩增来回溯 (retireve)。扩增的序列通常经过第2轮扩增，其用同样的接头引物和对已知区具有特异性的第二引物。该方法的一个改动就是使用沿已知序列的相反方向开始延伸的两个引物， 参见WO 96/38591。另一种这样的技术称为“cDNA末端快速扩增”或RACE。该技术包括使用内部引物和外部引物，其能与polyA区或载体序列杂交，以鉴定位于已知序列的5’和3’处的序列。另外的技术包括捕获PCR(Lagerstrom等，PCR Mehtods Applic. 1 :111-19(1991)) 和步移 PCR(walking PCR) (Parker 等，Nucl. Acids. Res. 19 :3055-60 (1991))。使用扩增的其它方法也可用于获取全长cDNA序列。在某些情况下，可通过分析例如得自GenBank的表达序列标签(EST)数据库提供的序列，获取全长cDNA序列。通常可用众所周知的程序(例如NCBI BLAST搜索)进行重叠EST的搜索，并且这样的EST可用于产生连续的全长序列。也可通过分析基因组片段获取全长DNA序列。在宿主细胞中的多核苷酸表达编码多肽或者其融合蛋白或功能等同物的多核苷酸序列或其片段可用于重组DNA 分子中，以在合适宿主细胞中指导多肽表达。因为遗传密码的固有简并性，所以可产生编码基本相同或功能等同氨基酸序列的其它DNA序列，而且这些序列可用于克隆和表达既定多肽。本领域技术人员应理解，在某些情况下产生具有非天然存在密码子的编码多肽的核苷酸序列可为有利的。例如，可以选择特定原核或真核宿主偏好的密码子，以增加蛋白表达速率或产生具有所需特性(例如半衰期比天然存在序列所产生的转录物的长)的重组 RNA转录物。此外，可使用本领域公知的方法改造多核苷酸序列，以为了各种原因改变多肽编码序列，包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工和/或表达的改变。例如，通过对基因片段和合成寡核苷酸的随机片段化和PCR再装配的DNA改组，可用于改造核苷酸序列。另外， 位点定向诱变可用于插入新限制位点、改变糖基化模式、改变密码子偏好、产生剪接变体或引入突变等。可将天然、修饰或重组核酸序列与异源序列连接，以编码融合蛋白。例如，为了针对多肽活性抑制剂筛选肽文库，其可用于编码可被市售抗体识别的嵌合蛋白。也可改造融合蛋白，以在介于多肽编码序列与异源蛋白序列之间含有切割位点，使得可切割多肽并经纯化而与异源部分分开。可采用本领域众所周知的化学方法，全部或部分合成编码所需多肽的序列(参见 Caruthers,M. H.等，Nucl. Acids Res. Symp. Ser.第 215-223 页(1980)，Horn等，Nucl. Acids Res. Symp. Ser.第225-232页(1980))。或者，可用化学方法合成多肽氨基酸序列或其部分，来产生蛋白本身。例如，可使用各种固相技术进行肽合成(Roberge等，Science 269 202-204(1995))，而且可例如使用 ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Palo Alto, CA)来实现自动化合成。可通过制备型高效液相色谱(例如Creighton，Proteins， Structures and Molecular Principles (1983))或本领域可用的其它类似技术，基本纯化新合成的肽。合成肽的组成可通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解法)得以证实。另外，多肽的氨基酸序列或其任何部分可在直接合成期间改变和/或使用化学方法与来自其它蛋白的序列或其任何部分组合，以产生变体多肽。为了表达所需多肽，可以将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入到合适表达载体，即含有用于转录和翻译所插入编码序列的必要元件的载体中。可以用本领域技术人员众所周知的方法来构建含有目标多肽编码序列及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。这些技术参见Sambrook 等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2000)禾口 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (每年更新)。各种表达载体/宿主系统可用于包含和表达多核苷酸序列。它们包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母菌；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV ；烟草花叶病毒，TMV)或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区——增强子、 启动子、5'和3'非翻译区，它们与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这类元件的强度和特异性可不同。根据所用的载体系统和宿主，可使用许多合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子，例如 PBLUESCRIPT 噬菌粒(Stratagene, La Jolla, Calif.)或 PSP0RT1 质粒(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)的杂合IacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有多拷贝的多肽编码序列的细胞系， 基于SV40或EBV的载体可有利地与合适的选择标记一起使用。在细菌系统中，可根据所表达多肽的预期用途，选择多种表达载体。例如，当需要大量多肽例如用于诱导抗体时，可使用指导容易纯化的融合蛋白高水平表达的载体。这样的载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPTGtratagene)， 其中编码目标多肽的序列可与氨基端Met和其后7个残基β -半乳糖苷酶的序列一起符合读框地连接到载体中，使得产生杂合蛋白；PlN载体(Van Heeke和Schuster，J.Biol. Chem. 264 :5503-5509(1989))；等等。pGEX 载体(Promega，Madison，Wis.)也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，这样的融合蛋白是可溶性的，并可通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上、接着在游离谷胱甘肽存在下进行洗脱，从裂解细胞中容易地纯化该融合蛋白。可设计在这种系统中制备的蛋白，以使其包含肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位点，使得克隆的目标多肽可随意从GST部分释放出来。在酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用多种含有组成型或诱导型启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体。其它载体含有的组成型或诱导型启动子包括GAP、PGK、GAL和ADH。有关综述可参见Ausubel等(见上文)、Grant等，Methods Enzymo 1. 153 :516-544(1987)和 Romas 等，Yeast 8 423-88(1992)。在使用植物表达载体的情况下，多肽编码序列的表达可由任意多种启动子驱动。例如，病毒启动子(例如CaMV的35S和19S启动子)可单独使用，或者与来自TMV 的Ω前导序列一起使用(Takamatsu, EMBO J. 6 :307-311 (1987))。或者，可使用植物启动子例如RUBISC0的小亚基或热激启动子(Coruzzi等，EMBO J. 3 1671-1680 (1984)； Broglie 等，Science 224 :838-843(1984)；和 Winter 等，Results Probl. Cell Differ. 17 85-105 (1991))。可通过直接DNA转化或病原体介导的转染，将这些构建体导入植物细胞中。这类技术可参见大量普遍可得的综述(参见例如HcAbs，载于McGraw Hill Yearbook of Science and Technology，第 191-196 页(1992))。昆虫系统也可用于表达目标多肽。例如，在一个这样的系统中，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)用作载体，以在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。多肽编码序列可克隆至该病毒的非必需区，例如多角体蛋白基因，并处于多角体蛋白启动子的控制之下。多肽编码序列的成功插入，将会使多角体蛋白基因失活，并产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后将重组病毒用于感染例如草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，其中可表达目标多肽(Engelhard 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91 :3224-3227 (1994))。在哺乳动物宿主细胞中，多种基于病毒的表达系统为通常可得到的。例如，在将腺病毒用作表达载体的情况下，可将编码目标多肽的序列连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体中。在病毒基因组的非必需El或E3区中的插入，可用于获得在受感染的宿主细胞中能表达所述多肽的活病毒(Logan和Surnk，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81 :3655-3659 (1984))。另外，转录增强子(例如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子)可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。采用腺病毒载体的方法和方案的综述参见Wold，Adenovirus Methods and Protocols，1998。关于腺病毒载体应用的其它参考文献可参见 Adenovirus :A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References,2004。特定起始信号也可用于达到更有效地翻译目标多肽编码序列。这类信号包括ATG 起始密码子和邻接序列。在多肽编码序列的情况下，将其起始密码子和上游序列插入到合适表达载体中，无需其它转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其部分的情况下，应提供外源翻译控制信号，其包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应处于正确读框中，以确保翻译整个插入物。外源翻译元件和起始密码子可以来自不同来源，天然和合成的均可。可通过包含适于所用特定细胞系统的增强子来提高表达效率，例如文献中所述的增强子(Scharf等，Results Probl. Cell Differ. 20 125-162 (1994))。另外，可根据宿主细胞株以所需方式调节所插入序列的表达的能力或加工所表达蛋白的能力来对其进行选择。多肽的这类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化(Iipidation)和酰化。可将切割蛋白的“前原(pr印ro)”形式的翻译后加工用于促进正确插入、折叠和/或行使功能。可选择对这类翻译后活性具有特定细胞机构 (machinery)和特征性机制的不同宿主细胞(例如CH0、HeLa、MDCK、HEK293和WI38)，以确保外源蛋白的正确修饰和加工。为了长期、高收率地制备重组蛋白，通常优选稳定表达。例如，稳定表达目标多核苷酸的细胞系可用表达载体转化，所述表达载体可在相同或不同载体上含有病毒复制起点和/或内源表达元件和选择标记基因。导入载体后，可让细胞在富集培养基上生长1-2天， 然后换到选择培养基上。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且它的存在使可成功表达所导入序列的细胞生长和对其回收。稳定转化细胞的抗性克隆可使用适于该细胞类型的组织培养技术进行增殖。许多选择系统可用于回收转化细胞系。这些系统包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11 :223-32(1977))基因和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等， Cell 22 :817-23(1990))基因，这两者可分别用于tk_或aprt._细胞。