专利名称：一种o-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及饲料添加剂领域，尤其是一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂。
背景技术：
无公害畜禽产品的生产已经成为养殖业发展的必然趋势，随着我国养殖业向集约化、规模化发展，畜禽疾病的种类及发病率逐年上升，已成为困扰我国养殖业发展的主要问题，在防止疫病的过程中，由于抗生素、化学合成药物和激素类药物的滥用，导致病原菌产生耐药性、家禽的免疫机能和生产性能下降、药物的残留都损害了畜禽产品的质量。抗生素类药物的耐药性危害不仅表现在药物剂量增大、疗程延长、复发率升高等方面，还表现为引起并发症，使抗生素失去疗效，导致死亡率升高。同时，动物产品的药物残留，也对人类自身的健康造成了严重威胁。因此，研发多功能环保新型饲料添加剂，以达到“药食同源”之效果是十分必要的。
寡糖是指由二到十个单糖单元通过糖苷键连接形成的直链或具支链的-类糖，它对动物的有益效果表现为具有低热、稳定、安全无毒、无残留等良好的理化性质，具有改善畜禽肠道菌群、提高机体免疫力、生长性能等重要的生理作用，同时能够减少粪便及粪便中氨气的排放量，提高动物对营养物质的吸收率。
卡拉胶是一类硫酸化多糖，可通过碱萃取的方式从红藻中获得，具有重复的α-1，4-D-半乳吡喃糖-β-1，3-D-半乳吡喃糖(或3，6-内醚-D-半乳吡喃糖)二糖单元骨架结构。卡拉胶具有多种生物活性，首先它能有效降低血清中低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇和血脂，还可通过形成凝胶吸收胆酸，控制实验性动脉粥状硬化的形成，影响胆固醇的吸收，降血脂作用较其他膳食纤维更明显；其次具有抗病毒活性，这种强负电荷硫酸聚阴离子与病毒或细胞表面正电荷分子结合，从而立体地抑制病毒对细胞的吸附；卡拉胶还具有抗癌活性，它不是通过细胞毒作用，而是可能像其它多糖一样作为一种免疫促进剂，通过作用于某种靶细胞(如促进淋巴细胞的分裂)，并抑制生长调节因子的活性，间接地抑制肿瘤细胞的生长。天然卡拉胶的分子量一股为几十万甚至上百万，如此高的分子量使它们很难通过机体不同的屏障，甚至细胞膜，从而使卡拉胶的生物活性不能得以充分发挥。
卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，分子量较小，溶解性较好，易于吸收，稳定性和安全性都有所改善，同时因分子链上的活性基团充分暴露，使其活性较卡拉胶显著提高，拓宽了卡拉胶的应用领域。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能提高动物免疫力、促进细胞增殖的新型O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂 本发明实现目的的技术方案是 一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，O-酰基卡拉胶寡糖的通式为
而且，所述R1、R2、R3为有机二酸O-酰基。
而且，所述R1、R2、R3分别为-H或
或
或
中的一种。
而且，所述n为2-10之间的整数。
而且，所述卡拉胶寡糖包括任意类型卡拉胶降解后形成的寡糖。
而且，所述O-酰基卡拉胶寡糖添加量占饲料总重量的百分比为0.1％～50.0％。
而且，所述一种O-酰基卡拉胶寡糖的制备方法为如下 (1)将卡拉胶溶于0.05-0.15M盐酸中，于60℃-80℃加热1-5小时后，用0.1MNaOH中和至中性，将溶液在蒸馏水中透析6天，经微孔膜过滤，在真空条件下浓缩； (2)将步骤(1)得到的浓缩液经阳离子交换树脂吸附，再用TBA将该溶液pH调至8，冷冻干燥得到卡拉胶寡糖的TBA盐，将卡拉胶寡糖的TBA盐进一步干燥； (3)将干燥后的卡拉胶寡糖TBA盐溶于DMF中，通入氮气，向溶液中顺序加入4-二甲氨基吡啶、二元有机酸的酸酐和三丁胺，将反应混合物加热到60℃-100℃，并使反应持续6-10小时，然后将混合物在冰水浴中冷却至4℃，将冷的饱和醋酸钠的乙醇溶液加入到该溶液中反应数1-4小时； (4)反应后进行离心沉淀，将沉淀物用无水乙醇洗涤，洗涤后溶于蒸馏水中，将溶液在5％的NaHCO3水溶液中透析两天，在蒸馏水中透析4天，将透析后的溶液冷冻干燥，得到O-酰基卡拉胶寡糖。
