专利名称：一种鱼类神经肽nplp基因、编码的蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种鱼类神经肽NPLP基因、编码的蛋白及其 应用。
背景技术：
脊椎动物的生殖活动主要受“脑/下丘脑_脑垂体_性腺”轴调控。脑垂体分泌产 生的GtH在脊椎动物的生殖调控中起了主导作用，因此，对于GtH分泌的调节，一直以来都 是生殖生理科学家们研究探索的重点。近年来，在对GtH分泌的正调节方面取得了突破性 的进展。在2003年，两个独立的研究小组分别发现kissp印tin和它的受体突变会使人类的 性腺功能减退和青春期迟滞，而进一步在kissp印tin或GPR54基因敲除的小鼠中也发现类 似的表型。Kissp印tin通过调控GnRH的释放，从而刺激脑垂体GtH的合成与释放，进而调控 各种生殖活动。最近的研究表明TAC3及TACR3的突变也会导致人类青春期迟滞，表明TAC3/ TACR3是人类生殖轴中的重要调节因子。以上这些神经内分泌信号系统的发现，极大地拓展 了人类对生殖神经内分泌网络调控的认识。在内分泌网络中，双重调控现象普遍存在。但 是，一直以来，对GtH负调控的因子却知之甚少。我们发现在斑马鱼、青鏘、河飩等硬骨鱼类 kiss2基因的旁侧中存在着一个可能编码神经肽的新基因。通过基因同线性分析，我们发现 这个基因亦存在于鸟类、哺乳类等其他类群的基因组中。由于该基因编码的蛋白质序列具 有神经肽前体蛋白的典型特征，如信号肽、前体蛋白剪切位点以及在不同物种相对保守的 成熟肽，我们将该基因命名为神经肽样前体蛋白基因(Neurop印tide-lik印recursor)，简 称 NPLP。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供一种鱼类神经肽NPLP基因。本发明另一目的在于提供上述鱼类神经跑NPLP基因编码的蛋白质。本发明另一目的在于提供上述蛋白质经断裂得到的成熟肽。本发明还有一个目的在于提供上述鱼类神经肽NPLP基因和成熟肽的应用。本发明目的通过以下技术方案予以实现通过搜索EST数据库，我们在斑马鱼中发现了一条编码NPLP的EST序列。结合 NPLP在其他物种的序列特征，我们在斑马鱼基因组中预测了 NPLP的ORF框。在ORF两侧设 计特异引物，我们克隆并测序了包含斑马鱼NPLP ORF框的一段cDNA序列(图1)。在斑马 鱼中，NPLP的蛋白前体由102个氨基酸组成，N-端的信号肽由26个氨基酸组成。蛋白酶切 割NPLP蛋白前体可能会产生14个氨基酸的成熟肽，写成NPLP-14。成熟肽的C-末端可能 存在酰胺化修饰，写成NPLP-14A，序列如SEQ ID NO 3所示。根据已知硬骨NPLP序列设计简并引物，经PCR扩增后得到代表金鱼NPLP的中间 片段。再根据得到的中间片段设计特异引物，分别进行3' RACE和5' RACEPCR得到金鱼 NPLP cDNA全长。如图2所示，金鱼NPLP cDNA全长865bp，其中开放读码框为309bp，5 ‘
3非翻译区为53bp，3'非翻译区为503bp。它编码的蛋白前体为102个氨基酸，其中N-端信 号肽由26个氨基酸组成(如SEQ ID NO :2所示)，编码该蛋白前提的基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0:1所示。成熟肽由14个氨基酸组成，成熟肽的C末端存在酰胺化修饰，序列如 SEQ ID NO 3 所示。序列比对分析表明，NPLP蛋白前体在不同脊椎动物中序列变异较大。但是，形成 成熟肽和蛋白前体断裂识别位点的氨基酸序列相对来说较为保守。在不同物种中，断裂蛋 白前体都会产生非常保守的NPLP-14A(图3)。硬骨鱼类与哺乳类NPLP只存在一至两个氨 基酸的变异。这些结果表明NPLP成熟肽在进化中相当保守，提示它们在不同的物种中的生 物功能可能也具有相似性。鱼类中的NPLP-14A的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示。采用real-time PCR技术分析脑中NPLP在斑马鱼第一次卵泡发育成熟过程中的 变化，结果表明在卵母细胞发育过程的早期，NPLP基因的表达逐渐上升；在黄体生成早 期，NPLP基因的表达达到顶峰；随着卵母细胞发育的进一步成熟，NPLP基因表达开始下降， 在卵母滤泡细胞发育成熟后下降至更低水平。采用real-time PCR技术分析NPLP在雌性成熟金鱼的组织表达情况，结果表明 金鱼NPLP主要在视顶盖-丘脑、延髓和下丘脑中表达，在肠、卵巢和心脏等外周组织中也有 少量表达。