专利名称：一种从牡蛎中同步提取制备牛磺酸和生物锌及多肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物锌、牛磺酸、多肽等三种活性物质的提取分离制备，尤其涉及一种 从牡蛎中同步提取这三种活性物质的方法。
背景技术：
牡蛎是暖水性双壳类软体动物，其肉质鲜美，营养丰富，它富含糖元、蛋白质、氨基 酸、维生素、生物锌、微量元素等成分，具有很高的营养价值。牛磺酸是牡蛎中含量最高的氨基酸之一。牛磺酸又称为2-氨基乙磺酸，是一种非 蛋白质结构的特殊氨基酸，是人体必需的重要氨基酸之一，以游离氨基酸的形式普遍存在 于动物体内的各种组织。牛磺酸是氧化损伤的保护剂，能清除氧自由基、抑制脂质过氧化、 维持细胞渗透稳定细胞膜、调节细胞钙稳定，同时还是中枢性神经递质，可调节中枢神经系 统。在心血管系统中有心肌保护、抗心律失常等作用。牛磺酸在保护缺血脑细胞，预防白内 障，降低血糖水平，降血脂，降血压，防止动脉粥样硬化以及预防老年疾病方面也起到了重 要的作用。目前国内外主要依靠化学合成制取牛磺酸，但存在原料毒性大和环境污染等严 重问题。而牡蛎产量高，牛磺酸含量丰富，无疑成为安全的天然牛磺酸资源之一。牡蛎中含有许多有效成分并未损失的锌，而锌作为一种人体必需的微量元素，在 体内具有多种生理功能，对小孩的生长发育至关重要，可以活化生物体内300多种的酶、促 进机体发育及骨骼生长、调节细胞内酸碱平衡、促进味觉嗅觉的正常形成、维持皮肤健康、 增强免疫机能、防止老化等。当体内缺乏锌时，将出现发育不全或发育迟缓、味觉障碍、骨骼 生长缓慢、免疫力下降、先天性畸形等症状。锌参与机体蛋白质与核酸的代谢，对神经细胞 至关重要，也是维持男性生殖系统健康的重要营养。生物活性肽具有特殊的生理活性，主要体现在免疫活性、抗高血压、抗血脂、促生 长活性、肿瘤抑制性活性等，常以非活性形式存在于构成蛋白质的氨基酸长链中。牡蛎中蛋 白质等营养成分含量很高，是制备肽类功能性食品的良好海洋资源，通过生物工程技术，可 从牡蛎中提取制备水溶性的牡蛎多肽。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种采用超声波破碎、离子交换、双酶水解、冷冻干 燥等先进技术同步从牡蛎中提取生物锌、牛磺酸、多肽等三种活性物质的方法。本发明采用的技术方案包括以下步骤a.生物锌的提取将牡蛎肉放入容器中，加入1 3倍体积的纯水，然后用超声波 破碎仪进行破碎，功率为60w 80w，时间为15 25min。由于生物锌主要是游离存在于牡 蛎鲜肉中，此时采用超声波直接破碎整块的牡蛎鲜肉即可提取出来，部分游离氨基酸也同 时被提取出来。b.生物锌的分离浓缩将所述的经超声波破碎后的牡蛎液离心分离取上清液，将 上清液旋转蒸发进行浓缩，然后通过冷冻干燥的方式可得到生物锌的浓缩粉末，冻干温度为-30 0C οC.制备牡蛎浆液在所述的牡蛎肉中加入1 3倍体积的纯水，捣碎勻浆。d.水煮提取牛磺酸由于牛磺酸为水溶性小分子，主要是游离分布于细胞内，因 此将牡蛎勻浆后水煮即可提取出来。将牡蛎浆液控制在60°C蒸煮2h。将所述的牡蛎浆液离 心取上清液，然后再加入1 3倍体积纯水，60°C蒸煮后取上清，重复3次，将上清液合并。e.牛磺酸的浓缩将所述的上清液采用旋转蒸发的方式减压浓缩，得浓缩液。f.牛磺酸粗提液的制备由于提取液中除牛磺酸还含有蛋白质、多糖、无机盐类 等杂质成分，因此需要对样品进行纯化在所述的浓缩液中加入相当于浓缩液十分之一体 积的三氯乙酸溶液，浓度为10%。静置后沉淀取上清，然后将上清液调PH至4 5。g.树脂吸附纯化将所述的上清液用活化后的阳离子交换树脂进行提纯，用蒸馏 水洗脱，收集牛磺酸部分的层析液。h.