一种检测细菌性阴道病的方法

专利名称：一种检测细菌性阴道病的方法
技术领域：
本发明涉及新的化合物5-溴-3-吲哚- a -D-N-乙酰神经氨酸 (5-bromo-3-indoyl- α -D-N-acetyl neuraminic acid)或其盐，及其在疾病检IlJ方面的应 用。本发明还涉及检测疾病的方法和试剂盒，所述疾病尤其是细菌性阴道病。
现有技术 细菌性阴道病(bacterial vaginosis，简称BV)是指一类在细菌学上表现为生殖 道正常菌群(产H2O2乳酸杆菌)数量减少、代之以一组厌氧菌群如拟杆菌(Bacteroides)、 动弯杆菌(Mobiluncus spp)、阴道加特纳菌(Gardnerellavaginalis)、普雷沃菌 (Prevotella spp)、消化球菌(Peptastreptococcus)禾口人型支原体(Mycoplasma hominis) 等的数量增加的临床症候群。以前由于对它认识有限，曾报道过很多名称，如嗜血杆菌阴 道炎(Haemophilus Vaginitis)、棒状杆菌阴道炎(Gardnerella Vaginalis Vaginitis)、 非特异性阴道炎(Non-specificcaginitis)和加特钠菌阴道炎(Gardnerella Vaginalis vaginiris)等，皆因不同时期对其病原体的认识不同而命名不同。1984年在斯德哥尔摩有 关此病的国际会议上才正式命名为细菌性阴道病。其理由是因为该病病原体不仅是阴道加 特纳菌，而且还有其它厌氧菌；又因为此病炎症不明显，分泌物中白细胞少，故称阴道病比 阴道炎更合适。BV是妇产科最常见的疾病之一，感染率较高，且易复发。患BV的妇女中有50%的 人易早产或分娩低体重儿，她们所生下的孩子也很可能会因此带有各种后遗症。越来越多 的证据表明，BV是导致组织性绒毛膜炎、羊水感染、剖腹产术后子宫内膜炎及其他妊娠不良 和妊娠并发症的危险因素。另外在妇科中，BV主要与输卵管炎、盆腔炎、宫外孕、不孕症、泌 尿系感染、术后感染及妇科肿瘤有关。诊断BV不能仅根据临床病症表现，因为BV患者症状轻微，外阴偶痒，稀薄白带，惟 一特点是白带出现鱼腥味，而不同于其他阴道炎。虽然BV于1955年已被Gardner确认为 一种独立疾病，并提出4项临床检查指标(1)呈均勻致稀薄的阴道分泌物；(2)阴道pH值 > 5. 0-5. 2 ； (3)阴道分泌物氨味；(4)有线索细胞存在。Amsel等(1983年)经多年来的研 究及临床观察，提出新的四项综合临床征指标做为诊断BV的依据。即①异常阴道分泌物； ②阴道分泌物PH值> 4. 5 ；③阴道分泌物加一滴10%氢氧化钾溶液，产生氨味或鱼腥样异 味；④在阴道液湿片中发现线索细胞。这4项指标存在其中3个，但最后一项线索细胞必须 有方能确诊BV。该方法目前被认为是诊断BV的“金标准”，习惯上称为Amsel法。(一 )常规方法1.测定阴道分泌物的胺味和PH倌[原理]患细菌性阴道病时，阴道分泌物中的加特纳菌和某些厌氧菌(如类杆菌、胨链球 菌和动弯杆菌等)比正常增加1千至10万倍。由于厌氧菌的过度生长，抑制了乳酸杆菌 (Lactobacteria)的生长，而乳酸杆菌产生的过氧化氢(能杀死厌氧菌)的减少，又促使厌氧菌的生长。厌氧菌可产生丙酸盐、丁酸盐和大量胺类如尸胺等，造成阴道分泌物的特殊气 味和pH值的升高。[方法]胺味的测定取病人的阴道分泌物于载玻片上，加1滴10%氢氧化钾溶液，可闻到 “鱼腥”气味一一胺味。另外，病人常会诉说阴道分泌物有特殊腥味。性交时由于碱性前列 腺液引起胺类释放，臭味加重。pH的测定用阴道窥器扩展阴道，用PH试纸接触阴道壁，或用不沾盐水的棉拭子 取分泌物后涂于PH试纸上。