对NPLP-14A免疫阳性细胞在金鱼脑中进行表达定位，结果显示NPLP免疫阳 性信号主要分布于视前区(preoptic region)、前端下丘脑(anterior hypothalamus) > 丘脑腹内侧核(ventromedial thalamic nucleus)、内侧纵束(medial longitudinal fasciculus)禾口中间网状结构(intermediate reticular formation)的神经样细胞中。用不同浓度的金鱼NPLP-14和NPLP-14A离体孵育成熟金鱼垂体原代培养细胞，结 果显示10nM和IOOOnM NPLP-14A分别处理30分钟和120分钟能够显著抑制金鱼原代培 养的垂体细胞LH的释放(P < 0. 05) ；IOnM和IOOOnMNPLP-14处理30分钟和120分钟也 能显著抑制金鱼原代培养的垂体细胞LH的释放(P < 0. 05)，但其生理活性不如NPLP-14A ； 0. InM NPLP-14和NPLP-14A分别处理30分钟和120分钟能够微弱地降低体细胞LH的释 放。用lOng/g和lOOOng/g体重金鱼NPLP-14A在体腹腔注射雌性成熟金鱼，结果显 示10ng/g体重NPLP-14A注射组血清中LH的含量在注射后Ih和6h显著低于血清中LH水 平(P < 0. 05) ； 1000ng/g体重NPLP-14A注射组血清中LH的含量在注射后lh、3h和6h显 著低于对照组血清中LH水平。因此，本发明鱼类神经肽NPLP基因可以用于鱼类生殖调控；该基因编码的蛋白 质，以及蛋白质经断裂后产生的成熟肽均可用于鱼类人工催产中。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明鱼类神经肽NPLP基因在鱼类脑中大量表达，编码的蛋白质作为前体，经断 裂产生的成熟肽具有生殖调控的功能，可通过化学合成的方法进行利用开发，使用方便，效 果显著。
图1是本发明的斑马鱼神经肽NPLP基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列，其中，信号肽用下划虚线表示，成熟肽用阴影表示，蛋白酶切割位点用下划实线表示；图2是本发明的金鱼神经肽NPLP基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列其中，信 号肽用下划虚线表示，成熟肽用阴影表示，蛋白酶切割位点用下划实线表示；图3是本发明的一种鱼类神经肽NPLP的序列比对分析，其中，序列对比用Clastal W进行，信号肽用下划虚线表示，成熟肽用阴影表示，蛋白酶切割位点用下划实线表示；图4是本发明的一种鱼类神经肽NPLP基因在各个组织的表达分析，其中，TE 端 脑；OTT 视顶盖-丘脑；CE 小脑；ME 延髓；Hy 下丘脑；P 垂体；H 心脏；L 肝脏；K:肾 脏；G 鳃；I:肠；0:卵巢;图5是本发明的一种鱼类神经肽NPLP基因在卵泡发生阶段的表达变化，其中，PG 初生长期(I期)；PV 卵黄发生早期(II期)；EV 卵黄发生早期(III期早期)；MV 卵黄发 生中期(III期中期)；re 完全生长期(III期晚期)；GV 卵母细胞生发泡期(IV期)；图6是本发明的一种鱼类神经肽NPLP腹腔注射成熟期雌性金鱼LH释放的影响。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1.金鱼脑总RNA的提取取健康金鱼，解剖后立即分离出脑组织。采用Trizol试剂法提取获得金鱼脑总 RNA,其0D26(1/28(1 = 1.85,电泳结果显示，28S rRNA, 18S rRNA条带清晰，28S条带亮度为18S 的两倍，表明所得总RNA未被蛋白质、酚和基因组DNA污染，纯度高。2. cDNA第一链的合成取5 μ g金鱼脑总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污染，与RNA Oligo dT(序列如SEQ ID N0:4所示)混合，进行反转录，所的产物置于_20°C保存备用。3.斑马鱼NPLP基因cDNA全序列的克隆通过搜索EST数据库，我们在斑马鱼中发现了一条编码NPLP的EST序列。结合 NPLP在其他物种的序列特征，我们在斑马鱼基因组中预测了 NPLP的ORF框。在ORF两侧设 计特异引物，我们克隆并测序了包含斑马鱼NPLP ORF框的一段cDNA序列(图1)。在斑马 鱼中，NPLP的蛋白前体由102个氨基酸组成，N-端的信号肽由26个氨基酸组成。蛋白酶切 割NPLP蛋白前体可能会产生14个氨基酸的成熟肽，写成NPLP-14。成熟肽的C-末端可能 存在酰胺化修饰，写成NPLP-14A。4.金鱼NPLP基因cDNA全序列的克隆根据已知硬骨NPLP序列设计简并引物，经PCR扩增后得到代表金鱼NPLP的中间 片段。再根据得到的中间片段设计特异引物，分别进行3' RACE和5' RACEPCR得到金鱼 NPLP cDNA全长。如图4-6所示，金鱼NPLP cDNA全长865bp，其中开放读码框为309bp，5 ‘ 非翻译区为53bp，3'非翻译区为503bp。它编码的蛋白前体为102个氨基酸，其中N-端信 号肽由26个氨基酸组成，成熟肽由14个氨基酸组成，成熟肽的C末端存在酰胺化修饰(图 2)。5.鱼类神经肽NPLP的序列比对分析
