专利名称：一种单取代peg-epo的纯化及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞因子类蛋白的纯化工艺及制备方法，特别是涉及一种单取代 PEG-EPO的纯化工艺及制备方法。
背景技术：
常规EPO(促红素)是存在人体内的一种造血因子，1985年在体外基因克隆成功， 1989年获准上市应用于治疗贫血类疾病的注射类药物。常规EPO是目前药用蛋白中应用最成功并且市场销售额最大的一种蛋白类药物，2006年全球销售额达139亿美元。但常规EPO 在体内易被肾小体清除，半衰期短，病人需要频繁注射以维持有效药效浓度，而且EPO容易聚集导致抗原抗体反应。中国专利《聚合物/重组人促红素偶联物》申请号200710123683. X公开了一种PEG-EPO偶联物及其制备方法，并公开了 EPO通过PEG(聚乙二醇)化后能有效提高体内半衰期。单取代PEG-EP0(m PEG-EP0)可以很好克服常规EPO的缺点，从而达到大大降低注射次数，以减少病人的痛苦和经济负担，提高病人的生活质量。正因为如此，目前世界上很多公司和科研院所正在积极研发m PEG-EP0。研发m PEG-EPO的一大难点是如何高效提取出高纯度m PEG-EP0(> 95%)，以符合医药申报要求。EPO和PEG反应后，反应混合物中含有游离PEG、未反应ΕΡ0，取代物包含单取代、二取代、多取代PEG-EPO等多种混合物。一方面，由于EPO和PEG分子量均较大，这些取代物性质非常接近，若层析种类、填料类型及层析条件选择不合适很难将它们有效分离。另一方面，反应液中常规EPO非常昂贵， 所以要求纯化工艺得率不能太低(> 40%)，否则导致生产成本太高和能耗过大。这二方面导致从反应液混合物中纯化出高纯度m PEG-EPO(并且得率>40%)显得非常困难，既是当今医药界的一个研究热点也同时是一大难点。作为生物蛋白类药物，一般要求为单一组分，组分越简单越有利于药效、药理、安全等研究。即使含有微量的其它不明成份的蛋白质，对人体也会有潜在的极大危险。国家食品和药物管理局(FDA) —般对蛋白类新药纯度要求极高，一般纯度至少大于95%，对很多注射类药物更是要求大于98 %。从现有公开的专利技术主要采用阴/阳离子交换，或离子交换与凝胶过滤层析相结合(US 2002/0115833 Al,09/604938,11/386876 ；PCT W02006/130799A2 等)。但效果都不尽理想，离子交换难以达到所要求的纯度，离子交换和凝胶过滤层析结合面临放大困难、成本高、得率较低等问题(Conan J et al.，Chemical Engineering Science 61， 924-939. 2006)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够得到高纯度且得率较高的单取代PEG-EPO的纯化及制备方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种从EPO、PEG、单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO及多取代PEG-EPO的混合物中纯化单取代PEG-EPO的方法，所述方法包括，将混合物经疏水层析纯化得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中分离得到单取代 PEG-EPO。所述单取代PEG-EP0、二取代PEG-EP0、多取代PEG-EPO是指在EPO分子上分别偶
联一个、两个或多个具有下式I所述结构的聚合物，
权利要求
1.一种从EPO、PEG、单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO及多取代PEG-EPO的混合物中纯化单取代PEG-EPO的方法，所述方法包括，将混合物经疏水层析纯化得到单取代PEG-EPO与 PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中分离得到单取代PEG-EPO ；所述单取代PEG-EP0、二取代PEG-EP0、多取代PEG-EPO是指在EPO分子上分别偶联一个、两个或多个具有下式I所述结构的聚合物，
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中纯化得到单取代PEG-EPO是指通过离子交换层析去除PEG得到纯化的单取代PEG-EP0。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于进行离子交换层析之前，将单取代 PEG-EPO与PEG的混合物进行脱盐处理，或稀释降低电导率。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括将纯化得到的单取代 PEG-EPO利用超滤方法进行浓缩和置换缓冲液。
5.根据权利要求1 4任意一项所述的方法，其特征在于所述疏水层析所用填料为含有丁基、辛基、苯基、烷基、己基或乙醚基的疏水填料，所述疏水层析采用梯度洗脱，第一流动相含有0. 05-0. 25M的磷酸缓冲液，0. 5-2M(NH4) 2S04，pH值为6. 0-9. 0，第二流动相含有 0. 05-0. 25M的磷酸缓冲液，pH值为6. 0-9. 0。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述离子交换层析为阳离子交换层析或阴离子交换层析；所述脱盐处理是采用脱盐柱进行脱盐层析，并且脱盐层析所用流动相与离子交换层析相对应的平衡缓冲液一致；或稀释降低电导率，所用稀释液与离子交换层析相对应的平衡缓冲液一致。
7.一种单取代PEG-EPO的制备方法，所述方法包括将具有下式(II)所示结构的聚乙二醇衍生物与EPO混合反应至少2小时，反应pH值为7. 0 7. 5，所述聚乙二醇衍生物与EPO 的摩尔比为10 25 1，并将反应所得产物用权利要求1 6任意一项所述的方法纯化得到单取代PEG-EPO，
全文摘要
本发明公开了一种单取代聚乙二醇化促红素(m PEG-EPO)纯化工艺及制备方法，所述方法包括，将EPO、PEG、单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO及多取代PEG-EPO的混合物经疏水层析处理得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中纯化得到单取代PEG-EPO，最后用超滤方法进行浓缩和缓冲液置换。本发明的方法所得产物纯度可达到95％以上、得率不低于60％，在动物体内具有明显和持久促进红细胞生成功能，以及优于常规EPO的长效化作用。本发明制备的m PEG-EPO，能极大地提高m PEG-EPO的纯度指标，同时能有效降低生产成本和能耗。
文档编号C07K14/505GK102453087SQ20101051692
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者刘建军, 张向荣, 张涤平, 盛光阳, 黄俊龙, 黄海燕, 黎雄辉 申请人:深圳赛保尔生物药业有限公司