专利名称：重组肿瘤特异性凋亡因子制备方法中的叶酸化修饰步骤及其制品的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制药的制备方法及应用，尤其是具有活性的重组肿瘤特异性 凋亡因子的方法中的叶酸化修饰步骤、及该方法获得的制品在抗肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
癌症治疗是世界性难题，癌症的生物治疗是手术、放疗、化疗等方法的重要补充， 寻找更有效的生物制剂已成为21世纪重点研究领域之一。目前国内外已上市的用于肿 瘤治疗的生物制剂主要有白细胞介素-2 (IL-2)、干扰素(IFN)和单核细胞集落刺激因子 (GSM)几种，不仅可供临床选择的品种较少，而且均为免疫增强剂或调节剂，所以研发具有 治疗作用的新型生物制剂具有重要的社会意义和经济意义。来源于鸡贫血病毒的鸡贫血病毒蛋白_3(vp3)对人的各种肿瘤细胞和异常转化 细胞具有特异性杀伤作用。由于vp3能够选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，而不 诱导正常细胞的凋亡，被命名为肿瘤特异性凋亡因子(Apoptin)。研究结果表明，Apoptin 诱导肿瘤细胞凋亡不依赖于抑癌基因_53(p53)作用途径，也不被抑制细胞凋亡基因 (Bcl-2)过量表达所抑制，因此有希望成为有效治疗癌症的新型生物制剂。与现有的抗肿瘤药物相比Apoptin具有如下特点(1) Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡不依赖P53途径，对那些P53基因突变的肿瘤细胞 仍能诱导其凋亡，此点优于那些依靠P53发挥作用的抗肿瘤药，因为后者对P53突变的肿瘤 细胞无效；(2) Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡不仅不受bcl_2过表达的抑制，反而bcl_2过表达 能够增强apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的作用，此点优于那些被bcl-2过表达抑制的抗肿瘤 药；(3)现有的抗肿瘤药物尽管数量繁多，也不乏疗效较好者，如紫杉醇、砷制剂等，但 多数药物毒副作用大，且反复用药后多产生耐药性，而使肿瘤复发，所以研制毒副作用小、 疗效显著的抗肿瘤药物是十分必要的。与紫杉醇相比，Apoptin具有独特优势①不受自然 资源的限制，可根据市场需求无限量的生产；②抗肿瘤作用机理独特，效果明显，无或低毒 副作用；③Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡是通过激活胱天蛋白酶、释放细胞色素C和激活氨基 末端激酶完成的，作用机理清楚。但是由于Apoptin为来源于鸡贫血病毒的蛋白质，所以在Apoptin规模化生产和 应用中存在两个重要的技术瓶颈，一是由于种属间的差异，人体细胞膜表面没有其相关的 蛋白受体，所以，Apoptin不能与人的细胞结合，进入细胞，引起细胞凋亡。而Apoptin诱导 细胞凋亡的原理是进入细胞，激活与细胞凋亡相关的酶(主要为caspase)引起细胞凋亡。 其二是原核表达的Apoptin在体外难溶解、不稳定，很难获得大量高纯度的蛋白质。所以尽 管对Apoptin已经研究了十余年，但上述两个技术难题严重限制了 Apoptin的产业化和临 床应用，至今仍未应用于临床。所以解决这两个技术难题是使Apoptin实现产业化的关键，亦是国内外的研究热点。针对这两个难题，目前国内外学者主要在以下两个方面开展研究①以病毒为载 体，将Apoptin基因带入肿瘤细胞，发挥Apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡作用。此种方法的 优点是方法比较简单、易于操作、效果肯定；其缺点是不易产业化、病毒基因作为外源基因 有潜在的引起基因重组发生突变的危险、病毒作为外援抗原反复应用，会刺激机体产生抗 体，减弱其作用。②采用显微注射的方法将重组Apoptin蛋白直接注射到肿瘤细胞内。此 种方法因其技术要求和设备要求很高，只适合实验室研究，不可能规模化应用，所以不能产 业化。
