专利名称：三萜皂苷类化合物、用途及制备方法
技术领域：
本发明涉及三萜皂苷类化合物、用途及制备方法，具体涉及从豆科植物含羞草亚 科榼藤属榼藤子中分离得到的化合物Phaseoloideside D,Phaseoloideside E及其医药用 途和制备方法。
背景技术：
榼藤子(Entada phaseoloides (Linn. )Merr.)，属豆科含羞草亚科榼藤属，常绿木 质大藤本，茎扭旋，枝无毛；二回羽状复叶，长10-25cm，通常有羽片2对，顶生一对羽片变为 卷须；小叶2-4对，革质，长椭圆形，长3-8. 5cm,宽1. 5-4cm,先端钝，微凹，基部略偏斜，无 毛。主要分布于我国福建、广西、云南等地，其主要含有榼藤酰胺类、三萜皂苷类成分，具有 治疗胃病、痔疮、便秘等的功效。以下文献报道的榼藤子同属植物中所含有的三萜皂苷类成分具有一定的抗 月中瘤活性Laurence KN, Luciano B, Remy BT et al. Rheediinosides A and B, two antiproliferativeand antioxidant triterpene saponins from Entada rheedii. Phytochemistry. 2010,71 :254_261 ；Giuseppina C, Fabrizio D P, Paolo De C, et al.Antiproliferative TriterpeneSaponins from Entada africana J. Nat. Prod. 2006, 69,1323-1329. ；Azefack L Τ,TomofumiM,Mirjolet, J F. Pursaethosides A-E,Triterpene Saponins from Entada pursaetha· J· Nat· ProcL 2005，68，1185—1190。榼藤子中含有的总皂苷物对小鼠S180实体瘤也有明显的抑制作用，能明显延长 艾氏腹水瘤小鼠生存时间(榼藤子水溶性提取物对小鼠移植瘤S180的抑制作用，许腾 等，中国药师，2006，9(5) 397-399)；榼藤子水溶性提取物对人类慢性髓性白血病细胞株 (K562)、人类淋巴瘤细胞株(U937)和人早幼粒白血病细胞株(HL60)也有较强的抑制作用 (榼藤子水溶性提取物的体外抗肿瘤作用，许腾等，华西药学杂志，2005，20(6) 487-489)。梅之南、熊慧等人(《榼藤子含硫酰胺类化学成分的研究》，《药学学报》2010， 45(5) 624-626)公开了利用正反相硅胶柱色谱、制备HPLC分离纯化榼藤子种仁的化 学成分，从70%乙醇提取物的正丁醇萃取部位分离得到4个含硫酰胺类化合物，分别为 entadamide A- β -D-glucopyranosyl- (1 — 3)- β-D-glucopyranoside (1)、entadamide A(2)、entadamide A- β -Dglucopyranoside (3)和 clinacoside C(4)。张勇等人(《榼藤子 种仁化学成分研究》，《中国药学杂志》2008年7月第43卷第14期)公开了通过S印hadex LH-20等分离纯化，通过理化常数测定和现代波谱学技术进行结构鉴定后，分离得到8个化 合物，分别为2，5- 二羟基苯乙酸乙酯、2，5- 二羟基苯乙酸甲酯、5-羟基-苯并呋喃-2酮、 榼藤酰胺A、硬脂酸甲酯、β-谷甾醇、胡萝卜苷和豆甾醇。中国专利CN 101486650Α公开 了一种从豆科榼藤属植物榼藤中制备2，5-二羟基苯乙酸乙酯、2，5-二羟基苯乙酸甲酯、2， 5-二羟基苯乙酸正丁酯的方法，以及这些化合物在制备抗HIV药物中的应用。然而，目前还没有研究人员报道有关榼藤子中所含的皂苷类化合物 Phaseoloideside D 禾口 Phaseoloideside E0
发明内容
本发明的目的之一是提供从豆科植物含羞草亚科榼藤属榼藤子中分离得到的化 合物 Phaseoloideside D、Phaseoloideside E0发明人从生长于中国云南西双版纳地区的榼藤子种仁中提取分离到的两种新的 皂苷类化合物，分别命名为Phaseoloideside D 3-0- β -D-glucopyranosyl-(l 一 4) - [ β -D-xylopyranosyl- (1 一 3) - α -L-arabin opyranosyl-(l 一 6) ] -2-acetylamino-2-deoxy- β -D-glucopyranosylentagenic acid28_0 -β -D-apiofuranosyl-(l 一 5) _0_ β -D-apiofuranosyl- (1 一 2) -2-acetyl-2-deoxy-0- β -D-glucopyranoside ；禾口 Phaseoloideside E 3-0- β -D-glucopyranosyl-(l 一 4) - [ β -D-xylopyranosyl- (1 一 3) - α -L-arabin opyranosyl-(l 一 6) ] -2-acetylamino-2-deoxy- β -D-glucopyranosylentagenic acid28_0 -β -D-apiofuranosyl-(1 一 3) _0_ β -D-xylopyranosyl- (1 一 2) -2-acetyl-2-deoxy-0- β -D-glucopyranoside0其化学结构如下 本发明的目的之二是公开Phaseoloideside D或Phaseoloideside E在制备抗肿 瘤药物中的应用。