同样，针对抗代谢物、抗生素或除草剂的抗性也可用作选择基础；例如，赋予甲氨蝶呤抗性的dhfr (Wigler 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 77 :3567-70(1980))；赋予氨基糖苷类、新霉素和 G-418 抗性的 npt (Colbere-Garapin 等，J. Mol. Biol. 150 :1-14(1981))；和分别赋予氯磺隆 (chlorsulfuron)和膦丝菌素(phosphinotricin)乙酰转移酶抗性的 als 或 pat (Murry， 见上文)。其它选择基因已有描述，例如允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB、或者允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的 hisD (Hartman 和 Mulligan，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :8047-51 (1988))。近来，可见标记的使用得到普及，这样的标记例如花色素苷、β -葡糖醛酸糖苷酶及其底物GUS、萤光素酶及其底物萤光素，不仅广泛用于鉴定转化体，而且广泛用于定量特定载体系统的瞬时或稳定蛋白表达的量(Miodes等，Methods Mol. Biol. 55 :121-131 (1995))。尽管标记基因表达的存在/不存在表明目标基因也存在，但它的存在和表达可能需要证实。例如，如果将编码多肽的序列插入到标记基因序列内，则可根据标记基因功能缺失，鉴定含有该序列的重组细胞。或者，标记基因可与多肽编码序列串联起来并处于一个启动子控制之下。标记基因响应诱导或选择的表达，通常也表示串联基因的表达。或者，可通过各种本领域技术人员已知的方法鉴定含有并表达所需多核苷酸序列的宿主细胞。这些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物测定或免疫测定技术，其包括基于膜、溶液或芯片的技术，用于检测和/或定量测定核酸或蛋白。使用对产物具有特异性的多克隆或单克隆抗体来检测和测定多核苷酸编码产物的表达的许多方案，都为本领域已知。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。对于某些应用来说，可能优选两位点的基于单克隆的免疫测定法(使用对既定多肽上的两个非干扰表位具有反应性的单克隆抗体)，但也可使用竞争性结合测定法。这些测定和其它测定尤其描述于Hampton等，Serological Methods, a Laboratory Manual(1990)禾口 Maddox 等，J. Exp. Med. 158 :1211-1216(1983)。多种标记和缀合技术为本领域技术人员已知，并且可用于各种核酸和氨基酸测定。用于产生用于检测多核苷酸相关序列的经标记的杂交或PCR探针的方法包括寡核苷酸标记、切口平移、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。或者，可将序列或其任何部分克隆到载体中，用于产生mRNA探针。这类载体是本领域已知的，是市售的，并且可通过添加适当的RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6)和标记的核苷酸，用于体外合成RNA探针。可用各种市售试剂盒实施这些方法。可使用的合适报道分子或标记包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或生色剂及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。可将用目标多核苷酸序列转化的宿主细胞在适于表达和从细胞培养物中回收蛋白的条件下培养。重组细胞产生的蛋白可以是分泌型的或者包含在细胞内，这视所用序列和/或载体而定。本领域技术人员应理解的是，含有多核苷酸的表达载体可经设计，以包含指导所编码多肽分泌通过原核或真核细胞膜的信号序列。其它的重组构建体可用于使编码目标多肽的序列与编码多肽结构域的核苷酸序列连接起来，所述多肽结构域促进可溶性蛋白的纯化。这样的促进纯化的结构域包括但不限于允许在固定化金属上纯化的金属螯合肽例如组氨酸-色氨酸组件、允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域、以及用于 FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp. , Seattle, Wash.)的结构域。可使用在纯化结构域与所编码多肽之间包含的可切割接头序列(例如对因子XA或肠激酶具有特异性的序列anvitrogen. San Diego，Calif.))，以促进纯化。将一种这类表达载体用于以下融合蛋白的表达所述融合蛋白包含目标多肽和位于硫氧还蛋白或肠激酶切割位点之前的核酸编码的6个组氨酸残基。组氨酸残基有助于在IMIAC(固定化金属离子亲和色谱)上进行纯化，参见Porath等，Prot. Exp. Purif. 3 :263-281 (1992)，而肠激酶切割位点则提供用于从融合蛋白中纯化所需多肽的方法。有关含有融合蛋白的载体的论述参见Kroll等，DNA Cell Biol. 12 :441-453(1993))。体内多核苷酸递送技术在另外的实施方案中，将包含本发明的一个或多个多核苷酸的遗传构建体体内导入细胞内。这可用多种众所周知的方法中的任一种来完成，其中的一些方法概述如下，用于说明的目的。1.腺病毒用于体内递送一个或多个核酸序列的优选方法中的一种包括使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意指包括含足以执行以下功能的腺病毒序列的构建体(a)支持构建体的包装和(b)表达已按有义或反义方向克隆在其中的多核苷酸。当然，在反义构建体的情况下，表达并不需要合成该基因产物。
表达载体包括腺病毒的基因工程改造形式。腺病毒遗传构成的知识(361Λ，线状双链DNA病毒)允许用多达71Λ的外源序列备选大片段腺病毒DNA (Grunhaus和Horwitz， 1992)。与反转录病毒相反，腺病毒感染宿主细胞不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以附加体方式复制，没有潜在基因毒性。此外，腺病毒结构稳定，在大量扩增后没有检出基因组重排。腺病毒可感染几乎所有上皮细胞，与其细胞周期阶段无关。迄今为止，腺病毒感染看来仅引起人的轻微疾病，例如急性呼吸道疾病。腺病毒尤其适用于作为基因传递载体，这是因为其基因组大小适中、易操作、滴度高、靶细胞范围广、侵染性高。病毒基因组两端含有100-200个碱基对反向重复序列(ITR)， 其是病毒DNA复制和包装所需的顺式元件。基因组早期(E)和晚期(L)区含有不同转录单位，它们按病毒DNA复制开始来划分。El区(ElA和ElB)编码负责调节病毒基因组和少量细胞基因转录的蛋白。E2区(E2A和E2B)的表达导致合成用于病毒DNA复制的蛋白。这些蛋白涉及DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。包括大部分病毒衣壳蛋白在内的晚期基因产物仅在由主要晚期启动子(MLP)引起的对单一初级转录物的明显加工之后才表达。MLP (位于16. 8m. u.)在感染晚期特别有效，并且该启动子产生的所有mRNA 都具有5’ -三联前导(TPL)序列，该序列使它们成为翻译的优选mRNA。在目前的系统中，重组腺病毒由穿梭载体与原病毒载体之间同源重组产生。因为两个原病毒载体之间可能重组，所以该过程可能产生野生型腺病毒。因此，从单个噬斑分离出病毒单克隆并检查其基因组结构是至关重要的。目前复制缺陷型腺病毒载体的产生和增殖，取决于独特的辅助细胞系(称为 293)，其由Ad5 DNA片段转化自人胚肾细胞，并且能组成型地表达El蛋白(Graham等， 1977)。因为E3区并非腺病毒基因组所必需的(Jones和Sienk，1978)，所以目前的腺病毒载体，在四3细胞辅助下，在E1、D3或这两个区携带外源DNA (Graham和Prevec，1991)。在自然界，腺病毒可包装约105%的野生型基因组((ihosh-Choudhury等，1987)，提供约2kB的额外DNA容量。与在El和E3区可替代的约5.5kB DNA组合，目前腺病毒载体的最大容量小于7. 5kB，或约载体总长的15%。超过80%腺病毒病毒基因组保留在载体主链中，是载体带有的细胞毒性的来源。而且，缺失El的病毒的复制缺陷是不完全的。例如，在高感染复数(MOI)下，用目前可用载体已观察到病毒基因表达的渗漏(Mulligan，1993)。辅助细胞系可来自人类细胞，例如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞或其它人胚胎间充质细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可来源于与人腺病毒相容的其它哺乳动物细胞。这类细胞包括例如Vero细胞或其它猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。如上所述，目前优选的辅助细胞系是四3。Racher等(19卯)公开了用于培养四3细胞和增殖腺病毒的改良方法。在一种形式中，通过将单个细胞群接种到含100-200ml培养基的1升硅化摇瓶(siliconised spinner flask) (Techne, Cambridge, UK)中，使天然细胞聚集体生长。在40rpm搅拌后，用锥虫蓝评价细胞生存力。在另一种形式中，将Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin, Stone,UK) (5g/l) 如下使用。在250ml锥形瓶中，将重悬于5ml培养基中的细胞接种物加入到载体(50ml)中， 静置1-4小时，偶尔搅拌。然后将培养基用50ml新鲜培养基更换，然后振摇。为了病毒制备，让细胞生长至约80%汇合，然后更换培养基(至25%的终体积)并以MOI为0. 05加入腺病毒。让培养物静置过夜，然后将体积增加至100%并再开始振摇72h。
除了需要腺病毒载体是复制缺陷型或者至少是条件缺陷型之外，认为腺病毒载体的特性对本发明的成功实施来说并非至关重要。腺病毒可为42种不同已知血清型或A-F 亚群中的任一种。腺病毒C亚群5型为获得用于本发明的条件复制缺陷型腺病毒载体的优选原料，因为腺病毒5型是人腺病毒，关于其的许多生化和遗传信息是已知的，而且其曾用于大多数以腺病毒为载体的构建中。如上所述，本发明的典型载体是复制缺陷型且没有腺病毒El区。因此，最合宜的是将编码目标基因的多核苷酸引入到已去除El-编码序列的位置上。然而，腺病毒序列内构建体的插入位置对本发明而言并非至关重要。编码目标基因的多核苷酸也可插入到如 Karlsson等(1986)所述的E3置换型载体中取替缺失的E3区或其中辅助细胞系或辅助病毒能弥补E4缺损的E4区中。腺病毒容易培养和操作，体外和体内均具有广泛宿主范围。该类病毒可以高滴度获取，例如IO9-IO11噬斑形成单位/ml，而且是高感染性的。腺病毒生命周期无需整合到宿主细胞基因组中。腺病毒载体所递送的外源基因是附加体，因此对宿主细胞的基因毒性低。 在野生型腺病毒接种研究中，未报道有副作用(Couch等，1963 ；Top等，1971)，证明其作为体内基因转移载体具有安全性和治疗潜力。腺病毒载体已用于真核基因表达(Levrero等，1991 ；Gomez-Foix等，1992) 和疫苗开发(Grunhaus 和 Horwitz, 1992 ；Graham 和 Prevec, 1992)。近来，动物研究表明重组腺病毒可用于基因疗法(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991 ； Stratford-Perricaudet等，1990 ；Rich等，1993)。将重组腺病毒给予不同组织的研究包括气管滴注(Rosenfeld等，1991 ；Rosenfeld等，1992)、肌注(Ragot等，1993)、外周静脉注射 (Herz 和 Gerard，1993)和立体定向接种(stereotactic inoculation)到脑部(Le Gal La Salle 等，1993)。腺病毒载体可来源于人腺病毒。或者，它们可来源于诸如黑猩猩等其它物种的腺病毒，其优点是病毒载体不被许多人类受试者中循环的针对人腺病毒的抗体所中和(参见例如=Tatsis N 等 Gene Therapy 2006 13:421-429)。腺病毒35型(其相对不常见，因此存在低水平的预先存在的对该载体本身的免疫)已用作某些正在开发中的结核病疫苗的递送系统(参见，例如Radosevic等hfection and Immunity 2007 75(8) :4105-4115)。腺病毒35型在本发明中作为递送载体还可具有特殊价值。2.反转录病毒反转录病毒是一类单链RNA病毒，特征在于以下能力在感染细胞中通过反转录过程能将其RNA转变成双链DNA (Coffin，1990)。然后所得DNA稳定整合在细胞染色体中成为原病毒并指导病毒蛋白合成。所述整合导致在受体细胞及其后代中保留病毒基因序列。 反转录病毒基因组含有gag、pol和env三个基因，它们分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分。在gag基因上游发现的序列含有将基因组包装在病毒体中的信号。两个长末端重复 (LTR)序列存在于病毒基因组的5’和3’端。它们含有强启动子和增强子序列，也是整合到宿主细胞基因组中所需要的(Coffin，1990)。为了构建反转录病毒载体，将编码一个或多个目标寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸插入到病毒基因组内某些病毒序列的位置上，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建含有gag、pol和env基因、但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Marm等，1983)。当将含有cDNA以及反转录病毒LTR和包装序列的重组质粒导入该细胞系(通过例如磷酸钙沉淀)时，包装序列使重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，病毒颗粒随后被分泌到培养基中(Nicolas 和 Rubenstein，1988 ；Temin, 1986 ；Mann 等，1983)。然后收集含重组反转录病毒的培养基，任选浓缩，然后用于基因转移。反转录病毒载体能够感染各种各样的细胞类型。然而，整合和稳定表达则需要宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。最近，根据通过使乳糖残基经化学法添加到病毒包膜上而对反转录病毒进行化学修饰，开发了用于允许反转录病毒载体特异性靶向的新方法。该修饰使得可通过唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。设计了重组反转录病毒靶向的不同方法，其中使用针对反转录病毒包膜蛋白和特异性细胞受体的生物素化抗体。经使用链霉抗生物素，该抗体通过生物素组分进行偶联 (Roux等，1989)。Roux等人使用针对I类和II类主要组织相容性复合体抗原的抗体，表明携带这些表面抗原的各种人类细胞在体外可被同向性病毒感染(Roux等，1989)。3.腺伴随病毒AAV (Ridgeway, 1988 ；Hermonat 禾口 Muzycska，1984) MiM^vMM (parovirus)，