发明内容
为能实现产业化，本发明的目的在于提供一种重组肿瘤特异性凋亡因子制备方法 中的叶酸化修饰步骤、及该方法获得的制品在抗肿瘤治疗中的应用，该步骤是，在构建谷胱 肽转移酶-肿瘤特异性凋亡因子(GST-Apoptin)融合蛋白原核表达载体(PGEX-A)的基础 上，建立起纯化GST-Apoptin融合蛋白后，将叶酸连接到纯化后的GST-Apoptin融合蛋白 上，以激活GST-Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的活性，使GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细 胞发生结合，用于诱导肿瘤细胞凋亡。上述三个步骤构成在大肠杆菌中高效表达、稳定好、 纯度高且有高活性的重组肿瘤特异性凋亡因子的制备方法，及该方法获得的制品在抗肿瘤 治疗中的应用，以达到能够满足临床治疗肿瘤的目的。本发明提供的新型重组肿瘤特异性凋亡因子具有序列表中序列1所示的氨基酸 序列；本发明提供的新型重组肿瘤特异性凋亡因子基因具有序列表中序列2所示的核 苷酸序列；重组肿瘤特异性凋亡因子的制备方法，包括以下步骤(1)通过人工合成的方法直接获得Apoptin的基因片段，构建含GST-Apoptin基因 的原核表达载体PGEX-A ；(2) GST-Apoptin融合蛋白的发酵，高效表达，溶解，复性及纯化；(3)GST-Apoptin融合蛋白的化学修饰，将上步骤后的GST-Apoptin与叶酸连接， 使GST-Apoptin获得活性，诱导肿瘤细胞凋亡作用。(1)中所说的构建含GST-Apoptin基因的原核表达载体pGEX_A的方法见文献 《鸡贫血病毒vp3基因融合表达载体的构建及表达》(www.cqvip.com)；(2)中所说的GST-Apoptin融合蛋白的发酵，高效表达，溶解，复性及纯化的步骤 是将前述(1)表达GST-Apoptin融合蛋白的工程菌接种到含氨苄青霉素(AP)的液体肉 汤培养基(LB)中，37°C摇床内培养，将菌液按比例转种到含AP的LB培养基中扩增，37°C摇 床内培养，菌液浓度达到光密为1. 0时按比例接种到发酵罐内，待菌液浓度达到光密为2. 0 后，加入异丙基-0-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂；诱导培养4h，同时小量持续补加填料 液，氨水自动调节PH7. 0值，收集上述发酵液；离心收集菌体，高压勻浆破碎菌体，离心收集 沉淀，即为包涵体；取包涵体，加入包涵体溶解液磁力搅拌溶解4h ；离心收集上清液；按比 例缓慢加入复性液，室温磁力搅拌溶解4h ；4°C复性12h以上；超滤浓缩；将上述浓缩的复 性液通过用平衡液平衡的琼脂糖凝胶(Separose-12)层析柱，收集目的峰；将目的峰再上用平衡液平衡好的去内毒素亲和层析柱(FF层析柱)，收集洗脱峰即为纯化的重组肿瘤特 异性凋亡因子(-20°C保存备用)。(3)中所说的GST-Apoptin融合蛋白化学修饰步骤是采用戊二醛法按下列比例 配制GST-Apoptin融合蛋白与叶酸连接体系，具体是体积相同的0. 2mg/ml GST-Apoptin融 合蛋白和1. Omg/ml叶酸，再加入微量的戊二醛(原液125倍)，将配制好的连接体系，置于 室温(25°C以上)避光放置3h ；将连接液对磷酸盐缓冲液透析，4°C，12h以上；过滤除菌，即 为新型重组肿瘤特异性凋亡因子(-20°C保存备用)。将上述制品用于诱导肿瘤细胞凋亡，以体外培养细胞为例将肿瘤细胞接种到 96孔细胞培养板内，培养过夜；加入新型重组肿瘤特异性凋亡因子，继续培养72小时，用 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定细胞凋亡，试验设正常细胞 对照，未激活GST-Apoptin融合蛋白对照。结果10 u g/mL新型重组肿瘤特异性凋亡因子可 使50%以上的肿瘤细胞发生凋亡。将上述制品用于抗肿瘤治疗，以动物实验为例将小鼠皮下接种肿瘤细胞，使肿瘤 长至5mm3左右时，将小鼠随机分组，分别皮下注射高、中、低三种不同计量的新型重组肿瘤 特异性凋亡因子及生理盐水(对照组)，连续注射20天，实验结果表明新型重组肿瘤特异性 凋亡因子对多种肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用，肿瘤组织明显萎缩。