本发明的优点和有益效果为 1、本发明提供多种O-酰基卡拉胶寡糖的衍生物，并首次将其作为饲料添加剂在动物饲料中应用，经过多次试验证明本添加剂能够有效提高动物免疫力、促进细胞增殖，并且绿色无毒，可广泛应用于畜禽和水产类养殖，具有广阔的市场前景。
2、本发明涉及的卡拉胶寡糖为卡拉胶降解后的小分子寡糖，以二元有机酸的酸酐为酰化剂，通过二者之间的单酰化反应，在卡拉胶寡糖分子中引入羧基，增大其电荷密度，电荷密度增大后一方面使卡拉胶寡糖能够透过机体的屏障，另一方面可使其免疫增强作用和抗病毒活性提高。
具体实施例方式 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，O-酰基卡拉胶寡糖的制备方法卡拉胶降解后的小分子寡糖，以二元有机酸的酸酐为酰化剂，通过二者之间的单酰化反应，在卡拉胶寡糖分子中引入羧基，具体制备过程如下 卡拉胶寡糖由任意类型卡拉胶经酸降解而获得，具体步骤为将卡拉胶溶于0.1M盐酸中，于60℃-80℃加热1-5小时后，用0.1M NaOH中和至中性，溶液在蒸馏水中透析6天，经微孔膜(GS，0.45m)过滤，在真空条件下浓缩至5-10ml，于4℃将浓缩液通过一个732型(H+)阳离子交换树脂柱(30ml)，再用TBA将该溶液pH调至8，冷冻干燥得到卡拉胶寡糖的TBA盐，于真空、40℃将其TBA盐进一步干燥24小时。
O-酰基卡拉胶寡糖由卡拉胶寡糖与二元有机酸的酸酐经单酰化反应获得，具体步骤为将卡拉胶寡糖的TBA盐溶于DMF中，通入氮气，向溶液中顺序加入4-二甲氨基吡啶、二元有机酸的酸酐(如丁二酸酐)和三丁胺，将反应混合物加热到60℃-100℃，并使反应持续6-10小时，然后将混合物在冰水浴中冷却至4℃，将冷的饱和醋酸钠的乙醇溶液加入到该溶液中，维持4℃达1-4小时；离心沉降，沉淀物用无水乙醇洗涤3次，再将其溶于蒸馏水中，将该溶液在5％的NaHCO3水溶液中透析两天，在蒸馏水中透析4天，将透析后的溶液冷冻干燥，得到O-酰基卡拉胶寡糖。
O-酰基卡拉胶寡糖通式为
其中R1＝H或
或
或
或其他有机二酸类O-酰基； R2＝H或
或
或
或其他有机二酸类O-酰基； R3＝H或
或
或
或其他有机二酸类O-酰基。
其中糖链代表任意类型的卡拉胶寡糖，最佳的卡拉胶寡糖糖链由2-10个糖单元组成； 本O-酰基卡拉胶寡糖添加量占饲料总重量的0.1％～50.0％为宜。
以下是以O-酰基卡拉胶寡糖作为添加剂其他添加剂添加到动物饲料进行的动物实验，针对动物的生长及其他生理情况进行统计和检测，试验结果能够证明本添加剂的有益效果。
对比试验1 O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂对肉仔鸡的生长性能和免疫性能的影响 选取三黄仔鸡90只，按体重、性别相等的原则分成3组，每组30只。设3个重复组，每个重复组10只，其中第Ⅰ组为对照组，饲喂常规鸡饲料，第Ⅱ组为抗生素组，饲喂金霉素添加量为50ppm的饲料，第Ⅲ组为O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂组，饲喂O-酰基卡拉胶寡糖添加量为0.2％(m/m)的饲料，在实验开始时15天、30天分别空腹称重，记录鸡的增重、用料增重比以及每天的采食量。
免疫测试程序为第7天进行传支和新城疫二联苗首免(滴鼻点眼)；第14天进行法氏囊首免(滴鼻点眼)；第21天进行法氏囊二免(饮水免疫)；第28天进行传支和新城疫二联苗二免(饮水免疫)；第38天，每组的每个重复随机选取2只及，无菌心脏采血5ml，分离血清，-20℃保存，测新城疫抗体滴度，测试结果如表1所示。
表1O-酰基卡拉胶寡糖对新城疫疫苗血清抗体滴度的影响(mean±SD)
实验结果表明 1.在日粮中添加0.2％的O-酰基卡拉胶寡糖，可明显提高新城疫抗体滴度的水平(P＜0.05)。
2.在日粮中添加0.2％的O-酰基卡拉胶寡糖能有效提高仔鸡的饲料转化率(4.8％)、日采食量(2.5％)以及平均日增重(7.8％)。
对比试验2 O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂对断奶仔猪生长性能的影响 选取断奶仔猪60头，随机分成2组，每组30头，设3个重复组，每个重复10头。第Ⅰ组为O-酰基卡拉胶寡糖添加组，饲喂O-酰基卡拉胶寡糖添加量为0.2％的饲料；第Ⅱ组为对照组，饲喂常规猪饲料。饲养期为30天。