发明人通过体外实验证实，Phaseoloideside D对SHG-44 (人神经胶质瘤细胞)、 SW480 (结肠癌细胞)、HepG-2 (肝癌细胞)、Ec-109 (食管癌细胞)、MCF-7 (人乳腺癌细胞) 显示出明显的抑制作用，Phaseoloideside E对癌细胞株SHG-44、SW480、HepG-2显示出明 显的抑制作用。可见，本发明的三萜皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E具有明显的抑制肿瘤的效果。本发明的目的之三是提供榼藤子中提取分离Phaseoloideside D、 Phaseoloideside E 的方法。发明人通过大量试验摸索后，获得了两种高效的提取分离Phaseoloideside D、 Phaseoloideside E 的方法。第一种制备化合物Phaseoloideside D、Phaseoloideside E的方法的步骤如下(1)制备总皂苷提取物将榼藤子种仁干品烘干粉碎，用60 70%的乙醇室温浸 提3 7次，每次24h，浓缩提取液得浸膏；用体积比为9 1的甲醇-水溶液溶解浸膏，用 等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后，将正丁醇萃取物，通过硅胶柱层析，用二氯 甲烷-甲醇溶液梯度洗脱进行分离，收集洗脱液，减压回收溶剂，得总皂苷提取物；(2)分离将上述含总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯甲醇为洗脱剂梯 度洗脱，收集含三萜皂苷的流份，再经ODS柱层析，以甲醇水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集 所述化合物的流份，再经硅胶柱层析，以氯仿甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集所述化合 物的流份，再经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈水的体积比2.8 7.2的流动相进行 洗脱，收集含Phaseoloideside D,Phaseoloideside E的流分，回收溶剂即得所述化合物纯 品Phaseoloideside D和Phaseoloideside E。经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种 先进的二位核磁共振波谱的解析，确定了 Phaseoloideside D和Phaseoloideside E的化 学结构和立体构型。第二种制备化合物Phaseoloideside D、Phaseoloideside E的方法的步骤如下(1)将榼藤子种仁干品烘干粉碎，用60-70%的乙醇室温浸提3-7次，每次24h，浓 缩提取液，然后用石油醚脱脂，将脱脂的浸膏经正丁醇萃取、乙醇复溶，真空干燥后，再溶于 甲醇-水溶液，通过大孔树脂，用乙醇_水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得总 皂苷提取物；(2)分离将上述含总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯-乙醇-水为洗 脱剂梯度洗脱，收集含三萜皂苷的流份，再经ODS柱层析，以甲醇水为洗脱剂进行梯度 洗脱，收集含所述化合物的流份，再经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈水的体积比 2.8 7. 2的流动相进行洗脱，收集含Phaseoloideside D,Phaseoloideside E的流分，回 收溶剂即得所述化合物纯品Phaseoloideside D和Phaseoloideside E。经多种现代光谱 分析，特别是综合应用多种先进的二位核磁共振波谱的解析，确定了 Phaseoloideside D和 Phaseoloideside E的化学结构和立体构型。本发明公开的化合物可以作为抗肿瘤药物的先导化合物，为研制新的抗肿瘤药物 提供了一种新的思路，对开发利用中国的民族药用植物资源具有重要意义。