发现为腺病毒原液的污染物。其是与任何疾病无关的遍在病毒(美国人口中有85%都存在抗体)。其也被分类为依赖病毒，因为其复制依赖于诸如腺病毒等辅助病毒的存在。已经分离出5种血清型，其中已充分表征了 AAV-2。AAV具有单链线状DNA，其包裹在衣壳蛋白VP1、 VP2和VP3中，形成直径20-24nm的二十面体病毒体(Muzyczka和McLaughlin，1988)。AAV DNA长约4. 7千碱基。其包含两个可读框并位于两个ITR的侧翼。AAV基因组中有两个主要基因r印和cap。r印基因编码负责病毒复制的蛋白，而cap编码衣壳蛋白VP1-3。每个ITR形成T-形发夹结构。这些末端重复序列是对AAV的染色体整合唯一必需的顺式组分。因此，AAV可用作载体，其中所有病毒编码序列都被除去并用递送基因盒替代。根据图谱位置，鉴定并命名了 P5、pl9和p40三个病毒启动子。从p5和pl9转录导致产生r印蛋白，而从p40转录产生衣壳蛋白(Hermonat和Muzyczka，1984)。有若干因素促使研究人员研究使用rAAV作为表达载体的可行性。一个因素就是对递送基因以整合到宿主染色体的要求出奇地少。需要具有I^bp ITR，其仅占AAV基因组的6%。这在载体中留下装配4. 51Λ DNA插入物的空间。尽管这样的携带容量可阻止AAV 递送大基因，但是这完全适合递送反义构建体。由于AAV的安全性，所以其也是递送载体的良好选择。存在相对复杂的拯救机制 为了动员rAAV，不仅需要野生型腺病毒而且需要AAV基因。而且，AAV为无致病性并与任何疾病无关。除去病毒编码序列使对病毒基因表达的免疫反应最小化，因此，rAAV不会引起炎性反应。4.作为表达构建体的其它病毒载体其它病毒载体可用作本发明的表达构建体，用于将寡核苷酸或多核苷酸序列递送给宿主细胞。可使用来源于诸如痘苗病毒(Ridgeway，1988 ；Coupar等，1988)、慢病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒等病毒的载体。也可预期源于其它痘病毒的载体例如源于禽痘的载体为有用的。它们给各种哺乳动物细胞带来一些有吸引力的特征(Friedmarm，1989 ； Ridgeway, 1988 ；Coupar 等，1988 ；Horwich 等，1990)。
随着目前对缺陷型乙肝病毒的认识，获得了有关不同病毒序列的结构-功能关系的新认识。体外研究表明，病毒可保留辅助-依赖性包装和反转录的能力，即使其基因组缺失高达80% (Horwich等，1990)。这表明基因组的大部分都可用外源遗传物质替换。趋肝性和持久性(整合)对于肝定向基因转移而言是特别有吸引力的性质。Chang等(1991)将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因在聚合酶编码序列、表面编码序列和前表面编码序列的位置导入鸭乙肝病毒基因组中。将其与野生型病毒共转染到禽类肝癌细胞系中。用含高滴度重组病毒的培养基来感染原代小鸭肝细胞。转染后持续至少M天检测到稳定的CAT基因表达(Chang 等，1991)。另外的“病毒”载体包括病毒样颗粒(VLP)和噬菌体。5.非病毒载体为了实现本发明寡核苷酸或多核苷酸序列的表达，必须将表达构建体递送到细胞中。可在体外(如在用于转化细胞系的实验室方法中)或者在体内或离体(如在某些疾病状态的治疗中)完成这样的递送。如上所述，一种优选的递送机制是通过病毒感染，其中表达构建体包裹在感染性病毒颗粒之内。一旦将表达构建体递送到细胞中，编码所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸可在不同位置定位和表达。在某些实施方案中，编码构建体的核酸可稳定整合到细胞基因组中。 这样的整合可通过同源重组(基因置换)处于特定位置和方向，或者其可整合在随机的非特异性位置上(基因增强)。在再一个实施方案中，核酸可以稳定保留在细胞中，作为单独的附加体DNA区段。这类核酸区段或“附加体”编码以下序列其足以允许独立于或同步于宿主细胞周期的保留和复制。表达构建体如何递送给细胞以及核酸保留在细胞的何处，取决于所用表达构建体的类型。在本发明的某些实施方案中，包含一个或多个寡核苷酸或多核苷酸序列的表达构建体可仅由裸的重组DNA或质粒构成。构建体的转移可例如通过以物理法或化学法透过细胞膜的任何方法来进行。这尤其适用于体外转移，但也可用于体内使用。Dubensky等 (1984)成功地将多瘤病毒DNA以磷酸钙沉淀形式注入成年小鼠和新生小鼠肝和脾中，所述小鼠表现出活动性病毒复制和急性感染。Benvenisty和Reshef (1986)也表明直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒，导致转染基因的表达。预期也可在体内以类似方式转移编码目标基因的DNA并表达基因产物。用于将裸DNA表达构建体转入细胞的本发明的另一个实施方案涉及粒子轰击。该方法依赖于使包被DNA的微粒加速到高速而让其穿过细胞膜和进入细胞而不杀死细胞的能力(Klein等，1987)。已经开发了用于加速小颗粒的一些装置。一个这样的装置依靠高压放电产生电流，这样的电流又提供原动力(Yang等，1990)。所用的微粒由诸如钨珠或金珠等生物惰性物质组成。已经对包括大鼠和小鼠的肝、皮肤和肌肉组织在内的所选器官进行体内轰击 (Yang等，1990 ；Zelenin等，1991)。这可能需要经手术暴露组织或细胞，以消除枪与靶器官之间的任何中间组织，即离体处理。此外，编码特定基因的DNA可通过该方法递送，这也包括在本发明中。细菌也可用作递送手段(例如李斯特菌，参见W02004/11048)，尤其是BCG。多肽组合物
通常，用于本发明中的多肽应为分离的多肽(即与其通常与之一起存在于自然中的组分分离)。例如，如果天然存在的蛋白与天然系统中共同存在的某些或所有物质分离，则所述蛋白为分离的。优选这类多肽的纯度为至少约90%，更优选至少约95%，最优选至少约 99%。如果多核苷酸例如被克隆到并非其天然环境的一部分的载体中时，则认为其为分离的。多肽可用任何众所周知的技术来制备。如上所述的DNA序列编码的重组多肽可容易利用本领域普通技术人员已知的任何表达载体从该DNA序列制备。可在已用含编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的任何合适宿主细胞中进行表达。合适宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞和高等真核细胞，例如哺乳动物细胞和植物细胞。优选使用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞系例如COS或CH0。可以先用市售滤器浓缩来自合适宿主/载体系统的上清液，所述合适宿主/载体系统分泌重组蛋白或多肽至培养基中。浓缩后，可将浓缩物施加至合适的纯化基质，例如亲和基质或离子交换树脂。最后，可使用一个或多个反相HPLC步骤，以进一步纯化重组多肽。使用本领域普通技术人员熟知的技术，也可通过合成方法产生少于约100个氨基酸、通常少于约50个氨基酸的本发明多肽、其免疫原性片段和其它变体。例如，可用任何市售固相技术合成这样的多肽，所述技术为例如Merrifield固相合成法，其中将氨基酸序贯添加到延长中的氨基酸链上。参见Merrif ield，J. Am. Chem. Soc. 85 :2149-2146 (1963)。 用于自动合成多肽的仪器市售自供应商例如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA)，并可按照生产商的说明书进行操作。在某些具体的实施方案中，多肽可以是包含如本文所述的多种多肽的融合蛋白，或者是包含如本文所述的至少一种多肽和无关序列的融合蛋白，所述蛋白的实例包括破伤风蛋白、结核病蛋白和肝炎蛋白(参见，例如Moute等.，New Engl. J. Med. 336 86-91(1997))。融合配偶体可例如有助于提供T辅助细胞表位(免疫融合配偶体)、优选由人识别的T辅助细胞表位，或者可有助于以高于天然重组蛋白的收率表达蛋白(表达增强子)。某些优选的融合配偶体既是免疫融合配偶体，也是表达增强型融合配偶体。可选择其它融合配偶体，以增加蛋白溶解度或者使蛋白能够靶向所需胞内区室。再一些融合配偶体包括便于蛋白纯化的亲和标记。通常可采用包括化学缀合在内的标准技术制备融合蛋白。优选在表达系统中以重组蛋白的形式表达融合蛋白，使得相对于非融合蛋白制备水平提高。简而言之，编码多肽组分的DNA序列可分别装配，然后连接到合适表达载体中。将编码一种多肽组分的DNA序列的3’端，通过或不通过肽接头，与编码第二种多肽组分的DNA序列的5’端连接，使得该序列的读框相同(in phase) 0这允许翻译成保留两种组成多肽的生物活性的单一融合蛋白。可使用肽接头序列以将第一和第二多肽组分间隔至足以保证每种多肽折叠成其二级和三级结构的间距。使用本领域众所周知的标准技术将这类肽接头序列掺入到融合蛋白中。可根据以下因素选择合适的肽接头序列(1)其能够采用柔性延伸构象；( 其不能采用会与第一和第二多肽功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可与多肽功能性表位反应的疏水性或带电荷残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它接近中性氨基酸(例如Thr和Ala)也可用于接头序列。可有用地用作接头的氨基酸序列包括以下文献中公开的序列Maratea 等，Gene 40 :39-46(1985) ；Murphy 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83 :8258-8262(1986)；美国专利号 4，935，233 和美国专利号 4，751，180。接头序列的长度通常可为1个至约50个氨基酸。当第一和第二多肽具有可用于间隔开功能性结构域和防止位阻的非必需N-端氨基酸区时，则无需接头序列。在优选实施方案中，免疫融合配偶体来源于蛋白D，一种革兰氏阴性菌嗜血流感杆菌B (HaemophiIus influenza B)的表面蛋白(W0 91/18926) 优选蛋白D衍生物包含该蛋白的约前三分之一(例如N-端的前100-110个氨基酸)，并且蛋白D衍生物可被脂质化。 在某些优选实施方案中，将脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包含在N-端，以给多肽提供额外的外源T细胞表位和提高在大肠杆菌中的表达水平(因此起表达增强子的作用)。 脂质尾部确保将抗原最佳呈递给抗原呈递细胞。其它融合配偶体包括来自流感病毒的非结构蛋白NSl (血凝素)。通常使用N-端81个氨基酸，但也可使用包含T辅助细胞表位的不同片段。在另一个实施方案中，免疫融合配偶体是称为LYTA的蛋白或其部分(优选C端部分)。LYTA来自肺炎链球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)，其合成称为酰胺酶LYTA的 N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；Gene 43 :265-292 (1986))。LYTA是一种特异性降解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LYTA蛋白C端结构域负责对胆碱或某些胆碱类似物例如DEAE的亲和力。该特性已经用于开发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA 表达质粒。