下面结合附图进一步说明本发明。图1为GST-Apoptin融合蛋白原核表达载体构建方案。图2为表达载体的酶切图谱及结果，图中标示分别为。M 分子量标准，从大到小依次为 2000，1000, 750，500，250，100bp ；1 为质粒酶切对照；2、3、4 为表达载体pGEX-A酶切图谱。图3为发酵菌体表达的重组肿瘤特异性凋亡因子(7. 5%胶)，图中标示分别为M 分子量标准，从大到小依次为 97. 0，66. 2，43. 0，31. 0，14. 3kDa，1 菌体蛋白对照；2、3 发酵表达的GST-Apoptin融合蛋白。图4为分步纯化的重组肿瘤特异性凋亡因子(16%胶)。图中标示分别为M 分子量标准，从大到小依次为 97. 0,66. 2，43. 0,31. 0，14. 3kDa，1、2、3、4、5 为分布收集的纯化的GST-Apoptin融合蛋白。图5为新型重组肿瘤特异性凋亡因子对A375细胞的凋亡诱导作用。图6为新型重组肿瘤特异性凋亡因子对S180荷瘤小鼠的治疗作用。
具体实施例方式(1)通过人工合成的方法直接获得Apoptin的基因片段；构建含GST-Apoptin基 因的原核表达载体pGEX-A;(2) GST-Apoptin融合蛋白的发酵，高效表达，溶解，复性及纯化，具体是(2. 1)工程菌的活化、发酵及包涵体的回收取-70°C保存的工程菌种接种到含AP 的营养琼脂平板培养基上，37°C培养12h以上；挑取单个菌落接种到含AP的LB液体培养基 中，37°C摇床内培养12h以上，将菌液按1 10比例接种到发酵罐内，37°C条件下培养；待菌液浓度达到2. 00D后，加入IPTG诱导剂；诱导培养4h，同时小量持续补加填料液，氨水自 动调节PH7.0值。离心收集菌体，菌体用磷酸盐缓冲液(PB，pH7. 2)悬浮，冰浴条件下，高压 勻浆破碎菌体，反复4次。离心破碎后的菌体，收集沉淀，即为包涵体(图3)；(2. 2)包涵体的溶解和复性称取适量包涵体，加入包涵体溶解液(2 % )，室温条件 下，磁力搅拌溶解处；离心41，900011)111，151^11，收集上清液；按1 8比例缓慢加入复性 液，室温磁力搅拌溶解4h ；4°C复性12h以上；超滤浓缩20倍以上，立即纯化或-20°C保存备 用。(2. 3)肿瘤特异性凋亡因子纯化用平衡液平衡S印ar0Sel2层析柱；将上述浓缩 的复性液按床体积的3%比例上样，流速为2ml/min ；分步收集第2个峰；十二烷基硫酸钠 (SDS)电泳鉴定后，取分子量为39kD纯度高的蛋白质部分；将上述样品再上用平衡液平衡 好的FF层析柱(或-20°C保存备用)，按床体积75%比例上样，样品在柱内留置lh后，用平 衡液洗脱；收集洗脱峰，-20°C保存待鉴定。(2. 4)纯化的肿瘤特异性凋亡因子鉴定采用SDS电泳法或高效液相法测定蛋白质 纯度，纯度在95%以上(图4)，采用紫外分光光度计测定蛋白质含量，大约在0. 5mg/ml ；采 用鲎试剂法测定蛋白质样品内的内毒素含量，1 200合格。上述各液体配方范围及准备如下营养琼脂培养基平皿是，按1. 5%的浓度称取营养琼脂，加适量的注射用水，高压 灭菌，待培养基冷却到45°C时，加入氨苄青霉素(AP)，终浓度为lOOyg/ml)，然后将琼脂倒 入平皿，待琼脂凝固后，4°C保存备用，(可用1 2周)。LB液体培养基是，以1000ml为单位按下列比例配制溶解后高压灭菌。
蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCllg
发酵液是，以20L为单位按下列比例配制，发酵罐内高压灭菌。
蛋白胨200g
酵母提取物100g
NaCl20g
CaCl2g
NH4C130g
葡萄糖lOOg(单独高压，8磅)
磷酸二氢钠.2H2030g
磷酸氢二钠.12H20120g
补料液是，以1000ml为单位按下列比例配制。
蛋白胨lOOg
酵母提取物lOOg