具体实施例方式以下通过优选实施例进一步描述本发明，然而本发明范围不仅仅限于下列实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。实施例1三萜皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E的制备1、提取分离与纯化方法将干燥榼藤子药材去壳得榼藤子仁，晒干，粉碎称重8000克，再用4倍量70%的 乙醇室温浸泡提取3次，每次24h，将浸取液减压浓缩，得半透明浸膏518g。用体积比为 9 1的甲醇_水混合溶剂溶解浸膏，用等体积的石油醚反复萃取，至石油醚层基本无色， 将浸膏溶于水中，用等体积的乙酸乙酯反复萃取至乙酸乙酯层基本无色，再用等体积的正 丁醇反复萃取至正丁醇层基本无色，合并正丁醇层并减压浓缩得半透明流动浸膏129g。并 将正丁醇部位作为主要分离部分，进行硅胶柱层析，选用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，收 集含皂苷的洗脱液，减压回收溶剂，得含总皂苷提取物38. 15克。将含总皂苷进行硅胶柱 层析，以乙酸乙酯甲醇为洗脱剂洗脱，收集含三萜皂苷的洗脱液，减压回收溶剂得三萜皂 苷18. 59克。将该三萜皂苷进行ODS柱层析，以甲醇水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含化 合物Phaseoloideside D及Phaseoloideside E的流份，再经硅胶柱层析，以氯仿甲醇为 洗脱剂进行梯度洗脱，收集化合物Phaseoloideside D及Phaseoloideside E的流份，最后 经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈水的体积比2. 8 7.2的流动相进行洗脱，即得 Phaseoloideside D 纯品 0. 3 克，Phaseoloideside E 纯品 0. 35 克。2、化合物结构鉴定Phaseoloideside D 为白色无定形粉末，Lieberman—Burchard 反应禾口 Molish 反 应均为阳性经测定，分子式 C72H115NO37, [a ]d20-41(c 0· 63，MeOH)，FAB-MS m/z 1586[Μ_ Γ， 1453[Μ-132-1Γ，1423[Μ-162-1Γ，1321 [Μ-132-132-1Γ，1117 [Μ-162-132-132-42-1Γ ；HR ESI-MS 给出准分子离子峰 m/z 1608. 7082 [M+Na] +(Calc Mass 1608.7040)。Phaseoloideside D 白勺g丰勾 ζ^ Τ"
3114.28 (1H,III )78.70 dC-4114114.10 (HI,m )71.53 dC-311, C-5"5114.20 (IHjm )78.71 dC-4116"4.48 (1H,m )，4.32 (1H,m )62.30 tC-5TTα -L-ara Im5,.25 (J =6 5 )103,.50 dC-612m4..48 (1H，m )73.21 dC-Im3m4.53 (1H,m )83.34 dC-Ic-2m4ιπ4,.23 (1H,m )68.90 dC-3m, C-5m5m3.52 (1H,m )，4.20 (1H,m )66.36 tC-4111β-D-xyl 1"4.82(1H,d,J=7 4)107. 8dC-31112"4.04 (1H,m )76.54 dC-Iiv3"4,.13(1H,m )78.04 dC-5"4"4.28 (HI,m )70.98 dC-4V5"3.50 (1H,t-like m ))，4.60 (1H,67.50 tC-3"', C-4"C-28β-D-glc6.14(III，d，J=7.5 )94.24 dC-3V, C-282T4.25 (1H,,TTl )78.89 dC -3"3T4.20 (1H,,m )78.70 dC-2V4T4.24 (1H,,III )70.90 dC-3V，C-5V5T3.99 (HI,,m )78.16 dC-3V6T4.36 (1H,t-like m ))，4.28 (1H,64.80 tC-SvMe(Ac)1,.91( 3H,s )20.76 q-CO-, C-6"Ac-170,.85 s-apiIw6.38(1H,d,J=3.5 )no..86 dC-2V2W4.76 (1H,m )78.OO dC-Iw Phaseoloideside E 为白色无定形粉末，Lieberman—Burchard 反应禾口 Molish 反 应均为阳性经测定，分子式 C72H115NO37, [a ]d20-41(c 0· 63，MeOH)，FAB-MS m/z 1586[Μ_ Γ， 1453[Μ-132-1Γ，1423[Μ-162-1Γ，1321 [Μ-132-132-1Γ，1117 [Μ-162-132-132-42-1Γ ；HR ESI-MS 给出准分子离子峰 m/z 1608. 7019 [M+Na] +(Calc Mass 1608.7040)。Phaseoloideside E 的结构式如下 Phaseoloideside E 的 1H-NMR, 13C-NMR 及 HMBC 数据如表 2。表2 Phaseoloideside E 的1H_WR，13C-WR 及 HMBC 数据(in C5D5N, δ ppm)