已描述在氨基端含有C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化(参见Biotechnology 10: 795-798(1992))。在一个优选的实施方案中，可将LYTA的重复部分掺入到融合蛋白中。在 C端区自残基178开始发现重复部分。特别优选的重复部分包括残基188-305。T 细胞免疫治疗组合物可另外或备选地包含对分枝杆菌抗原具有特异性的T细胞。通常可用标准方法在体外或离体制备这类细胞。例如，可使用市售细胞分离系统(例如Isolex System，得自 Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA ；另见美国专利号 5，240，856 ；美国专利号 5，215，926 ；WO 89/06280 ；WO 91/16116 和 WO 92/07243)，从患者的骨髓、外周血或者骨髓或外周血部分中分离出T细胞。或者，T细胞可来源于相关或无关的人、非人类哺乳动物、细胞系或培养物。可用本发明多肽、编码所述多肽的多核苷酸、和/或表达所述多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。在足以允许产生对多肽具有特异性的T细胞的条件下和时间内进行这样的刺激。优选多肽或多核苷酸存在于递送载体(例如微球体)中，以促进产生特异性 T细胞。如果T细胞特异性增殖、分泌细胞因子或杀伤用本发明多肽包被或表达本发明多肽编码基因的靶细胞，则认为所述T细胞对所述多肽具有特异性。可采用任何标准技术来评价T细胞特异性。例如，在铬释放测定或增殖测定中，与阴性对照相比，在溶解和/或增殖上刺激指数增加超过两倍，表明T细胞特异性。可例如如以下文献中所述进行这些测定 Chen等，Cancer Res. M 1065-1070 (1994)。或者，可通过各种已知技术进行T细胞增殖的测定。例如，可通过测定DNA合成的速率增加来检测T细胞增殖(例如通过用氚化胸苷脉冲标记T细胞培养物并测定掺入DNA的氚化胸苷的量)。与本发明多肽(lOOng/ml-lOO μ g/ ml、优选200ng/ml-25 μ g/ml)接触3_7天，应导致T细胞增殖增加至少两倍。如标准细胞因子测定法所测，如上所述接触2-3小时应导致T细胞活化，所述测定法中细胞因子(例如 TNF或IFN-γ)释放水平提高两倍，指示T细胞活化(参见Co Iigan等，Current Protocols in Immunology，第1卷(1998))。响应多肽、多核苷酸或表达多肽的APC而活化的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。用标准技术可扩繁蛋白特异性T细胞。在优选的实施方案中，T细胞来源于患者、相关供体或无关供体，并且在刺激和扩繁后给予患者。为了治疗目的，可在体外或体内大量增殖响应多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+ 或CD8+T细胞。可以不同方式进行这类T细胞的体外增殖。例如，可在添加或不添加T细胞生长因子(例如白介素- 和/或合成多肽的刺激细胞下，使T细胞重新暴露至多肽或对应于该多肽的免疫原性部分的短肽。或者，可通过克隆，大量扩繁在蛋白存在时增殖的一种或多种T细胞。用于克隆细胞的方法为本领域所熟知并包括有限稀释。药物组合物在另外的实施方案中，将本文公开的多核苷酸、多肽、T细胞和/或抗体组合物配制成药学上可接受或药理学上可接受的溶液剂，用于单独或者与一种或多种其它治疗形式联合给予细胞或动物。还应理解的是，如果需要的话，也可将表达本文所公开多肽的核酸区段(例如RNA 或DNA)与其它作用剂(agent)联合给予，所述其它作用剂为例如其它蛋白或多肽或各种药学活性剂(包括有效抗结核分枝杆菌感染的化疗药)。事实上，对于也可包括在内的其它组分几乎没有限制，只要另外的作用剂在与靶细胞或宿主组织接触时不会引起明显不良作用即可。因此，在具体情况下，可视需要将组合物与各种其它作用剂一起递送。可将这类组合物从宿主细胞或其它生物来源中纯化出来，或者可如本文所述化学合成这类组合物。同样， 这类组合物还可包括取代或衍生的RNA或DNA组合物。药学上可接受的赋形剂和载体溶液剂的配制为本领域技术人员所熟知，其视合适的给药和治疗方案的开发而定，所述方案针对将本文所述的具体组合物用于各种治疗方案中，包括例如口服、胃肠外、静脉内、鼻内和肌内给药和制剂。其它给药途径包括经由粘膜表通常，包含治疗有效量的制剂每次给药递送约0. Iug至约IOOOug多肽，更通常每次给药递送约2. 5ug至约IOOug多肽。对于多核苷酸组合物而言，这些制剂通常每次给药递送约IOug至约20mg本发明多核苷酸，更通常每次给药递送约0. Img至约IOmg本发明多核苷酸。无疑，各种治疗有用组合物中活性化合物的量可按以下方式制备合适的剂量包含在任何既定单位剂量的化合物中。诸如溶解度、生物利用度、生物半寿期、给药途径、产品保存期以及其它药理学考虑等因素由制备这类药物制剂领域的技术人员考虑，因而多种剂量和治疗方案都可为理想的。1. 口 服递送在某些应用中，本文所公开的药物组合物可经口服递送至动物。因而，这些组合物可与惰性稀释剂或可同化的可食用载体配制在一起，或者可将它们包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可将它们压制成片剂，或者可将它们直接与食物结合。活性化合物还可与赋形剂结合，并以可吸收片剂、口含片剂、锭剂、胶囊剂、酏齐U、 混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用(Mathiowitz等，1997 ；Hwang等，1998 ；美国专利5，641，515 ；美国专利5，580，579和美国专利5，792，451，所述文献各自通过引用以其整体结合到本文中)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等也可含有以下成分粘合剂，如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂(例如可添加蔗糖、乳糖或糖精)或者矫味剂(例如薄荷、冬青油或樱桃香料)。当剂量单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的材料之外，其还可含有液体载体。可存在各种其它材料，作为包衣或以另外改变剂量单位的物理形式。例如， 片剂、丸剂或胶囊剂可用虫胶、糖或两者同时来包衣。酏剂糖浆可含有活性组分、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染色剂和矫味剂，例如樱桃或橘子香料。当然用于制备任何剂量单位形式的任何材料都应该是药物纯的且在所采用的量下基本无毒。另外，活性组分可掺入缓释制品和制剂中。为了口服，本发明组合物备选地可与一种或多种赋形剂以以下形式结合漱口剂、 洁齿剂、口含片剂、口腔喷雾剂或舌下口服制剂。例如，可将所需量的活性成分掺入到合适溶剂(例如硼酸钠溶液(DobelUf))中，制备漱口剂。或者，可将活性成分掺入到口服溶液剂(例如含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液剂)或分散到洁齿剂中，或者以治疗有效量添加到以下组合物中所述组合物可包含水、粘合剂、研磨剂、矫味剂、发泡剂和保湿剂。或者， 可将组合物制成可置于舌下或在口腔内溶解的片剂或溶液剂形式。2.注射递送在某些情况下，理想的是经胃肠外、静脉内、肌内、皮内或甚至腹膜内递送本文所公开的药物组合物，如美国专利5，543，158、美国专利5，641，515和美国专利5，399，363中所述(所述各种文献通过引用以其整体结合到本文中)。可在适当混有表面活性剂(例如羟丙基纤维素)的水中制备活性化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液剂。也可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物和油中制备分散剂。在普通贮藏和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。适于注射用的药物形式包括无菌水溶液剂或分散剂以及用于临用时配制无菌注射溶液剂或分散剂的无菌粉末(美国专利5，466，468，通过引用以其整体具体结合到本文中)。在所有情况下，所述形式都必须无菌且必须在流动性上达到容易注射 (syringability)的程度。其在制备和贮藏条件下必须稳定，而且必须以防止诸如细菌和真菌等微生物的污染作用的方式贮存。载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其适当的混合物、和/或植物油。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过保持所需粒度(在分散剂的情况下)以及通过使用表面活性剂，维持适当流动性。可通过各种抗菌药和抗真菌剂促进对微生物作用的预防，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)延迟对注射用组合物的吸收。对于在水溶液剂中胃肠外给予而言，例如必要时溶液剂应适当缓冲，并且液体稀释剂先用足够盐水或葡萄糖赋予等渗性。这些特定水溶液剂尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给予。就此而论，根据本公开内容，可使用的无菌含水介质为本领域技术人员所知。例如，可将一个剂量溶于Iml等渗NaCl溶液中，然后加入到IOOOml皮下灌注液中或者注射在预定输注部位(参见例如Remington' s Pharmaceutical Sciences，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据所治疗患者的状况，需要对剂量作出某些改动。负责给药的人员会在任何情况下确定个体受试者的合适剂量。此外，对于人类给药而言，制剂应当满足FDA生物制品部门标准所要求的无菌、热源性以及总体安全性和纯度标准。可按照需要，将所需量的活性化合物掺入具有上文列举的各种其它成分的合适溶剂中，接着过滤除菌，制备无菌注射用溶液剂。通常，通过将各种灭过菌的活性成分掺入到含有基础分散介质和上述其它所需成分的无菌溶媒中，制备分散剂。在用于制备无菌注射用溶液剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从其先前的无菌过滤溶液中得到活性成分和任何其它所需成分的粉末。本文所公开的组合物可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐，包括酸加成盐 (与蛋白的游离氨基生成的)和与无机酸(例如盐酸或磷酸)生成的盐，或者与有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)生成的盐。与游离羧基生成的盐也可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、 组氨酸、普鲁卡因等)。在配制后，就以剂量制剂相容的方式和以治疗有效量给予溶液剂。 容易以各种剂型给予制剂，所述剂型为例如注射用溶液剂、药物释放胶囊剂等。本文所用的“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、赋形剂(溶媒)、包衣剂、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液剂、混悬剂、胶体等。这些介质和作用剂在药物活性物质中的应用为本领域所熟知。除非任何常规介质或作用剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗性组合物中的应用。辅助活性成分也可掺入组合物中。措词“药学上可接受的”是指当给予人时不会产生变态反应或类似不利反应的分子实体和组合物。本领域充分了解含作为活性成分的蛋白的含水组合物的制备。通常将这类组合物制备成注射用液体溶液剂或混悬剂；也可制备成在注射前适于溶解或悬浮于液体中的固体形式。也可使制剂乳化。3.鼻腔和口腔递送在某些实施方案中，可通过鼻内喷雾、口腔喷雾、吸入和/或其它气雾剂递送载体而给予药物组合物。用于将基因、核酸和肽组合物直接递送至肺部的方法(例如通过鼻腔和口腔喷雾剂)已描述于例如美国专利5，756，353和美国专利5，804，212 (所述各文献通过引用以其整体结合到本文中)。同样，利用鼻内微粒树脂(Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利5，725，871，通过引用以其整体明确结合到本文中)递送药物，也为药学领域所熟知。同样，以聚四氟乙烯(polytetrafluoroetheylene)支持基料形式的跨粘膜给药描述于美国专利5，780’ 045(通过引用以其整体明确结合到本文中)。4.脂质体、纳米囊和微粒介导的递送在某些实施方案中，本发明人考虑了脂质体、纳米囊、微粒、微球体、脂质粒、囊泡等在用于将本发明组合物导入合适宿主细胞中的用途。具体地讲，可将本发明组合物配制用于包囊于脂质粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米粒等中递送。可优选这样的制剂用于引入本文所公开的核酸或构建体的药学上可接受制剂。 