葡萄糖200g(700ml水溶解单独高压，8磅)
lmol IPTG(1000倍)是，过滤除菌，-20°C保存。
IPTG0. 48g
水20ml
氨苄青霉素(AP，5000倍)，应用浓度为100 u g/mlAP500mg水5ml20mmol PB缓冲液(pH7. 2)以1000ml为单位按下列比例配制。磷酸二氢钠.2H203. 12g磷酸氢二钠 12H207. 16gEDTA0. 37g20mmol PB缓冲液(pH8. 0)以1000ml为单位按下列比例配制。磷酸二氢钠.2H203. 12g磷酸氢二钠.12H207. 16gEDTA0. 37g包涵体溶解液，以100ml为单位按下列比例配制。20mmol PB 缓冲液(pH8. 0)100ml肌酸钠(1.0%-3. 0% )1. 0 3. 0g，取 1. 5g三乙醇胺(10-30mM)0. 13 0. 66ml，取 0. 33mlDTT (10-30mM)0. 15 0. 45g,，取 0. 31g复性液，以1000ml为单位按下列比例配制。20mmol PB 缓冲液(pH8. 0)1000ml
DTT (10-30mM) 1. 5 4. 5g，平衡液，以1000ml为单位按下列比例配制。20mmol PB 缓冲液(pH7. 2)1000ml肌酸钠(0.-1. 0% )0. 1 1. 0g，取 1. 0g三乙醇胺(ImM)0. 132ml包涵体洗涤液以1000ml为单位按下列比例配制。20mmol PB 缓冲液(pH7. 2)1000mlTritonX-100(0. 1% )0.1ml尿素(2mol)120g(3)GST-Apoptin融合蛋白的化学化修饰，即GST-Apoptin融合蛋白的激活。(3. 1)实验材料医用叶酸，上述纯化的重组肿瘤特异性凋亡因子，戊二醛，(3. 2)实验方法采用戊二醛法将重组肿瘤特异性凋亡因子与叶酸连，用偶联缓 冲液按下列比例配制重组肿瘤特异性凋亡因子与叶酸连接体系，0. 2mg/ml重组肿瘤特异性凋亡因子1ml1. Omg/ml 叶酸1ml戊二醛(原液125 倍)16 ill (0.2%)将配制好的连接体系，置于室温(25°C以上)避光放置3h ；将连接液对1000ml连 接缓冲液透析，4°C，12h以上；(3.3)过滤除菌，4°C保存备用。进行下列活性鉴定。(4)新型重组肿瘤特异性凋亡因子体外诱导肿瘤细胞凋亡作用(4. 1)实验材料
(4. 1. 1)重组肿瘤特异性凋亡因子PB溶液20mmol PB缓冲液(pH7. 2)，0. 肌 酸钠，ImM三乙醇胺；(4.1.2)人黑色素瘤细胞A375细胞株(引自军事医学科学院)；(4. 2)试验方法采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法 测定apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡的活性。(4. 2. 1)常规传代培养A375细胞；(4. 2. 2)取生长良好的细胞，配制成4X 103个/ml的细胞悬液；(4. 2. 3)将细胞悬液加入96孔细胞培养板，0. lml/孔，37°C，5% C02培养过夜；(4.2.4)加入上述激活的apoptin，0. lml/孔，以50 y g/ml为起点，2倍稀释，每个 滴度作4孔；(4. 2. 5)37°C，5% C02 培养 72h ；(4. 2. 6)吸弃培养上清夜，用磷酸盐缓冲液洗细胞2次；(4. 2. 7)加入用无酚红 RPMI1640 配制的 MTT(lmg/ml)，50iil/孔，37°C，5% C02 培 养3h;(4. 2. 8)吸弃培养上清夜，用磷酸盐缓冲液洗细胞2次；(4.2.9)加入二甲基亚砜(DMS0), 50 u 1/ ？L, 37°C, lOmin ；(4.2. 10)用EL340560nm波长，检测各孔A值。试验设正常细胞对照，未激活 apoptin 对照。(4.3)结果10 iig/mL活化的apoptin可使50%以上的肿瘤细胞发生凋亡(图5)。 而未激活apoptin组细胞与正常对照组细胞没有差异。(5)新型重组肿瘤特异性凋亡因子体内抗肿瘤作用(5.1)实验材料雄性BALB/c小鼠(体重18 20g)购于中国医科大学动物部。