29098(3H,s )33.37 s30112(3H,S )24.53 q-D-glc I15.08 ( overlapping )10460 d214.45(m，m )，59.00 d31414(1H,m )74.79 d41485(1H,m)80.94 d51430(1H,m )78.56 d614.50(2H,m )68.27 dMe NHAc)2.13(3H,s )23.76 qNHAc-170.13-D-glc In5. 52(1H, d,J=7.9 )104 47 d2n3.98(1H,m )75.00 d3n4.28(1H,m )78.10 d4n4.10(1H,m )71.64 d5n4.20(1H,m )78.40 d6n4. 46 ( 1H,m)，4.30 (1H, m )62.37 t-L-ara Iin524(J =6.5 )10350 d2m411( 1H,m )73.87 d3m4.24(1H,m )83.90 d4m423 ( 1H,m )68.91 d5ΙΠ3. 52 ( 1H,m),4. 21 (1H, m )66.37 t-D-xyl 1"4. 80(1H, d,J =76)10790 d2"4.04(1H,m )76.56 d3"413 ( 1H,m )78.04 d4"4.28(1H,m )70.97 d5"3. 50 ( 1H, t-like )，4. 66(1H, m )67.50 t
33. 37 s C-20，C-21，C-_L9, C-30 24.53 q C-29, C-21, C-19, C-30
C-3
C-I1, C-31 C-41
C-21，C-31， C-61 C-51
-CO-
C-
C-41
C-411 C-411
C-311, C-511
C-4I] C-5I]
C-61
C-In
C-Iiv, C-2111
C-3111, C_5m
C-4m
C-3m
C-l" C-5" C-4V C-3", C-4IV
glc glucopyranosyl ； ara: arabinopyranosyl； xyl xylopyranosyl； api apiofuranosyl实施例2三萜皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E的制备将榼藤子种仁晒干，粉碎称重10000克，用5倍量的70%乙醇室温浸提7次，每 次24h，浓缩提取液，进而用石油醚脱脂，将脱脂的浸膏经正丁醇萃取后，用可溶于乙醇的 水层成分，经真空干燥后(干重345克)，再溶于体积比为9 1的甲醇-水溶液，通过 大孔树脂，用水和乙醇梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得总皂苷提取物 61.61克。总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯甲醇水为洗脱剂梯度洗脱，收 集含该三萜皂苷的流份，经ODS柱层析，以甲醇水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含化合物Phaseoloideside D及Phaseoloideside E的流份，再经半制备高效液相色谱法分离，以乙 腈水的体积比2.8 7.2的流动相进行洗脱，即得Phaseoloideside D纯品约0. 5克， Phaseoloideside E 纯品约 0. 55 克。实施例 3Phaseoloideside D 和 Phaseoloideside E 对肿瘤细胞的影响试验所用细胞株为国际通用的肿瘤细胞株，即SHG_44(人神经胶质瘤细胞)、 SW480 (结肠癌细胞)、!fepG-2 (肝癌细胞)、Ec_109 (食管癌细胞)、MCF_7 (人乳腺癌细胞)。Phaseoloideside D及Phaseoloideside E对体外培养的癌细胞细胞分化诱导作 用——MTT法其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性 的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能 溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在492nm波长处测定其光吸收值，可求出抗癌药物 作用的癌细胞数量变化，一次求出细胞的存活率，由IC50判断细胞对抗癌药的敏感程度。 