细菌性阴道病病人的阴道分泌物的pH常大于4. 5。2.阴道菌群的检杳[原理]细菌性阴道病时，乳酸杆菌减少，其它细菌增加。用油镜(接物镜IOOx)观察3 5个视野，计算乳酸杆菌和加特纳菌的数量变化，为诊断本病作参考。[方法]取阴道分泌物作涂片。将涂片作革兰染色，用油镜观察涂片中各种菌的数量。乳酸杆菌为革兰阳性大杆 菌，粗短或细长成单根、链状或栅状排列。加特纳菌为革兰阴性球杆菌。mobilimcus菌 为革兰阴性弧菌，两端尖细，单个或成双排列。按下列标准判断涂片中乳酸杆菌的平均数量+ =每视野< 1个；++ =每视野1 5个；+++ =每视野6 30个；++++ =每视野> 30个。[结果]如病人不是细菌性阴道病，则分泌物中只有乳酸杆菌，或其数量为+++及++++，仅 可见少许加特纳菌；如是细菌性阴道病，则为混合菌群，不仅有加特纳菌，还有其它革兰阴 性和阳性杆菌，而无乳酸杆菌或只有+或++。当乳酸杆菌计数在++和+++之间时(如每视 野5 6个)，可结合临床其它指标考虑。3.线索细胞的检杳[原理]细菌性阴道病阴道中存在加特纳菌和厌氧菌，这些细菌可覆盖在鳞状上皮细胞 上，形成线索细胞。[方法]在载玻片上加一滴生理盐水，取阴道分泌物混合成悬液，加上盖玻片，置高倍 (400x)镜检查。[结果]细菌性阴道病患者阴道分泌物大多数可找到线索细胞。由于大量细菌(加特纳菌 和厌氧菌)的存在和细胞的明显溶解，可使鳞状上皮细胞边缘成锯齿状且模糊不清。[临床意义]在现在广为使用的BV检测金标准中，线索细胞是最关键指标，其可靠性已得到经 验证实，受到广大临床检验工作人员的高度重视。在目前的技术水平下，从可靠性角度而言 尚无能够取代线索细胞的指标，实际工作中，单纯检测线索细胞的有无基本上就可判断BV 的感染与否。
4.加特纳菌的培养和鉴定[原理]加特纳 菌是引起细菌性阴道病的主要病原菌之一。培养出此菌再结合临床症状应 当有助于诊断。[临床意义]由于40%的健康女性和40%治疗后的女性患者可培养出加特纳菌，因此本菌的 培养对细菌性阴道病的诊断并非必要。但阴道分泌物中能否培养出加特纳菌当有助于肯定 和否定诊断。上述常规方法不可能产品化，进行标准化操作，由于BV检测面临巨大的市场，随 着科学技术的发展，一些新技术得到应用，形成产品用于BV的临床检测。1.改良胺试验法该法的试剂以郑州安图绿科生物工程有限公司的试剂为代表。胺试验法在Amsel 法这一诊断BV的“金标准”中，其特异性仅次于线索细胞，以前之所以在BV检测中没有得 到独立使用，是由于两个原因其一、常规的胺试验客观性差，受实验人员嗅觉功能影响比 较大；其二、常规胺试验灵敏度差。改良胺试验法正是基于常规胺试验法的这两个缺点而建 立的，它把目前检测细菌性阴道病的胺试验与包被有颜色指示剂的膜有机结合，膜技术具 有微量放大作用，可有效提高胺试验的灵敏度，检测操作更客观，有效克服了常规胺试验的 缺点，使胺试验独立应用于BV检测成为可能。但该法可能存在本底显色，对临床检测结果 的判断有一定影响。2.唾液酸苷酶法该法的试剂以以美国INVERNESS公司的试剂为代表。唾液酸苷酶又称神经氨酸苷 酶，是一种存在于溶酶体、细胞质和细胞膜上的酶蛋白，能够水解非还原性的、终端为唾液 酸的多种底物，如糖蛋白类、糖脂类、神经节苷脂类以及多聚糖类，其活性与多种疾病的发 生有关。研究表明，在阴道环境中，唾液酸苷酶活性与BV密切相关，与Amsel法有较高的符 合率，国内外在相关试剂的研发上都做了大量工作，并已有产品用于临床检测。此方法目前 采用的酶底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-α -D-N-乙酰神经氨酸或其盐，为INVERNESS公司 的子公司荷兰SPD公司拥有的专利技术。