牛磺酸的结晶纯化将所述的层析液用旋转蒸发仪进行减压浓缩后，加入无水 乙醇，使乙醇的终浓度达到60% 70%，然后于4°C静置结晶，即得牛磺酸晶体，多次重结 晶后可得到高纯度的白色针状结晶，经干燥处理即得高纯度的天然牛磺酸。i.多肽的制备①在步骤d中离心得到的牡蛎碎肉中，加入3倍体积的纯水。调 节pH至6. 0 8. 5，加热至40 55°C后加入碱性蛋白酶或中性蛋白酶，蛋白酶的加入量为 牡蛎蛋白浓度的4% 8% (质量比)。酶解时间控制在2h，整个过程中温度和pH保持不 变。酶解完成后将酶解液加热至90°C 95°C，保持lOmin，灭酶。j.多肽的制备②将所述的酶解液pH调整至3. O 5. 0，保持温度在40°C 55°C 时加入酸性蛋白酶，蛋白酶的加入量为牡蛎蛋白浓度的4% 8% (质量比)。酶解时间控 制在2h，整个过程中温度和pH保持不变。酶解完成后将酶解液加热至90°C 95°C，保持 IOmin,灭酶。k.多肽的分离将所述的二步酶解液离心分离，取上清液，调节PH至6. O 7. O。 然后通过旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，即得多肽浓缩液。将多肽浓缩液进行冻干处理即得粉 末状的牡蛎多肽。所述的i步骤所用的蛋白酶可以为胰蛋白酶也可以为木瓜蛋白酶也可以为中性 蛋白酶，优选取为胰蛋白酶。在所述的制备浆液的过程中，所述的牡蛎肉和纯水的体积比优选为1 3。在所述的超声波破碎过程中，所述的超声波的优选功率为80w，所述的处理时间优 选为20mm。本发明的优点在于可以从一批牡蛎中同时分离制备三种牡蛎活性物质，通过超声 波的破碎作用提取高含量的氨基酸锌(生物锌)，通过离子交换制备高纯度的天然牛磺酸， 而在多肽的制备中则采用双酶水解的方式，不仅水解度高，而且可以得到高含量氨基酸和 多肽，充分利用了牡蛎中的有效成分，为今后牡蛎在食品、饮料添加等方面的应用奠定了基 石出。
具体实施例方式实施例1一种从牡蛎中提取制备生物锌、天然牛磺酸、多肽的方法，包括以下步骤
a.生物锌的提取称取IOOOg的牡蛎肉，放入容器后加入3000g的纯水后用超声 波破碎仪进行破碎，功率为80w，时间为20min。b.生物锌的分离浓缩将破碎后的牡蛎液离心分离取上清液，将上清液旋转蒸发 进行浓缩，然后在_30°C进行冷冻干燥处理，得到生物锌粉末11. 19g，其中含锌为63. 02%, 游离氨基酸12. 83%。c.制备牡蛎浆液在离心分离后的牡蛎肉中加入3000g的纯水，捣碎勻浆。d.水煮提取牛磺酸将牡蛎勻浆液控制在60°C蒸煮2h。将蒸煮后的牡蛎浆液离 心取上清液，然后再加入3000g的纯水，60°C蒸煮后取上清，重复3次，将上清液合并。e.牛磺酸的浓缩将合并后的上清液采用旋转蒸发的方式减压浓缩，得浓缩液。f.牛磺酸粗提液的制备在浓缩液中加入相当于浓缩液十分之一体积的三氯乙 酸溶液，浓度为10%。静置后沉淀取上清，然后将上清液调PH至4 5。g.树脂吸附纯化将处理后的上清液用活化后的阳离子交换树脂进行提纯，用蒸 馏水洗脱，收集牛磺酸部分的层析液。h.牛磺酸的结晶纯化将层析液用旋转蒸发仪进行减压浓缩后，加入无水乙 醇，使乙醇的终浓度达到60%，然后于4°C静置结晶，经重结晶和干燥处理后得到牛磺酸 3. 02g，纯度为 98. 0%oi.多肽的制备①在步骤d中离心得到的牡蛎碎肉中，加入3000g的纯水。调节 PH至8.0，加热至55°C后加入胰蛋白酶，蛋白酶的加入量为牡蛎蛋白浓度的6% (质量比)。 酶解时间控制在2h，整个过程温度保持在55°C，不断加入NaOH溶液保持溶液的pH稳定在 7. 5 8. 5。酶解完成后将酶解液加热至95°C，保持lOmin，灭酶。j.多肽的制备②将上述酶解液的pH调整至3. 0，保持温度在45°C时加入酸性蛋 白酶，蛋白酶的加入量为牡蛎蛋白浓度的6% (质量比)。