根据细胞生长速率，将处于生长对数期的肿瘤细胞以100 μ 1/孔接种于96孔板，贴壁生长 24h，吸去上清液后加入100 μ 1/孔。每个浓度设6个复孔，并设未加药液的培养基对照及 无细胞调零孔。肿瘤细胞在37°C、5% CO2培养箱中培养24小时，然后每孔加入10 μ 1 MTT, 培养箱中继续培养4h，取出，吸去上清液，加入DMSO 150 μ 1/孔，酶标仪492nm波长下测OD 值，实验结果见表3:表3 Phaseoloideside D对肿瘤细胞的抑制作用IC50 ( μ Μ) IC50 表示本发明化合物的半数有效抑制浓度上述实验结果表明，PhaseoloidesideD 对 SHG-44, SW480,HepG-2,Ec-109,MCF-7 显示明显的抑制作用，Phaseoloideside E对SHG_44、SW480、!fepG-2显示明显的抑制作用。 可见，本发明的三萜皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E具有明显的 抑制肿瘤的效果。
权利要求
三萜皂苷类化合物，结构式如下FDA0000023598500000011.tif
2.三萜皂苷类化合物，结构式如下
3.权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求2所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求1或2所述化合物的制备方法，包括如下步骤(1)将榼藤子种仁干品烘干粉碎，用60-70%的乙醇室温浸提3-7次，每次24h，浓缩提 取液得浸膏；用体积比为9 1的甲醇-水溶液溶解浸膏，用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正 丁醇依次萃取后，将正丁醇萃取物通过硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，收集 洗脱液，减压回收溶剂，得总皂苷提取物；(2)将所述总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱剂洗脱，收集 含三萜皂苷的流份，再经ODS柱层析，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含所述化合 物的流份，再经硅胶柱层析，以氯仿_甲醇溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集所述化合物的 流份，再经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈水的体积比2.8 7.2的流动相进行洗脱 后得所述化合物。
6.权利要求1或2所述化合物的制备方法，包括如下步骤(1)将榼藤子种仁干品烘干粉碎，用60-70%的乙醇室温浸提3-7次，每次24h，浓缩 提取液，然后用石油醚脱脂，将脱脂的浸膏经正丁醇萃取、乙醇复溶，真空干燥后，再溶于甲 醇_水溶液，通过大孔树脂，用乙醇_水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得总皂 苷提取物；(2)将上述总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯-乙醇-水为洗脱剂梯度洗脱， 收集含三萜皂苷的流份，再经ODS柱层析，以甲醇水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含所述 化合物的流份，经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈水的体积比2. 8 7. 2的流动相进 行洗脱后得所述化合物。
全文摘要
三萜皂苷类化合物、用途及制备方法，本发明涉及从豆科植物含羞草亚科榼藤属榼藤子中分离得到的化合物Phaseoloideside D、Phaseoloideside E及其医药用途和制备方法。体外抗肿瘤试验表明，化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E对SHG-44(人神经胶质瘤细胞)、SW480(结肠癌细胞)、HepG-2(肝癌细胞)、Ec-109(食管癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)有较强的抑制作用，可为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，对开发利用中国的民族药用资源具有重要价值。
文档编号C07J63/00GK101899082SQ20101023407
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者李效宽, 杨光忠, 梅之南, 熊慧 申请人:中南民族大学