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序列比对分析表明，NPLP蛋白前体在不同脊椎动物中序列变异较大。但是，形成 成熟肽和蛋白前体断裂识别位点的氨基酸序列相对来说较为保守。在不同物种中，断裂蛋 白前体都会产生非常保守的NPLP-14A。硬骨鱼类与哺乳类NPLP只存在一至两个氨基酸的 变异。这些结果表明NPLP成熟肽在进化中相当保守，提示它们在不同的物种中的生物功能 可能也具有相似性(图3)。实施例2金鱼NPLP的组织表达采用real-time PCR技术分析NPLP在雌性成熟金鱼的组织表达情况，结果表明 金鱼NPLP主要在视顶盖-丘脑、延髓和下丘脑中表达，在肠、卵巢和心脏等外周组织中也有 少量表达(图4)。实施例3斑马鱼NPLP基因在卵泡发生阶段的表达变化斑马鱼卵泡细胞发育可分为初生长期(primary growth, PG, stage I)、卵黄 发生前其月(previtellogenic, PV, stage II)、卵黄发生早其月(early vitellogenic, EV, early stage III)、卵黄发生中期(mid-vitellogenic，MV，mid-stage III)、完全生长期 (full-grown, FG, late stage III)和卵母细胞生发泡期(germinal vesicle, GV, stage IV)(图 5)。采用real-time PCR技术分析脑中NPLP在斑马鱼第一次卵泡发育成熟过程中的 变化，结果表明在卵母细胞发育过程的早期，NPLP基因的表达逐渐上升；在黄体生成早 期，NPLP基因的表达达到顶峰；随着卵母细胞发育的进一步成熟，NPLP基因表达开始下降， 在卵母滤泡细胞发育成熟后下降至更低水平。实施例4金鱼NPLP对LH释放的影响将性腺发育成熟的雌性金鱼(体重120克左右)分成六组，每组7-9条鱼。在实 验前驯养一周。实验开始时，先将金鱼用MS-222麻醉后，称量每组中个体体重。根据体重 分别由腹腔注入0. 7%鱼类生理盐水(对照组)或lng/gBW-1000ng/gBW 26RFa和100ng/g Bff 7RFa。分别在注射后lh、3h和6h从尾椎静脉采血，每次采血0.6ml。将采集的血液样品 装入1.5ml离心管中，在冰上放置4 6h后，于4°C 12，000Xg离心15min，取血清，采用放 射免疫测定方法检测LH浓度(图6)。
权利要求
一种鱼类神经肽NPLP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述鱼类神经肽NPLP基因编码的蛋白质，该蛋白质的等电点为6.53，分 子量为28. 31千道尔顿，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求2所述鱼类神经肽NPLP基因编码的蛋白质作为前体，经断裂后得到的成熟 肽，其特征在于所述成熟肽由14个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQID NO 3所示。
4.权利要求1所述鱼类神经肽NPLP基因在鱼类生殖调控中的应用。
5.权利要求2所述蛋白质在鱼类人工催产中的应用。
6.权利要求3所述成熟肽在鱼类人工催产中的应用。全文摘要
本发明公开了一种鱼类神经肽NPLP基因、编码的蛋白及其应用。本发明鱼类神经肽NPLP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明鱼类神经肽NPLP基因在鱼类脑中大量表达，编码的蛋白质作为前体，经断裂产生的成熟肽具有生殖调控的功能，可通过化学合成的方法进行利用开发，使用方便，效果显著。
文档编号C07K14/46GK101948840SQ20101026589
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者刘云, 刘晓春, 卢丹琪, 张勇, 张海发, 李水生, 林浩然, 蒙子宁, 陈华谱 申请人:中山大学