但是阴道微生态菌群中，普雷沃菌和拟杆菌是唾 液酸苷酶活性增加的主要病原菌，部分加特纳氏菌有此酶活性，而动弯杆菌、消化球菌以及 人型支原体的此酶活性基本不能检出。因此，虽然细菌性阴道病不是单一而是多种厌氧细 菌增多引起的，但是单纯依靠检测分泌物中唾液酸苷酶的活性，必然漏检唾液酸苷酶活性 低的厌氧细菌增多引起的细菌性阴道病。3.脯氨酸氨肽酶法与脯氨酸氨肽酶相关细菌在阴道环境中包括加德纳菌和动弯杆菌，可以说是BV 相关病原体所分泌的特异性标志物，因此可以通过脯氨酸氨肽酶活性的增加来指示BV。虽 然没有文献指示普雷沃菌和拟杆菌的脯氨酸氨肽酶活性如何，但研究表明，解肝素普雷沃 菌(p. h印arinolytica)、动胶普雷沃菌(p. zoogleoformans)禾口隐蔽拟杆菌(B. tectum)无 脯氨酸氨肽酶活性。因此对于单纯由于普雷沃菌和拟杆菌增多引起BV来说，则不能通过检 测脯氨酸氨肽酶活性来指示BV，即该方法从原理上来说存在灵敏度缺陷。4. tttCII氨Jt 禾合检测丨法
此方法是郑州安图绿科生物工程有限公司的专利方法。细菌性阴道病是阴道菌群 失调引起即阴道加特纳氏菌、普雷沃菌、拟杆菌、动弯杆菌、消化球菌、支原体等厌氧生物增 多引起的疾患。普雷沃菌和拟杆菌是唾液酸苷酶活性增加的主要病原菌，部分加德纳菌有 此酶活性，而动弯杆菌、消化球菌以及人型支原体的此酶活性基本不能检出。加德纳菌和动 弯杆菌有脯氨酸氨肽酶，没有资料证明普雷沃菌有此酶活性。因此通过联合检测唾液酸苷 酶和脯氨酸氨肽酶的活性，可以检测绝大多数BV病原菌增多引起的BV，极大程度上减少检 测BV的漏检。

发明内容
本发明人意外发现，在检测生物样品中的唾液酸苷酶时，除了可以用已知的 5-溴-4-氯-3-吲哚- a -D-N-乙酰神经氨酸或其盐作为酶底物，还可以用5_溴_3_吲 哚-α -D-N-乙酉先神经氨酸(5-bromo-3-indoyl- α -D—N—acetyl neuraminicacid)或其盐 作为底物。这种新的底物在唾液酸苷酶的作用下，分解出5-溴-3-吲哚，而5-溴-3-吲哚 在有氧存在时氧化而显兰色或绿色。显色的深浅直接与唾液酸苷酶活力相关。本发明人还发现，如果同时有重氮盐存在，上述化合物的检测灵敏度提高，而且反 应后的显色也呈现红色或紫色。相反，如果没有重氮盐，显色时间拖长。在一些具体实施方 案中，有重氮盐时，显色只需10-15分钟；无重氮盐时，显色需要20-30分钟。因此，本发明涉及这种新的底物5_溴-3-吲哚- a -D-N-乙酰神经氨酸或其盐。 本发明还涉及制备这种化合物的方法。本发明还涉及这种化合物在疾病检测方面的用途， 以及在制备用于检测疾病的试剂盒方面的用途。本发明还涉及一种试剂盒，其包括5-溴-3-吲哚-α -D-N-乙酰神经氨酸或其盐 作为底物。所述试剂盒可用于检测生物样品中的唾液酸苷酶活性。本发明的试剂盒还可包括至少一种选自下组的试剂检测N-乙酰-β -D-氨基己 糖苷酶的试剂，检测脯氨酸氨肽酶的试剂，检测过氧化氢的过氧化物酶试剂，检测白细胞酯 酶的试剂，和PH值指示剂等。在本发明的试剂盒中，选自5-溴-3-吲哚-a-D-N-乙酰神经氨酸，检测N-乙 酰_ β -D-氨基己糖苷酶的试剂，检测脯氨酸氨肽酶的试剂，过氧化物酶试剂，检测白细胞 酯酶的试剂，和PH值指示剂的至少一种试剂固化在固相载体上，优选所述固相载体选自具 有吸附能力的纸和塑料，所述纸例如棉浆纸、木浆纸、甘蔗浆纸和玻璃纤维滤纸。本发明的试剂盒可以是联检卡的形式，其包括卡基体和设置在卡基体上的密封 体。所述的密封体可以为扣合在卡基体上反应区槽口一侧的密封盖，或者为粘合在卡基体 上反应区槽口一侧的密封片。优选地，将所述化合物与重氮盐组合用于检测疾病的方法和试剂盒中。