脂质体的形成和使用是本领域技术人员公知的(参见例如Couvreur等，1977 ；Couvreur, 1988 ；Lasic, 1998 ；所述文献描述了在针对胞内细菌感染和疾病的靶向抗生素治疗中脂质体和纳米囊的用途)。近来，开发出具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体 (Gabizon 和 Papahadjopoulos，1988 ；Alien 和 Choun, 1987 ；美国专利 5，741，516，所述文献通过引用以其整体明确结合到本文中)。此外，有关脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的各种方法已有综述(Takakura，1998 ；Chandran等，1997 ；Margalit, 1995 ；美国专利5，567，434 ；美国专利5，552，157 ；美国专利5，565,213 ；美国专利5，738，868和美国专利 5，795，587，所述各文献通过引用以其整体明确结合到本文中)。脂质体已成功用于通常难以通过其它方法进行转染的大量细胞类型，包括T细胞悬物、原代肝细胞培养物和PC 12细胞(Renneisen等，1990 ;Muller等，1990)。另外， 脂质体无DNA长度限制，而这通常在基于病毒的递送系统中会受到限制。脂质体已有效用于将基因、药物(Heath 和 Martin，1986 ；Heath 等，1986 ；Balazsovits 等，1989 ；Fresta 和 Puglisi，1996)、放射性治疗剂(Pikul 等，1987)、酶(Imaizumi 等，1990a ；Imaizumi 等， 1990b)、病毒(Faller 和 Baltimore，1984)、转录因子和别构剂(Nicolau 和 Gersonde, 1979)导入各种培养细胞系和动物体内。另外，已经完成了检查脂质体介导药物递送的有效性的若干成功临床试验(Lopez-Berestein 等，1985a ； 1985b ；Coune, 1988 ；Sculier 等， 1988)。此外，一些研究表明，使用脂质体与系统给药后的自身免疫应答、毒性或生殖腺局限化(gonadal localization)无关(Mori 禾口 Fukatsu，1992)。脂质体由磷脂制成，磷脂分散在含水介质中并自发形成多层同心双层囊泡(亦称多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm至4μπι。超声处理MLV导致形成直径范围为 200-500人的小单层囊泡(suv)，其核心含有水溶液。脂质体与细胞膜有类似之处，并且考虑了将脂质体在本发明中用作肽组合物的载体。它们广泛适用，因为水溶性和脂溶性物质都可被捕获，即分别在含水空间和在双层本身之内。有可能的是，通过选择性修饰脂质体制剂，载药脂质体甚至可用于活性剂的位点特异性递送。除了 Couvreur等(1977 ；1988)的教导之外，以下信息可用于制备脂质体制剂。当分散在水中，磷脂可形成除脂质体之外的多种结构，这取决于脂质与水的摩尔比。在低比例时，脂质体是优选结构。脂质体的物理特性取决于ΡΗ、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可表现出对离子和极性物质的低通透性，但是在高温下经历明显改变其通透性的相变。 相变包括从密集的有序结构(称为凝胶态)转变为松散堆积的较无序结构(称为流态)。 这在特征性相变温度下发生，导致对离子、糖和药物的通透性增加。除了温度之外，暴露至蛋白也可改变脂质体通透性。某些可溶性蛋白例如细胞色素c与双层结合，使之变形并穿透它，从而改变通透性。胆固醇抑制蛋白的这种穿透，显然是通过更紧密地堆积磷脂。考虑到用于抗生素和抑制剂递送的最有用脂质体构成物将包含胆固醇。不同类型的脂质体包封溶质的能力不同。例如，MLV在包封溶质方面是中等有效的，但SUV非常低效。然而，SUV具有尺寸分布的均一性和再现性的优点，而大单层囊泡 (LUV)提供了大小与包封效率间的折衷。通过醚蒸发制备它们，它们在溶质包封方面的效率是MLV的3-4倍。除了脂质体的特征之外，包封化合物的重要决定因素是所述化合物本身的理化性质。极性化合物包封于含水空间中，而非极性化合物与囊泡脂质双层结合。极性化合物通过渗透而释放或当双层破裂时释放，但非极性化合物仍然与双层结合，除非双层因温度或暴露至脂蛋白而瓦解。这两类都在相变温度下显示最大流出率。
脂质体通过四种不同机制与细胞相互作用通过网状内皮系统的吞噬细胞(例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)的胞吞作用；通过非特异性弱疏水力或静电力，或者通过与细胞表面组分的特异性相互作用，而吸附到细胞表面；通过将脂质体脂质双层插入到质膜中与细胞质膜融合，同时将脂质体内含物释放到细胞质内；和通过将脂质体脂质转移给细胞膜或亚细胞膜(或反之亦然)，而与脂质体内含物无任何关系。通常难以确定是何种机制起作用，而且可能不止一种机制同时起作用。静脉注射的脂质体的命运和分布取决于其物理性质，例如大小、流动性和表面电荷。它们可在组织中保持数小时或数天(取决于其组成)，而血液半寿期范围为数分钟至数小时。较大的脂质体例如MLV和LUV由网状内皮系统吞噬细胞快速接纳，但循环系统生理学在大多数部位都限制这类大物质的进出(exit)。它们仅可在毛细管内皮中存在大开口或孔隙的位置(例如肝或脾血窦)上进出。因此，这些器官是主要摄取部位。另一方面，SUV 显示更广泛的组织分布，但仍高度隔离在肝和脾中。一般而言，这样的体内行为将脂质体的潜在靶向作用限制于仅其大尺寸可接近的器官和组织。这些器官和组织包括血、肝、脾、骨髓和淋巴样器官。靶向通常不是本发明的限制。然而，需要特异性靶向的话，可获得用于达到该目的的方法。抗体可用于与脂质体表面结合并将抗体及其药物内含物导向位于特定细胞型表面的特异性抗原性受体。碳水化合物决定簇(在细胞-细胞识别、相互作用和粘附方面起作用的糖蛋白或糖脂细胞表面组分)也可用作识别位点，因为它们具有将脂质体导向特定细胞型的潜力。通常，考虑采用静脉内注射脂质体制剂，但是也可想到其它给药途径。或者，本发明提供本发明组合物的药学上可接受的纳米囊制剂。纳米囊通常可以稳定且可重现的方式包封化合物(Henry-Michelland等，1987 ；Quintanar-Guerrero等， 1998 ；Douglas等，1987)。为了避免胞内聚合物过载的副作用，应当用体内能够降解的聚合物设计这类超细颗粒(大小约0. 1 μ m)。考虑了将满足这些要求的生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米粒用于本发明中。可容易制备这类颗粒，如(Couvreur等，1980 ； 1988 ;zur Muhlen 等，1998 ；Zambaux 等 1998 ；Pinto-Alphandry 等，1995 和美国专利 5，145，684，所述文献通过引用以其整体明确结合到本文中)所述。皮肤贴剂也可用于经皮递送。免疫原性组合物在本发明的某些优选实施方案中，提供免疫原性组合物。免疫原性组合物通常包含与免疫刺激剂联用的一种或多种多肽或多核苷酸，例如上文所论述的多肽或多核苷酸。免疫刺激剂可为提高或增强对外源抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的实例包括佐剂、生物可降解微球体(例如丙交酯乙交酯共聚物 (polylactic galactide))和脂质体(其中掺入了化合物；参见，例如Fullerton，美国专利号 4，235,877)。制备免疫原性组合物的一般性描述参见例如Powell和Newman，编著，Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach (亚单位和佐剂方法))(1995)。本发明范围内的药物组合物和免疫原性组合物也可包含其它化合物，其可为生物活性的或非活性的。 例如，在药物组合物或免疫原性组合物之内，可存在其它结核分枝杆菌抗原的一个或多个免疫原性部分(掺入到融合多肽中或作为单独化合物)。
阐述性的免疫原性组合物可包含编码一种或多种上述多肽的多核苷酸(例如 DNA)，使得所述多肽原位产生(因而引起免疫应答)。如上所述，DNA可存在于任何本领域普通技术人员已知的各种递送系统中，所述递送系统包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。许多基因递送技术为本领域所熟知，例如Rolland，Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15 :143-198 (199 及其中所引参考文献所述的技术。合适的核酸表达系统包含在患者中表达所需的DNA序列(例如合适的启动子和终止信号)。细菌递送系统包括给予表达多肽(例如在其细胞表面或分泌多肽)的细菌宿主细胞(例如分枝杆菌、芽胞杆菌或乳酸杆菌(Lactobacillus)菌株，包括卡介苗或乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis))(参见， 例如Ferreira，等·，An Acad Bras Cienc Q005) 77 :113-124 ；和 Raha，等，Appl Microbiol Biotechnol (2005)PubMedID 15635459)。在一个优选的实施方案中，可使用病毒表达系统 (例如痘苗病毒或其它痘病毒、反转录病毒或腺病毒)将DNA引入，所述系统包括使用非病原性(缺陷型)、能复制的病毒。合适的系统公开于例如Fisher-Hoch等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :317-321 (1989) ；Flexner.，Ann. N. Y. Acad. Sci. 569 :86-103 (1989)； Flexner 等，Vaccine 8 :17-21 (1990)；美国专利号 4，603，112,4, 769，330 和 5，017，487 ；WO 89/01973 ；美国专利号 4，777，127 ；GB 2，200，651 ；EP 0，345，242 ；WO 91/02805 ；Berkner, Biotechniques 6:616-627(1988) ；Rosenfeld 等，Science 252:431-434(1991) ；Kolls 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :215-219 (1994) ；Kass-Eisler 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :11498-11502(1993) ；Guzman 等，Circulation 88 :2838-2848(1993)；和 Guzman 等，Cir. Res. 73 :1202-1207(1993)。用于将DNA掺入这类表达系统的技术为本领域普通技术人员所熟知。DNA也可为“裸的”，如例如Ulmer等，Science 259:1745-1749(1993)所述和由CohenJcience 259:1691-1692(1993)综述。可通过将DNA包被至生物可降解的珠粒上来增加裸DNA的摄取，所述珠粒被有效地转移至细胞内。显而易见的是，免疫原性组合物可包含多核苷酸和多肽组分两者。这类免疫原性组合物可提供增强的免疫应答。显而易见的是，免疫原性组合物可包含本文所提供多核苷酸和多肽的药学上可接受的盐。这类盐可制备自药学上可接受的无毒性的碱，包括有机碱(例如伯、仲和叔胺以及碱性氨基酸的盐)和无机碱(例如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐)。尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体都可用于本发明的免疫原性组合物中，但是载体类型因给药模式而异。可将本发明组合物配制用于任何合适的给药方式， 包括例如局部、口服、鼻内、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内给药。对于胃肠外给药例如皮下注射，载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服给药，可使用任何上述载体或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解微球体(例如聚乳酸酯(polylactate)聚乙醇酸酯(polyglycolate)) 也可用作本发明药物组合物的载体。合适的生物可降解微球体公开于例如美国专利号 4，897，268,5, 075，109,5, 928，647,5, 811，128,5, 820，883,5, 853，763,5, 814，344 和 5，942，252。也可以使用包含如美国专利号5，928，647所述的微粒_蛋白复合物的载体，该复合物能够在宿主中诱导I类-限制性细胞毒T淋巴细胞应答。这类组合物也可包含缓冲液(例如中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸(例如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)、赋予制剂与受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、助悬剂、增稠剂和/或防腐剂。或者，本发明组合物可配制成冻干物。也可以使用众所周知的技术，将化合物包封在脂质体中。