表2O-酰基卡拉胶寡糖添加剂对断奶仔猪生长性能的影响
注同行肩标字母不同者表示差异显著(P＜0.05) 试验结果如表2所示，表明O-酰基卡拉胶寡糖添加组的日均增重明显高于对照组，而料肉比则明显低于对照组。
对比试验3 O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂对罗非鱼的生长性能和血清SOD活性的影响 选取100克左右的罗非鱼60条，随机分成2组，每组30条，设3个重复组，每个重复10条，第Ⅰ组为O-酰基卡拉胶寡糖添加组，饲喂O-酰基卡拉胶寡糖添加量为0.2％的饲料；第Ⅱ组为对照组，饲喂常规鱼饲料，饲养期为30天。
表3O-酰基卡拉胶寡糖添加剂对罗非鱼的生长性能和血清SOD活性的影响
注同行肩标字母不同者表示差异显著(P＜0.05) 实验结果如表3所示，试验组比对照组的累计增重多8.3克；试验组SOD活性也有明显提高，说明O-酰基卡拉胶寡糖具有较强的抗氧化活性。
权利要求
1.一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，其特征在于O-酰基卡拉胶寡糖的通式为
2.根据权利要求1所述的一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，其特征在于所述R1、R2、R3为有机二酸O-酰基。
3.根据权利要求1或2的一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，其特征在于所述R1、R2、R3分别为-H或
中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，其特征在于所述n为2-10之间的整数。
5.根据权利要求1所述的一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，其特征在于所述卡拉胶寡糖包括任意类型卡拉胶降解后形成的寡糖。
6.根据权利要求1所述的一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，其特征在于所述O-酰基卡拉胶寡糖添加量占饲料总重量的百分比为0.1％～50.0％。
7.根据权利要求1所述的一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，其特征在于所述一种O-酰基卡拉胶寡糖的制备方法为如下
(1)将卡拉胶溶于0.05-0.15M盐酸中，于60℃-80℃加热1-5小时后，用0.1MNaOH中和至中性，将溶液在蒸馏水中透析6天，经微孔膜过滤，在真空条件下浓缩；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液经阳离子交换树脂吸附，再用TBA将该溶液pH调至8，冷冻干燥得到卡拉胶寡糖的TBA盐，将卡拉胶寡糖的TBA盐进一步干燥；
(3)将干燥后的卡拉胶寡糖TBA盐溶于DMF中，通入氮气，向溶液中顺序加入4-二甲氨基吡啶、二元有机酸的酸酐和三丁胺，将反应混合物加热到60℃-100℃，并使反应持续6-10小时，然后将混合物在冰水浴中冷却至4℃，将冷的饱和醋酸钠的乙醇溶液加入到该溶液中反应数1-4小时；
(4)反应后进行离心沉淀，将沉淀物用无水乙醇洗涤，洗涤后溶于蒸馏水中，将溶液在5％的NaHCO3水溶液中透析两天，在蒸馏水中透析4天，将透析后的溶液冷冻干燥，得到O-酰基卡拉胶寡糖。
全文摘要
本发明涉及一种O-酰基卡拉胶寡糖饲料添加剂，O-酰基卡拉胶寡糖母体为卡拉胶降解后形成的寡糖，以二元有机酸的酸酐为酰化剂，通过二者之间的单酰化反应，在卡拉胶寡糖分子中引入羧基，增大其电荷密度，电荷密度增大后一方面使卡拉胶寡糖能够透过机体的屏障，另一方面可使其免疫增强作用和抗病毒活性提高。本发明提供多种O-酰基卡拉胶寡糖的衍生物，首次将其作为饲料添加剂在动物饲料中应用，经过多次试验证明本添加剂能够有效提高动物免疫力、促进细胞增殖，并且绿色无毒，可广泛应用于畜禽和水产类养殖，具有广阔的市场前景。
文档编号C07H1/00GK101816377SQ20101019467
公开日2010年9月1日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者丛方地, 苏永鹏, 刘志辉, 黄健, 王洪杰, 姜云鹏 申请人:施瑞客(天津)生物技术有限公司, 天津农学院