为此，本发 明还涉及一种组合物，其包含上述化合物，还包含重氮盐。同样地，在本发明的试剂盒中，还 可以包含重氮盐。本发明还涉及一种检测疾病的方法，包括将生物样品与所述化合物在有氧条件下 接触。在优选实施方案中，所述接触在有重氮盐的情况下进行。所述样品可以来自阴道。本发明还涉及联合检测方法，包括用5-溴-3-吲哚-α -D-N-乙酰神经氨酸进行 检测，并进行至少一种选自下组的检测Ν-乙酰-β-D-氨基己糖苷酶检测，脯氨酸氨肽酶检测，过氧化氢检测，白细胞酯酶检测，和PH检测等。优选地，所述检测有至少一种在固相 载体上进行。优选所述固相载体选自具有吸附能力的纸和塑料，所述纸例如棉浆纸、木浆 纸、甘蔗浆纸和玻璃纤维滤纸。在本发明的优选方法中，唾液酸苷酶反应可以用肉眼观察显色反应。在其它优选 方案中，选自唾液酸苷酶反应、N-乙酰-β -D-氨基己糖苷酶反应、脯氨酸氨肽酶反应、过氧 化氢反应、白细胞酯酶反应、PH指示的至少一种反应，可通过标本的颜色与各自的标准比色 卡进行比较来判定，或通过机读仪读取标本的颜色来判定。在本发明中，术语“唾液酸苷酶(sialidase) ”与“神经氨酸酶(neuraminidase)，， 可互换使用，是指按照国际生物化学联合会命名委员会(NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry)的命名规则，被分类为 EC. 3. 2. 1. 18 的酶。其 实，这是一个大家族，其中的酶都能水解底物分子的末端唾液酸残基。在人类基因组中迄 今已发现4种同系物，分别被NEU1、NEU2、NEU3、NEU4基因编码。相应地，在本发明中，术语 “5-溴-3-吲哚-α -D-N-乙酰神经氨酸”等同于“5-溴_3_吲哚-唾液酸苷”。本发明提及的重氮盐可以使用本领域已知的那些，例如固紫B，T00S(即N-乙 基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)等。本发明的具体实施方案举例说明如下 Α.将唾液酸苷酶底物5-溴-3-吲哚-α -D-N-乙酰神经氨酸或其盐固化在棉浆 纸、滤纸、玻璃纤维或塑料等固相载体上，也可以直接配成液体试剂使用。B.如果采用酶底物固化到固相载体，用柠檬酸盐溶液等样品稀释液来处理样品； 如果底物采用液体试剂，无需用盐溶液等样品稀释液来处理样品。C.在不使用重氮盐的情况下，观察兰色或绿色的显色；如果需要提高检测的灵敏 度，可以使用重氮盐来增强显色，显色结果为红色或紫色。D.如果不提高检测的灵敏度，可以使用室温检测；如果需要提高检测的灵敏度， 也可以使用加热的方法检测，比如37°C。实施例1制备化合物5-溴-3- B引哚-α -D-N-乙酰神经氨酸以市售唾液酸为原料，经甲酯化，乙酰化、氯化、缩合，脱保护基等反应制得目标产 物。所有的试剂均为市售分析纯，在实验前进一步纯化。合成方法1. N-乙酰神经氨酸甲酯的合成N-乙酰神经氨酸10g，与含有饱和氯化氢气体的无水甲醇IOOmL混合于烧瓶中， 室温下搅拌至原料消失(约需4h)。减压蒸除溶剂，得浅粉白色固体，真空干燥后得产物 12. Og02. N-乙酰神经氨酸甲酯的全乙酰化保护及氯化取唾液酸甲酯(2.0g)于反应瓶中，在氩气保护并搅拌下慢慢加入新蒸乙酰氯 30mL，所得悬浮液再于室温下搅拌24小时，固体溶解。减压蒸去乙酰氯，残余物中加入二氯 甲烷30mL，旋转蒸馏至干，然后加入甲苯10mL，再次旋转蒸馏至干，重复操作2次，残余物真 空干燥后，得白色泡沫状固体产物2. 5g。