任何各种免疫刺激剂都可用于本发明免疫原性组合物中。例如，可包含佐剂。大多数佐剂含有设计用于保护抗原不被快速代谢的物质(例如氢氧化铝或矿物油)以及免疫应答刺激剂(例如脂质A、百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)蛋白或分枝杆菌蛋白或分枝杆菌衍生蛋白)。例如，可使用脱脂质化、脱糖脂化母牛分枝杆菌(“pVac”)。合适佐剂是市售的，例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,MI)； Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc. , Rahway, NJ) ；AS01B、AS02A、AS15、AS_2 及其衍生物(GlaxoSmithKline，Philadelphia，PA) ；CWS(来自结核杆菌的细胞壁骨架)、TDM(海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))、Leif (利什曼虫延伸起始因子)、铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性混悬剂；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰脂质A(MPL )；和 quil A(例如QS-21)。细胞因子(例如GM-CSF或白介素_2、白介素_7或白介素-12)也都可用作佐剂。佐剂是指在疫苗或治疗性组合物中增加对抗原的特异性免疫应答的组分(参见例如 Edelman，AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411(1992))。佐剂诱导 Thl 型和 Th2 型反应的免疫应答。Thl型细胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)倾向于诱导细胞介导的针对所给予抗原的免疫应答，而 ι-2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10)倾向于诱导体液免疫应答。能够优先刺激Th-I细胞介导免疫应答的佐剂描述于WO 94/00153和 WO 95/17209。在本文所提供的免疫原性组合物中，优选设计佐剂组合物，以诱导以Thl型为主的免疫应答。在施加本文所提供的免疫原性组合物之后，患者通常会产生包括Thl型和Th2 型反应在内的免疫应答。在反应主要为Thl型的一个优选实施方案中，Thl型细胞因子的水平将增加到比Th2型细胞因子水平更高的程度。使用标准测定，可容易评价这些细胞因子的水平。有关细胞因子家族的综述参见Janeway等，Immunobiology，第5版，2001。
Rv3616c组合物通常包含一种或多种佐剂，例如ASOIB (含3_脱_0_酰化单磷酰脂质A(3D-MPL, )和QS21的脂质体制剂；参见美国专利公开号2003/0143240)； AS02A (3D-MPL 和 QS21 和水包油乳剂；参见 Bojang 等，Lancet (2001) 358 :1927)； ENHANZYN (§) (Detox) ；3D-MPL ;皂苷(包括Quil A及其组分例如QS21)和皂苷模拟物； CWS(来自结核杆菌的细胞壁骨架)；TDM(海藻糖二霉菌酸酯)；氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)；免疫刺激性的寡核苷酸例如CPG ;Leif (利什曼虫延伸起始因子)；及其衍生物。在一个优选的实施方案中，将Rv3616c多肽与一种或多种选自以下的佐剂一起给予含 3D-MPL 和QS21的脂质体制剂(例如ASO1B)以及3D-MPL 和QS21和水包油乳剂(例如 AS02A)。佐剂系统 AS01B 和 AS02A 进一步描述于 Pichyangkul，等，Vaccine (2004) 22 3831-40。当递送作为核酸的Rv3616c抗原时，其可在例如病毒载体(即腺病毒载体)或突变细菌宿主细胞(即突变的无毒分枝杆菌、乳酸杆菌或芽孢杆菌宿主细胞，包括卡介苗 (BCG)和乳酸乳球菌)中递送。用于诱导占优势的Thl型反应的优选佐剂包括例如单磷酰脂质A(MPL )(优选3-0-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL ))任选与铝盐的组合(参见例如Ribi等，1986， Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins (ΜΜΡ^ΜΜ ^^&'Ψ 和免疫药理学),Plenum Publ. Corp.，NY，第 407-419 页；GB 2122204B ；GB 2220211 ；和 US 4，912，094)。3D-MPL 的优选形式是含有直径小于0. 2mm的小粒度乳剂形式，其制备方法公开于WO 94/21292.含有单磷酰脂质A和表面活性剂的含水制剂已描述于WO 98/43670。 例示性的优选佐剂包括ASOlB (含MPL⑧和QS21的脂质体制剂)、含3D-MPL⑧和QS21的脂质体制剂、AS02A(MPL 和QS21和水包油乳剂)、3D_MPL 和QS21和水包油乳剂、以及 AS15(得自 GlaxoSmithKline)。MPL 佐剂得自 GlaxoSmithKline (参见美国专利号 4，436，727 ；4，877，611 ；4，866，034 和 4，912，094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG 二核苷酸未甲基化)也诱导占优势的Thl反应。CpG是DNA中存在的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。这样的寡核苷酸是众所周知的，描述于例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利号6，008，200和5，856，462。免疫刺激性DNA序列也描述于例如&ito等，Science 273:352(1996)。当CpG配制在免疫原性组合物中时，CpG通常以游离溶液与游离抗原一起给予(W0 96/02555 ；McCluskie和 Davis，见上文)或者与抗原共价缀合(W0 98/16247)，或者与载体例如氢氧化铝配制在一起((肝炎表面抗原)Davis 等，见上文；Brazolot-Millan 等，Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1998,95(26)，15553-8)。本领域已知CpG作为佐剂，既可经系统途径给予也可经粘膜途径给予(W0 96/02555,EP 468520、Davis 等，J. Immunol, 1998,160(2) :870-876 ；McCluskie 和 Davis, J. Immunol.，1998，161(9) :4463-6)。另一种优选的佐剂是皂苷或皂苷模拟物或衍生物，例如Quil A、优选QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc. , Framingham，ΜΑ)，其可单独使用或者与其它佐剂联用。例如， 一个增强的系统包括单磷酰脂质A(MPL )与皂苷衍生物的组合，例如如WO 94/00153所述的QS21与3D-MPL 的组合，或者如WO 96/33739所述的其中QS21被胆固醇猝灭的较低反应原性组合物。其它优选制剂包括水包油乳剂和生育酚。包含含QS21、3D-MPL 和生育酚的水包油乳剂的特别有效的佐剂制剂描述于WO 95/17210。其它用于本发明的皂苷佐剂包括QS7(描述于WO 96/33739和WO 96/11711)和QS17 (描述于美国专利号5，057，540和 EP O 362 279B1)。或者皂苷制剂可与以下物质组合由壳聚糖或其它聚阳离子聚合物构成的疫苗载体、聚丙交酯和丙交酯-乙交酯共聚物颗粒、基于聚-N-乙酰基葡糖胺的聚合物基质、由多糖或化学改性多糖构成的颗粒、脂质体和基于脂质的颗粒、由单甘油酯组成的颗粒等。也可在胆固醇存在下配制皂苷，以形成粒状结构例如脂质体或ISCOM 。此外，皂苷可与聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯一起配制成非粒状溶液或悬浮液，或者配制成粒状结构例如寡层薄膜 (paucilameIar)脂质体或ISCOM 。皂苷也可与赋形剂例如CARB0P0L —起配制以增加粘度，或者可用粉状赋形剂例如乳糖配制成干粉形式。在一个实施方案中，佐剂系统包含单磷酰脂质A与皂苷衍生物的组合，例如如WO 94/00153所述的QS21与3D-MPL 佐剂的组合，或者如WO 96/33739所述的其中QS21被含胆固醇的脂质体猝灭的较低反应原性组合物。其它合适的制剂包括水包油乳剂和生育酚。采用含QS21、3D-MPL 佐剂和生育酚的水包油乳剂的另一种合适佐剂制剂描述于WO 95/17210。
另一种增强的佐剂系统包括含CpG的寡核苷酸与皂苷衍生物的组合、尤其是CpG 与QS21的组合，参见WO 00/09159。合适的是，所述制剂另外包含水包油乳剂和生育酚。其它合适佐剂包括MONTANIDE ISA 720(Seppic, France)、SAF(Chiron, California, United Mates)、ISCOMS (CSL)、MF_59 (Chiron)、SBAS系列佐剂(SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium)、Detox (Corixa)、RC-529 (Corixa)禾口其它氨基烧基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)，例如描述于在审的美国专利申请顺序号08/853，826和09/074，720 的佐剂(所述文献的公开内容都通过引用以其整体结合到本文中)，以及聚氧乙烯醚佐剂例如 WO 99/52549A1 中所述的佐剂。SmithKline Beecham 和 Corixa Corporation 现为 GlaxoSmithKline 的一部分。其它合适的佐剂包括以下通式(I)的佐剂分子HO (CH2CH2O)n-A-R其中η为1-50，A为化学键或_C(0)_，R为C1,烷基或苯基C1^烷基。另一种引人关注的佐剂为例如如W02005/112991所述的志贺毒素b链。本发明的一个实施方案由包含通式(I)的聚氧乙烯醚的免疫原性组合物构成，其中η为1-50、优选4-Μ、最优选9 ；R组分为CV5tl、优选C4-C2tl烷基和最优选C12烷基，而A为键。聚氧乙烯醚的浓度应在0. 1-20%、优选0. 1-10%和最优选0. 1-1%的范围内。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-9-硬脂酰(steoryl)醚、聚氧乙烯_8_硬脂酰(steoryl)醚、聚氧乙烯_4_月桂醚、聚氧乙烯_35_月桂醚和聚氧乙烯_23_月桂醚。 聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯月桂醚描述于Merck索引(第12版条目7717)。这些佐剂分子描述于 WO 99/52549。本文提供的任何免疫原性组合物可使用以下熟知方法制备，所述方法导致形成抗原、免疫应答增强剂和合适载体或赋形剂的组合。可作为缓释制剂(即在给药后实现化合物的缓慢释放的诸如胶囊剂、海绵剂或凝胶剂(例如由多糖组成)等制剂)的部分给予本文所述的组合物。这样的制剂通常可用众所周知的技术来制备(参见例如Coombes等， Vaccine 14 :1429-1438(1996))并通过例如口服、直肠或皮下植入而给予，或通过在所需靶部位植入而给予。缓释制剂可含有分散在载体基质中和/或包含在被速率控制膜包裹的贮库之内的多肽、多核苷酸或抗体。用于这类制剂的载体是生物相容的并且还可是生物可降解的；优选所述制剂提供相对恒定的活性组分释放水平。这类载体包括丙交酯-乙交酯共聚物、聚丙烯酸酯、乳胶、 淀粉、纤维素、葡聚糖等的微粒。其它延迟释放载体包括超分子生物载体，其包括非液态的亲水核(例如交联多糖或寡糖)以及任选的包含两亲化合物例如磷脂的外层(参见例如美国专利号 5，151，2 和 PCT 申请 WO 94/20078、WO 94/23701 和 WO 96/06638)。缓释制剂中活性化合物含量取决于植入部位，释放速率和预期持续时间。任何递送载体都可用于药物组合物和免疫原性组合物，以促进产生抗原特异性免疫应答。递送载体包括抗原呈递细胞(APC)，例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和可改造成有效APC的其它细胞。这些细胞可(但非必需)经遗传修饰，以增加呈递抗原的容量、改善T细胞应答的激活和/或维持、和/或与受体免疫学上相容(即匹配的HLA单元型)。APC通常可从任何生物液体和器官中分离出，并且可为自体细胞、同种异体细胞、同源细胞或异种细胞。