小鼠S-180肉瘤 细胞引自沈阳军区总医院医学实验科，小鼠腹腔传代以保证其致瘤性。重组肿瘤特异性凋 亡因子PB溶液20mmol PB缓冲液(pH7. 2)，0. 1 %肌酸钠，ImM三乙醇胺；(5. 2)实验方法将S-180腹水肉瘤细胞用生理盐水配制成2X 109/L的细胞悬液，接种于小鼠右侧 腋部皮下，0. 2ml/只。所有动物常规饲养[4]。小鼠肿瘤包快长到5mm后，随机分为重组肿瘤 特异性凋亡因子治疗组、GST-Apoptin融合蛋白对照组和生理盐水组，每组8只。治疗组 小鼠右侧腋部皮下注射，50i!g(0. lmL)/只；对照组和生理盐水组分别注射等量、等体积的 GST-Apoptin融合蛋白和生理盐水。每组小鼠每天注射1次；小鼠常规饲养，每日观察小鼠 一般生活状况，肿瘤大小，每6d测量体重，于接种后3wk脱颈椎处死，分离肿瘤组织称重。(5. 3)结果(5. 3. 1)实验小鼠的一般状况，小鼠接种S-180肉瘤细胞后，各组小鼠正常喂养， 接种lwk内一般生理状况没有明显变化。lwk后，与治疗组相比较，GST-Apoptin融合蛋白 对照组和生理盐水组小鼠进食减少、消瘦、体重下降、皮毛失去光泽，肿瘤包块明显增大；到 第2wk时，生理盐水组小鼠开始出现死亡；而治疗组小鼠一般状况良好。(5. 3. 2) 3wk后活杀小鼠，取肿瘤组织称瘤重，治疗组的瘤重为(0. 56 士0. 41) g，抑 瘤率为60. 06%;GST-Apoptin融合蛋白对照组的瘤重为(1. 36士0. 55) g，抑瘤率为4. 22% 0以生理盐水组的瘤重为基数，计算出的治疗组和GST-Apoptin融合蛋白对照组的抑瘤率差 异显著(p < 0. 01)(图6)。图6中A为盐水对照组瘤体，B为治疗组瘤体。
本发明的有益效果是在大肠杆菌中高效表达、稳定好、纯度高且有高活性，治疗 效果显著，特别是实施本发明对生产设备没有特殊的要求，适合规模化和产业化，对于人类 攻克肿瘤、延长人类寿命具有重要意义。
权利要求
一种重组肿瘤特异性凋亡因子制备方法中的叶酸化修饰步骤，其特征是将叶酸连接到纯化后的GST-Apoptin融合蛋白上。
2.一种按照权利要求1所述的重组肿瘤特异性凋亡因子制备方法中的叶酸化修饰步 骤所获得的制品，其特征是用于抗肿瘤治疗。
3.一种按照权利要求1所述的重组肿瘤特异性凋亡因子制备方法中的叶酸化修饰 步骤，其特征是将叶酸连接到纯化后的GST-Apoptin融合蛋白上的方法是采用戊二醛 法按下列比例配制GST-Apoptin融合蛋白与叶酸连接体系，具体是体积相同的0. 2mg/ mlGST-Apoptin融合蛋白和1. Omg/ml叶酸，再加入微量的戊二醛，将配制好的连接体系，置 于室温25°C以上避光放置3h ；将连接液对磷酸盐缓冲液透析，4°C，12h以上；过滤除菌。
4.按照权利要求3所述的重组肿瘤特异性凋亡因子制备方法中的叶酸化修饰步骤，其 特征是所说的GST-Apoptin融合蛋白与叶酸连接体系是，用磷酸盐缓冲液按下列比例配 制重组肿瘤特异性凋亡因子与叶酸连接体系，`0.2mg/ml重组肿瘤特异性凋亡因子 1ml`1.Omg/ml 叶酸1ml戊二醛(原液125倍)16 ill将配制好的连接体系，置于室温25°C以上避光放置3h ；将连接液对1000ml磷酸盐缓冲 液透析，4°C，12h以上。
全文摘要
本发明提供了一种重组肿瘤特异性凋亡因子制备方法中的叶酸化修饰步骤及其制品的应用，在构建GST-Apoptin融合蛋白原核表达载体的基础上，建立起纯化GST-Apoptin融合蛋白后，将叶酸连接到纯化后的GST-Apoptin融合蛋白上，以激活GST-Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的活性，用于诱导肿瘤细胞凋亡。本发明的有益效果是在大肠杆菌中高效表达、稳定好、纯度高且有高活性，适合规模化和产业化。
文档编号C07K1/107GK101875688SQ20101010768
公开日2010年11月3日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者赵洪礼 申请人:赵洪礼