3. 5-溴-3-羟基吲哚N-乙酰基全保护神经氨酸甲酯苷的合成 取5-溴-3-羟基-N-乙酰基吲哚1. 0g放入干燥的烧瓶中，加入N，N- 二甲基甲 酰胺(DMF) 15mL，搅拌使其溶解后，加入60% NaH 0. 3g，室温下搅拌30min，加入前步所得 N-乙酰神经氨酸甲酯的全保护氯化物2. 0g，氩气保护下搅拌3小时。在上述反应混合物中 加入200mL水和100mL乙酸乙酯，充分摇勻后静置分层，上层乙酸乙酯溶液用3g无水MgS04 干燥，浓缩溶媒，残余物进行硅胶柱色谱分离(洗脱液为丙酮石油醚=2 3)，得产物
1.3g。4. 5-溴-3-羟基吲哚N-乙酰基神经氨酸苷的合成(脱保护基)取上步全保护苷1. 3g溶于15mL无水甲醇中，加入0. 55g甲醇钠，室温下搅拌，TLC 跟踪，30min后原料消失。旋转蒸除甲醇，残余物中加入0. 1M氢氧化钠20mL，室温下搅拌 30min,反应混合物用乙酸中和至pH 8。制备型HPLC分离纯化得目的物纯品0. 5g。结果得到的样品经1H-NMR和质谱分析为目标化合物。具体是所得产物的1H2NMR(D20，500MHz) 8 :1.92(t，J = 12. 0Hz，1H)，2. 01 (s，3H)，
2.88 (dd, J = 12. 5,4. 5Hz, 1H)，3. 50 3. 70 (m, 2H)，3. 76 (dd, J = 10. 0,2. 0Hz, 1H)，3. 75
3.96(m，4H)，7. 22 (s, 1H)，7. 27 (d, J = 9. 0Hz, 1H)，7. 45 (d, J = 9. 0Hz, 1H)。高分辨质 谱理论分子式为C19H2309N2Br (FAB)，分子量理论计算值应为532. 03 ；实测值分子式为 C19H2309N2Br (FAB)，实测分子量为 532. 025 [M+H] +。实施例2制备检测试剂称取5-溴-3-吲哚-a _D_N_乙酰神经氨酸溶于pH值3的2. 5%葡萄糖溶液中， 使其浓度达到lmg/ml，混合均勻。按15ul/片加到5mm边长的纸片上，干燥过夜。称取固紫B溶于水中，使其浓度达到0. 3%，混合均勻，即得显色剂。实施例3临床检测郑州大学第三附属医院妇科门诊患者212例，通过扩阴器，用无菌拭子采两份阴 道后穹窿分泌物。一份采用Amsel法检测BV，另一份用实施例2制得的检测试剂来检测BV， 以Amsel法为金标准。将阴道分泌物标本用适量的生理盐水稀释后，取一滴(25-50ul)加在实施例2制 得的检测纸片上，再加一滴显色剂后，把纸片放在37°C加热15分钟，读出唾液酸苷酶活性 结果，无色为阴性，红色或紫色为阳性。MM(1)灵敏度AmSel法检出BV阳性标本106例，其中有95例同时用本发明的检测 试剂检测也为阳性，从而得出本发明方法检测BV的灵敏度为89. 60%。(2)特异性AmSel法检出BV阴性标本106例，其中有100例同时用本发明的检测 试剂检测也为阴性，从而得出本发明方法检测BV的特异性为9480%。
权利要求
一种化合物，其是5-溴-3-吲哚-α-D-N-乙酰神经氨酸或其盐。
2.试剂盒，包含权利要求1的化合物
3.权利要求2的试剂盒，还包含重氮盐。
4.权利要求2或3的试剂盒，其中权利要求1的化合物被固相化。
5.权利要求1的化合物用于制备试剂盒的用途。
6.权利要求1的化合物与重氮盐联合用途制备试剂盒的用途。
7.权利要求5或6的用途，其中所述试剂盒用于检测细菌性阴道病。
全文摘要
本发明涉及5-溴-3-吲哚-α-D-N-乙酰神经氨酸或其盐，它们的制备方法，它们用于检测疾病方面和用于制备疾病检测试剂盒的用途。
文档编号C07H7/033GK101863929SQ201010187568
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者付光宇, 吴学炜, 崔晶, 杨帆, 杨洋, 杨红云, 王则宇, 郑业焕, 马建军 申请人:郑州安图绿科生物工程有限公司