本发明的某些优选实施方案使用树突细胞或其祖细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是高度有效的 APC(Banchereau 和 Meinman，Nature 392 :245-251 (1998))，并且已表明有效作为用于引起预防性或治疗性免疫的生理佐剂(参见Timmerman和LeVy，Arm. Rev. Med. 50 :507-529 (1999))。一般而言，可根据树突细胞的典型形状(在原位星形，在体外可见明显胞质突(树突))，其高效摄取、加工和呈递抗原的能力以及其激活幼稚T细胞应答的能力，来鉴定树突细胞。当然，树突细胞可经改造以表达在体内或离体的树突细胞上不常见的特异性细胞表面受体或配体，而且本发明也考虑了这种经修饰的树突细胞。作为树突细胞的替代物，装载分泌型囊泡抗原的树突细胞(称为外来体)可用于免疫原性组合物中 (参见 Zitvogel 等，Nature Med. 4 :594-600 (1998))。树突细胞及其祖细胞可得自外周血、骨髓、淋巴结、脾、皮肤、脐带血或任何其它合适组织或液体。例如，可通过将诸如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNF α等细胞因子的组合添加到从外周血中收获的单核细胞培养物中，使树突细胞离体分化。或者，可通过将GM-CSF、 IL-3、TNFa、⑶40配体、LPS、flt3配体和/或诱导树突细胞分化、成熟和增殖的其它化合物的组合添加到培养基中，使从外周血、脐带血或骨髓中收获的CD34阳性细胞分化成树突细胞。树突细胞容易分类为“未成熟”和“成熟”细胞，这允许用简单方法区分两种充分表征的表型。然而，这样的命名不应理解为排除所有可能的分化中间阶段。未成熟树突细胞表征为具有高抗原摄取和加工能力的APC，这与Fc γ受体和甘露糖受体的高度表达相关。 成熟表型的典型特征在于这些标记的较低表达，但高度表达负责T细胞激活的细胞表面分子，例如I类和II类MHC、粘附分子(例如⑶讨和⑶11)和共刺激分子(例如⑶40、⑶80、 CD86 和 4-1BB)。通常可用编码蛋白(或其部分或其它变体)的多核苷酸转染APC，使得多肽在细胞表面上表达。这类转染可离体发生，然后可如本文所述使用包含这类转染细胞的药物组合物或免疫原性组合物。或者，可将靶向树突细胞或其它抗原呈递细胞的基因递送载体给予患者，导致在体内发生转染。例如，通常可使用本领域已知的任何方法，进行树突细胞的体内和离体转染，所述方法为例如WO 97/24447所述的方法或基因枪方法，参见Mahvi等， Immunology and Cell Biology 75:456-460(1997)。可通过将树突细胞或祖细胞与多肽、 DNA(裸的或在质粒载体内)或RNA —起孵育；或者与表达抗原的重组细菌或病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒载体)一起孵育，来给树突细胞加载抗原。加载之前，可将多肽与提供T细胞辅助的免疫配偶体(例如载体分子)共价缀合。或者，可用未缀合的免疫配偶体，单独、或在多肽存在下脉冲刺激树突细胞。免疫原性组合物和药物组合物可存在于单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿或小瓶)中。这样的容器优选是气密性的，以保持制剂的无菌性，直至使用。一般而言，制剂可在油性或水性溶媒中以混悬剂、溶液剂或乳剂贮存。或者，免疫原性组合物或药物组合物可贮存在临用前仅需加入无菌液体载体的冻干条件下。在某些实施方案中，在Rv3616c多肽(包括变体、免疫原性片段或融合蛋白)或编码所述多肽的多核苷酸的“初免”或首次给药之后，接着Rv3616c多肽(包括变体、免疫原性片段或融合蛋白)或编码所述多肽的多核苷酸的一次或多次“加强”或后续给药(“初免和加强”方法)。例如，首次给予Rv3616c多肽(包括变体、免疫原性片段或融合蛋白)或编码所述多肽的多核苷酸之后，接着进行一次或多次后续给予Rv3616c多肽(包括变体、免疫原性片段或融合蛋白)或编码所述多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，首次给予Rv3616c多肽或多核苷酸之后，接着一次或多次后续给予Rv3616c多肽。在一个实施方案中，首次给予Rv3616c多肽或多核苷酸之后，接着一次或多次后续给予Rv3616c多核苷酸。通常首次或“初免”给药与第二次或“加强”给药之间间隔约2-12周，或多达4-6个月。后续“加强”给药间隔约6个月或长达1、2、3、4或5 年。常规加强治疗(例如在蛋白初免给药之后接着蛋白加强给药)也可用于预防或治疗结核病(例如预防或治疗潜伏性结核病，尤其是预防或延迟结核病再活化)。抗体“抗体”是指特异性结合并识别抗原的包含免疫球蛋白基因框架区的多肽或其片段。公知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε*μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为Y、μ、α、δ或ε，它们继而又限定免疫球蛋白类别分别为IgG, IgM, IgA、IgD和IgE0例示性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对都具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。各链的 N-端限定约100-110个或更多个氨基酸的可变区，主要担负抗原识别。术语可变轻链和可变重链(Vh)分别是指这些轻链和重链。抗体例如以完整免疫球蛋白形式或以用不同肽酶消化而产生的许多充分表征的片段形式存在。因此，例如胃蛋白酶在铰链区二硫键下消化抗体，产生F(ab)' 2,F(ab)' 2 是Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键与Vh-ChI连接在一起的轻链。在温和条件下可将F(ab)' 2还原，以打断铰链区的二硫键，从而将F(ab)' 2 二聚体转化成Fab'单体。 Fab'单体本质上是带有铰链区部分的Fab (参见Fundamental Immunology (Paul编著， 第3版，1993)。尽管根据完整抗体的消化来定义不同抗体片段，但是技术人员应认识到这些片段可通过化学法或通过使用重组DNA方法来从头合成。因此，本文所用的术语抗体也包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段，或用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如单链Fv)或用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见例如McCafferty等，Nature 348 552-554(1990))ο为了制备单克隆或多克隆抗体，可采用本领域已知的任何技术(参见例如Kohler 和 Milstein，Nature 256:495-497(1975) ；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983)； Cole 等，载于 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第 77—96 页(1985))。用于产生单链抗体的技术(美国专利4，946，778)可适用于产生针对本发明多肽的抗体。另外， 转基因小鼠或其它生物体例如其它哺乳动物也可用于表达人源化抗体。或者，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异聚Fab片段(参见例如McCafTerty等， Nature 348:552-554(1990) ；Marks 等，Biotechnology 10:779-783(1992))。措词“特异性(或选择性)结合”抗体或“与…特异性(或选择性)免疫反应” 当提及蛋白或肽时，是指确定在蛋白和其它生物制品的异质群体中蛋白存在情况的结合反应。因此，在指定免疫测定条件下，特异抗体以背景的至少两倍与特定蛋白结合，而且基本上不与样品中存在的其它蛋白大量结合。在这类条件下与抗体的特异性结合可能需要根据其对特定蛋白的特异性而选择的抗体。例如，可选择针对融合蛋白产生的多克隆抗体，以获取仅与融合蛋白发生特异性免疫反应、而不与融合蛋白各个组分发生特异性免疫反应的多克隆抗体。可通过去掉与各个抗原交叉反应的抗体，来完成这样的选择。各种免疫测定形式都可用于选择与特定蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，惯常将固相ELISA免疫测定用于选择与蛋白发生特异性免疫反应的抗体(参见例如Harlow和Lane，Antibodies, A Laboratory Manual (1988)禾口 Using Antibodies :A Laboratory Manual (1998),关于对可用于测定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述)。通常，特异性或选择性反应应为背景信号或噪声的至少2倍，更通常高于背景的10、20或100倍(例如结合至其它分枝杆菌蛋白，例如其它结核分枝杆菌蛋白)。诊断在另一个方面，本发明提供将上述一种或多种多肽用于诊断潜伏性结核病的方法 (例如使用常规形式的基于T细胞应答的测定或基于抗体的测定)。例如，本文提供用于在个体中测定潜伏性结核分枝杆菌感染的方法，其包括(a)从所述个体获得样品；(b)使所述样品与分离多肽接触，所述分离多肽包含(i)Rv3616c 蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段；(c)定量所述样品反应。样品可例如为全血或纯化细胞。合适的是，样品包括外周血单核细胞。在本发明的一个实施方案中，个体为血清反应阳性的。在本发明的第二个实施方案中，个体为血清反应阴性的。合适的是，个体先前未针对结核分枝杆菌感染进行接种(例如合适的是，个体先前未用BCG接种)。样品反应可通过各种本领域技术人员已知的方法进行定量，所述方法包括监测淋巴细胞增殖或特定细胞因子或抗体的产生。例如T细胞ELISP0T可用于监测细胞因子例如干扰素Y (IFNy)、白介素2 (IL2)和白介素5(IL5)。B细胞ELLISP0T可用于监测结核分枝杆菌特定抗原的刺激。细胞应答也可通过使用胞内和胞外染色并通过流式细胞仪进行分析来表征。定量样品增殖反应的方法包括(i)用放射标记(例如氚化胸苷)脉冲培养细胞并监测氚摄取(例如气体闪烁)；(ii)进行羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记和使用流式细胞术荧光监测细胞分裂。定量样品细胞因子反应尤其包括监测干扰素Y产生。当使用这类定量方法时，抗原的阳性反应可通过至少2 1(例如至少3 1或至少5 1)的信噪比(S/N比)界定。在本发明的另一个方面提供利用皮试诊断潜伏性结核分枝杆菌感染的方法。本文所用“皮试”为直接在患者上进行的任何测定，其中在皮内注射如上述的Rvl53c多肽(或其变体、免疫原性片段或者其编码核苷酸)之后，测得迟发型超敏(DTH)反应(例如膨胀、 变红或皮炎)。可使用任何合适的足以使抗原组合与患者真皮细胞接触的装置实现这类注射，所述装置为例如结核菌素注射器或ImL注射器。在一段时期后(例如注射后至少48小时、尤其48-72小时)测量所述反应。DTH反应为细胞介导的免疫应答，其在先前已暴露于测试抗原的患者中更强烈。可使用尺目测所述应答。通常，直径大于约0. 5cm、尤其大于约1. Ocm的应答为阳性应答，指示先前感染结核分枝杆菌，该感染可表现或不表现为活动性疾病。为了用于皮试，Rv3616c组分适宜配制为含药理学上可接受的载体的药物组合物。 合适的是，这类药物组合物中所用的载体为含合适防腐剂(例如苯酚和/或Tween 80 )的盐水溶液。本发明还提供用于任何上述诊断方法的试剂盒。这类试剂盒通常含两种或更多种对进行诊断测定所需的组分。组分可为化合物、试剂、容器和/或装置。例如，试剂盒内的一个容器可包含特异性结合至蛋白的单克隆抗体或其片段。如上所述，可将这类抗体或片段提供为连接至支持材料。一个或多个其它容器可装有待用于测定中的诸如试剂或缓冲剂等成分。或者，这类试剂盒也可包含如上所述的含适于直接或间接检测抗体结合的报道基团的检测试剂。或者，试剂盒可经设计以检测生物样品中编码蛋白的mRNA水平。这类试剂盒通常包含如上所述的至少一种与蛋白编码多核苷酸杂交的寡核苷酸探针或引物。这类寡核苷酸可用于例如PCR测定或杂交测定。可在这类试剂盒中存在的其它组分包括第二寡核苷酸和 /或诊断试剂或容器，以有助于编码本发明蛋白的多核苷酸的检测。其它诊断试剂盒包括设计用于检测细胞介导的反应的试剂盒(其可例如用于本发明诊断方法中)。这类试剂盒通常包含(i)用于从受试者中获取合适细胞样品的装置；(ii)用于用Rv3616c多肽(或其变体、其免疫原性片段或编码所述多肽的DNA)刺激所述细胞样品的工具；(iii)用于检测或定量对刺激的细胞应答的工具。用于定量细胞应答的合适工具包括B细胞ELISP0T试剂盒或T细胞ELISP0T试剂盒，其为本领域技术人员已知。一种可能的试剂盒包含(a)本发明多肽；和(b)适于直接或间接检测抗体结合的检测试剂。尤其引人关注的是专门用于定量T细胞应答的诊断试剂盒一种诊断试剂盒，其包含(a)本发明多肽；和(b)足以使所述多肽与个体真皮细胞接触的装置。一种诊断试剂盒，其包含(a)本发明多肽；(b)足以使所述多肽与来自个体的样品(例如全血或更适合的PBMC)接触的装置； 和(c)定量T细胞应答(例如增殖或IFN- γ产生)的工具。实施例仅以阐述的方式而非限制性方式提供以下实施例。本领域技术人员容易认识到， 可改动或修改各种非关键性参数以得到基本类似的结果。^MM 1-RV3616C作为潜伏件TB疮苗革Fj示的鉴定基因Rv3616c编码保守的假定富含丙氨酸和甘氨酸的蛋白。如Murphy和Brown BMC. Infect. Dis. 2007 7 :84-99 所述，根据对休眠阶段维持和侵染性相关结核分枝杆菌基因的泛基因组分析，选择Rv3616c。通过在模拟休眠条件下的细菌基因表达的已公布泛基因组DNA微阵列数据集的生物信息学元分析(meta-analysis)， 对结核分枝杆菌中的潜在休眠阶段基因靶标进行优先排序。随后在整个基因组中对由基因编码的结核分枝杆菌蛋白进行亚细胞定位以鉴定疫苗靶标。简言之，在休眠模型中的实验条件差异很大，因而根据以下两个标准形成0-5的评分系统以标准化这些数据1)实验条件与休眠状态的相关性和幻表达的等级次序。根据与临床出现休眠阶段结核分枝杆菌感染的潜在相关性，来调整具体实验数据集的最高分。 表1显示步骤1所收集的数据集以及各个数据集的调整最高分。其它关于对生长必需的基因的数据集获得自已公布的使用基于转座子的敲除实验(TraSH)的研究。对生长无作用的基因被赋予零分。表1-结核分枝杆菌DNA微阵列基因表达和泛基因组基因敲除的来源、实验模型和评分标准(生长阶段必需性)。