酶解时间控制在2h。酶解完成后 将酶解液加热至95°C，保持lOmin，灭酶。k.多肽的分离将二步酶解液离心分离，取上清液，调节PH至6. O 7. O。然后通 过旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，即得多肽浓缩液。将多肽浓缩液进行冻干处理即得粉末状的 牡蛎多肽产品61. 87g，其中含多肽31. 04%，游离氨基酸13. 41%。实施例2与实施例1基本相同，所不同的在于超声波处理过程中，超声波的功率为70w，处 理时间为25min ；在多肽制备中的第一步酶解过程中加入的酶为木瓜蛋白酶，温度控制在 55°C，pH为6. O。最后得到生物锌10. 25g，其中含锌为58. 29%，游离氨基酸13. 50% ；牛磺 酸2. 95g，纯度为97. 5% ；多肽产品65. 70g，其中含多肽38. 57%，游离氨基酸10. 54%。实施例3 与实施例1基本相同，所不同的在于提取生物锌、制备浆液、制备多肽时，均加入 2000g的纯水。最后得到生物锌8. 55g，其中含锌60. 40%，游离氨基酸11.20% ；牛磺酸 1. 53g，纯度为98. 5% ；多肽产品58. 75g，其中含多肽36. 65%，游离氨基酸12. 70%。实施例4 与实施例1基本相同，所不同的在于超声波的处理时间为15min，制备多肽时采 用PROTAMEX复合蛋白酶进行一步水解，温度控制在60°C，pH控制在7. 0，酶解反应时间为 4h。最后得到生物锌9. 36g，其中含锌55. 60%，游离氨基酸10. 29%;牛磺酸2. 73g，纯度为
598.0% ；多肽产品43. 76g，其中含多肽23. 40%，游离氨基酸9. 35%。实施例5 与实施例1基本相同，所不同的在于超声波的破碎功率为60w，牛磺酸结晶是采用 的乙醇浓度为70%，在多肽制备中的第一步酶解过程中加入的酶为中性蛋白酶，温度控制 在45°C，pH为7. 0。最后得到生物锌7. 38g，其中含锌55. 70%,游离氨基酸9. 28%；牛磺酸 1. 84g，纯度为97. 8% ；多肽产品60. 75g，其中含多肽34. 05%，游离氨基酸12. 47%。
权利要求
一种从牡蛎中同步提取生物锌、牛磺酸和多肽的方法，包括超声波破碎提取生物锌的步骤，水煮法结合离子交换分离纯化牛磺酸的步骤，双酶水解制备多肽的步骤，其特征在于采用水煮法提取牛磺酸时采用的温度为60℃，接取牛磺酸层析液的最佳电导率范围为900～78(μs/cm)；双酶水解制备多肽时，首先使用中性或碱性蛋白酶，然后采用酸性蛋白酶进行酶解，酶解过程中加酶量均为蛋白含量的4％～8％(质量比)；提取得到的生物锌浓缩粉末和多肽浓缩液采用 30℃冷冻干燥的方法进行保藏。
2.如权利要求1所述的方法，所述碱性蛋白酶优选胰蛋白酶。
3.如权利要求1所述的方法，所述加酶量优选为蛋白含量的6%(质量比)。
全文摘要
本发明公开了一种从牡蛎中提取制备牛磺酸、生物锌、多肽的方法，通过超声波破碎，分离牡蛎肉中的生物锌和游离氨基酸；将牡蛎肉匀浆后水煮可使牛磺酸从细胞内释放出来，通过树脂纯化、浓缩结晶即可得到高纯度的牛磺酸；采用双酶水解的方式水解剩余牡蛎肉，可得到富含多肽的牡蛎提取物。该提取方法不仅极大程度保留了牡蛎中的天然活性物质，而且因其中不含易致过敏的蛋白和嘌呤，解决了导致部分人群不适用的问题，为牡蛎提取物在饮料或食品中的应用开发奠定了基础。
文档编号C07C227/40GK101914043SQ20101023445
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者何碧娟, 庄军莲, 柯珂, 王一兵, 王俊, 邱绍芳 申请人:广西科学院