权利要求
1.一种用于治疗或预防潜伏性TB的分离多肽，其包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
2.权利要求1的多肽，其包含Rv3616c蛋白序列。
3.权利要求2的多肽，其由Rv3616c蛋白序列组成。
4.权利要求1的多肽，其包含Rv3616c蛋白序列的变体。
5.权利要求4的多肽，其包含与Rv3616c蛋白序列具有至少70%同一性的Rv3616c蛋白序列变体。
6.权利要求5的多肽，其包含与Rv3616c蛋白序列具有至少90%同一性的Rv3616c蛋白序列变体。
7.权利要求6的多肽，其包含与Rv3616c蛋白序列具有至少95%同一性的Rv3616c蛋白序列变体。
8.权利要求4的多肽，其由Rv3616c蛋白序列的变体组成。
9.权利要求8的多肽，其由与Rv3616c蛋白序列具有至少70%同一性的Rv3616c蛋白序列变体组成。
10.权利要求9的多肽，其由与Rv3616c蛋白序列具有至少90%同一性的Rv3616c蛋白序列变体组成。
11.权利要求10的多肽，其由与Rv3616c蛋白序列具有至少95%同一性的Rv3616c蛋白序列变体组成。
12.权利要求1的多肽，其包含Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
13.权利要求12的多肽，其包含来自Rv3616c蛋白序列的至少10个氨基酸残基的免疫原性片段。
14.权利要求13的多肽，其包含来自Rv3616c蛋白序列的至少20个氨基酸残基的免疫原性片段。
15.权利要求14的多肽，其包含来自Rv3616c蛋白序列的至少50个氨基酸残基的免疫原性片段。
16.权利要求12的多肽，其由Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段组成。
17.权利要求16的多肽，其由来自Rv3616c蛋白序列的至少10个氨基酸残基的免疫原性片段组成。
18.权利要求17的多肽，其由来自Rv3616c蛋白序列的至少20个氨基酸残基的免疫原性片段组成。
19.权利要求18的多肽，其由来自Rv3616c蛋白序列的至少50个氨基酸残基的免疫原性片段组成。
20.权利要求1-19中任一项的多肽，其中所述Rv3616c蛋白序列来自结核分枝杆菌。
21.权利要求20的多肽，其中所述Rv3616c蛋白具有SEQID N0:1的序列。
22.用于治疗潜伏性结核病的权利要求1-21中任一项的多肽。
23.用于预防潜伏性结核病的权利要求1-21中任一项的多肽。
24.用于预防结核病再活化的权利要求1-21中任一项的多肽。
25.用于延迟结核病再活化的权利要求1-21中任一项的多肽。
26.权利要求22-25中任一项的多肽，其中所述结核病与结核分枝杆菌感染有关。
27.一种用于治疗或预防潜伏性TB的包含编码以下多肽的核酸序列的分离多核苷酸， 所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
28.权利要求27的多核苷酸，其包含编码含Rv3616c蛋白序列的多肽的核酸序列。
29.权利要求观的多核苷酸，其包含编码含Rv3616c蛋白序列变体的多肽的核酸序列。
30.权利要求四的多核苷酸，其包含编码含与Rv3616c蛋白序列具有至少70%同一性的Rv3616c蛋白序列变体的多肽的核酸序列。
31.权利要求27的多核苷酸，其包含编码含Rv3616c蛋白序列免疫原性片段的多肽的核酸序列。
32.权利要求31的多核苷酸，其包含以下核酸序列，所述核酸序列编码包含来自 Rv3616c蛋白序列的至少10个氨基酸残基的免疫原性片段的多肽。
33.权利要求27-32中任一项的多核苷酸，其包含编码以下多肽的核酸序列，所述多肽由以下组成(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
34.权利要求33的多核苷酸，其由编码以下多肽的核酸序列组成，所述多肽由以下组成(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
35.权利要求27-34中任一项的多核苷酸，其中所述Rv3616c蛋白序列来自结核分枝杆菌。
36.权利要求35的多核苷酸，其中所述Rv3616c蛋白具有SEQID NO 1的序列。
37.权利要求36的多核苷酸，其包含SEQID NO :2的序列或其片段。
38.用于治疗潜伏性结核病的权利要求观-37中任一项的多核苷酸。
39.用于预防潜伏性结核病的权利要求观-37中任一项的多核苷酸。
40.用于预防结核病再活化的权利要求观-37中任一项的多核苷酸。
41.用于延迟结核病再活化的权利要求观-37中任一项的多核苷酸。
42.权利要求38-41中任一项的多核苷酸，其中所述结核病与结核分枝杆菌感染有关。
43.一种用于治疗或预防潜伏性TB的药物组合物，其包含 (a)以下多肽，其包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含编码(a)多肽的核酸序列的多核苷酸； 以及(C)药学上可接受的载体或赋形剂。
44.一种用于治疗或预防潜伏性TB的免疫原性组合物，其包含(a)以下多肽，其包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含编码(a)多肽的核酸序列的多核苷酸； 以及(c)非特异性免疫应答增强剂。
45.权利要求44的免疫原性组合物，其中所述非特异性免疫应答增强剂为佐剂。
46.一种用于治疗或预防潜伏性结核病的方法，其包括给予安全且有效量的以下多肽至有需要的受试者，所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段； 其中所述多肽诱导免疫应答。
47.一种用于治疗或预防潜伏性结核病的方法，其包括给予安全且有效量的以下多核苷酸至有需要的受试者，所述多核苷酸包含编码以下多肽的核酸序列，所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段； 其中所述多核苷酸诱导免疫应答。
48.权利要求46或47的方法，其中将所述多肽或多核苷酸作为药物组合物给予。
49.权利要求46或47的方法，其中将所述多肽或多核苷酸作为免疫原性组合物给予。
50.权利要求46-49中任一项的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
51.权利要求50的方法，其中所述受试者为人类。
52.权利要求46-51中任一项的方法，其中所述受试者患有活动性结核病。
53.权利要求46-51中任一项的方法，其中所述受试者患有潜伏性结核病。
54.权利要求46-51中任一项的方法，其中所述受试者未患结核病。
55.权利要求46-54中任一项的方法，其中所述受试者先前已用卡介苗(BCG)免疫接种。
56.权利要求46-55中任一项的方法，其中所述Rv3616c蛋白序列来自结核分枝杆菌。
57.权利要求56的方法，其中所述Rv3616c蛋白具有SEQID NO 1的序列。
58.权利要求46-57中任一项的方法，其还包括给予一种或多种有效治疗结核病的化疗药。
59.权利要求58的方法，其中所述一种或多种化疗药选自异烟胼和利福平。
60.权利要求46-59中任一项的方法，其还包括给予至少一种另外的结核分枝杆菌抗原。
61.权利要求60的方法，其中所述另外的结核分枝杆菌抗原以多肽的形式提供。
62.权利要求61的方法，其中以下多肽和另外的结核分枝杆菌抗原以融合蛋白的形式提供，所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
63.权利要求60的方法，其中所述另外的结核分枝杆菌抗原以多核苷酸的形式提供。
64.权利要求63的方法，其中包含编码以下多肽的核酸序列的多核苷酸和另外的结核分枝杆菌抗原以单个多核苷酸序列的形式提供，所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
65.权利要求64的方法，其中所述单个多核苷酸序列编码包含Rv3616c抗原和所述另外的结核分枝杆菌抗原的融合蛋白。
66.权利要求60的方法，其中所述另外的结核分枝杆菌抗原以卡介苗(BCG)的形式提{共。
67.权利要求46-66中任一项的方法，其中所述治疗或预防潜伏性结核病是指治疗潜伏性结核病。
68.权利要求46-66中任一项的方法，其中所述治疗或预防潜伏性结核病是指预防潜伏性结核病。
69.权利要求46-66中任一项的方法，其中所述治疗或预防潜伏性结核病是指预防结核病再活化。
70.权利要求46-66中任一项的方法，其中所述治疗或预防潜伏性结核病是指延迟结核病再活化。
71.权利要求46-70中任一项的方法，其中所述结核病与结核分枝杆菌感染有关。
72.权利要求71的方法，其中所述结核分枝杆菌感染与结核分枝杆菌多重耐药菌株有关。
73.权利要求46-72中任一项的方法，其诱导针对结核分枝杆菌感染的免疫应答。
74.以下多肽在制备用于治疗或预防潜伏性结核病的药物中的用途，所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
75.以下多核苷酸在制备用于治疗或预防潜伏性结核病的药物中的用途，所述多核苷酸包含编码以下多肽的核酸序列，所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
76.一种用于治疗或预防潜伏性TB的包含以下多肽的融合蛋白，所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
77.一种用于治疗或预防潜伏性TB的多核苷酸，其包含编码包含以下多肽的融合蛋白的核苷酸序列，所述多肽包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或者(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
78.一种用于治疗或预防潜伏性TB的多核苷酸，其包含第一核苷酸序列，所述序列在中等严格条件下与第二核苷酸序列的互补序列选择性杂交，所述第二核苷酸序列编码以下多肽，其包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
79.用于治疗或预防潜伏性TB的权利要求78的多核苷酸，其包含第一核苷酸序列，所述序列在高度严格条件下与第二核苷酸序列的互补序列选择性杂交，所述第二核苷酸序列编码以下多肽，其包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。
80.权利要求78或79的多核苷酸，其包含第一核苷酸序列，所述序列与SEQID NO 2 的互补序列选择性杂交。
81.—种诊断试剂盒，其包含(a)权利要求1的多肽；(b)足以使所述多肽与来自个体的样品(例如全血或更适合的PBMC)接触的装置；和(c)定量所述样品的T细胞应答的工具。
82.权利要求81的诊断试剂盒，其包含(a)权利要求1的多肽；(b)足以使所述多肽与来自个体的样品(例如全血或更适合的PBMC)接触的装置；和(c)定量和表征所述样品的T细胞应答的工具。
83.—种诊断试剂盒，其包含(a)权利要求1的多肽；(b)足以使所述多肽与来自个体的样品(例如全血或更适合的PBMC)接触的装置；和(c)定量所述样品的B细胞应答的工具。
84.—种诊断试剂盒，其包含(a)权利要求1的多肽；和(b)足以使所述多肽与患者真皮细胞接触的装置。
85.—种诊断试剂盒，其包含 (a)权利要求1的多肽；和(c)定量来自个体的样品(例如全血或更适合的PBMC)中的T细胞应答的工具。
86. 一种诊断试剂盒，其包含 (a)权利要求1的多肽；和(c)定量来自个体的样品(例如全血或更适合的PBMC)中的B细胞应答的工具。
全文摘要
本发明涉及用于治疗或预防潜伏性TB的多肽，其包含(i)Rv3616c蛋白序列；(ii)Rv3616c蛋白序列的变体；或(iii)Rv3616c蛋白序列的免疫原性片段。在其它方面，本发明涉及用于治疗或预防潜伏性结核病的相关多核苷酸、融合蛋白和方法。
文档编号C07K14/35GK102164952SQ200980138400
公开日2011年8月24日 申请日期2009年7月24日 优先权日2008年7月25日
发明者D·墨菲, J·布朗, P·梅滕斯 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司, 葛兰素集团有限公司