制备纯化脂肽的方法

专利名称：制备纯化脂肽的方法
技术领域：
本发明涉及脂肽的结晶性与结晶状形式，包括达托霉素，它是一种脂肽抗生素，对 革兰氏阳性细菌具有有力的杀菌活性，包括常规抗生素耐药性菌株。本发明还涉及制备脂 肽的结晶性与晶体状形式的方法和纯化脂肽的方法，脂肽包括达托霉素。本发明还涉及包 含脂肽的纯化形式的药物组合物和使用这些组合物的方法。发明的背景革兰氏阳性感染——包括由抗生素耐药性细菌导致的那些——发病率的迅速增 加已经重新引起人们对开发新型抗生素的兴趣。其中一类是脂肽抗生素，它包括达托霉素。 达托霉素对临床上有关的革兰氏阳性细菌具有有力的体外与体内杀菌活性，这些细菌导致 严重的和危及生命的疾病。这些细菌包括但不限于耐药性病原体，例如万古霉素耐药性肠 球菌(VRE)、甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)、糖肽中间体易感性金黄色葡萄球菌 (GISA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)和青霉素耐药性肺炎链球菌O3RSP)，对它们很少有可 供替代的治疗剂。例如参见 Tally 等，1999，Exp. Opin. Invest. Drugs 8 1223-1238。达托 霉素的抑制作用是一种迅速的、浓度依赖性体外与体内杀菌作用，和一种相对长效的、浓度 依赖性体内抗生素后作用。达托霉素被 Baltz 描述在 Biotechnology of Antibiotics, 2ndEd.， ed. W. R. Strohl (New York =Marcel Dekker, Inc.)，1997，pp. 415-435 中。达托霉素也已知 为LY 146032，是一种环状脂肽抗生素，它可以得自玫瑰孢链霉菌的发酵作用。达托霉素是 玫瑰孢链霉菌的因子AIigTSCciS抗生素的成员，由癸酰基侧链连接于环状13-氨基酸肽 的N-末端色氨酸而成(

图1)。达托霉素具有优异的活性，因为它对大多数革兰氏阳性细菌 是非常有效的；它的杀菌性高，起效迅速；它的耐药性比率低，对抗生素耐药性生物是有效 的。该化合物目前正被开发为多种制剂，治疗由细菌导致的严重感染，包括但不限于甲氧西 林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。大量美国专利描述了 A-21978Q抗生素和达托霉素相关性脂肽，包括达托霉素(LY 146032)。这些专利还描述生产和分离A-21978Q抗生素和达托霉素相关性脂肽的方法。美国专禾IjRE32, 333、RE32, 455,4, 800，157,4, 874，843 和 4，885，243 描述了从玫 瑰孢链霉菌的发酵培养物合成和分离达托霉素的方法。美国专利RE32，310、RE32, 311、 4，537，717,4, 482，487 和 4，524，135 描述了 A_21978C0 抗生素和脱酰化 A_21978C0 抗生素 与再酰化肽核的方法，和由这种方法制成的抗生素衍生物。美国专利5，912，226(以下称 为，226专利)描述了在达托霉素的制造期间生成的两种杂质的鉴别和分离，它们是脱水达托霉素和达托霉素的异构体形式。这些美国专利都没有公开以一定方式使脂肽沉淀或 结晶的方法，以增加脂肽的纯度。美国专利4，439，425(以下称为’425专利)公开了结晶性脂肽和使该脂肽结晶的 方法。公开在’ 425专利中的脂肽在结构上不同于达托霉素和达托霉素相关性脂肽。美国 专利5，336，756(以下称为’ 756专利)也公开了包含六肽的结晶性环状脂肽。公开在’ 756 专利中的结晶性环状脂肽也在结构上不同于达托霉素和达托霉素相关性脂肽。’756专利公 开了脂肽是一种棘白菌素型化合物，当采用含水正丙醇作为结晶溶剂时可以得到之。例如 参见’ 756专利第1-2栏。’ 425专利和’ 756专利既没有公开使达托霉素或达托霉素相关性 脂肽结晶或沉淀的方法，也没有公开使由链霉菌产生的脂肽结晶或沉淀的方法。开发一种使达托霉素和达托霉素相关性脂肽结晶或沉淀的方法将是有利的，以提 供这些脂肽的改进纯化方法。另外，达托霉素或其他达托霉素相关性脂肽的结晶形式或高 度纯化的沉淀形式将可用于配制治疗细菌感染的药物组合物。进而，达托霉素或达托霉素 相关性脂肽的结晶形式或高度纯化的沉淀形式将可用在制备无菌产品、特别是大量无菌产 品的方法中。因而，存在对生产结晶性或沉淀的达托霉素和达托霉素相关性脂肽的方法和 由此生产的脂肽的结晶或沉淀形式的需要。不过，尚不存在简单和稳健的方法有效使达托 霉素或达托霉素相关性脂肽结晶或沉淀，生成在结晶或沉淀后比以前更纯的脂肽。发明概述本发明为解决这些问题，提供脂肽、特别是达托霉素和达托霉素相关性脂肽的结 晶性与结晶状形式，和生产它们的方法。在一种实施方式中，本发明提供使脂肽结晶的方 法。在另一种实施方式中，这些方法提供在结晶或沉淀后比以前的结晶或沉淀更纯的脂肽。本发明还提供稳健的生产和纯化脂肽的方法，尤其包含使脂肽结晶或沉淀。在一 种实施方式中，这些方法的结晶或沉淀步骤用于纯化脂肽。在另一种实施方式中，这些方法 用于脂肽、优选达托霉素的大规模和/或商业生产。本发明进一步提供高度纯化的达托霉素和达托霉素相关性脂肽的结晶性或晶体 状形式。在一种实施方式中，脂肽的结晶性或晶体状形式可以用在药物组合物中。在另一 种实施方式中，本发明包含使用这些药物组合物的方法。附图的简要说明图1显示达托霉素的结构。图2显示由实施例12所述方法生产的达托霉素的urchin状晶体或晶体状粒子的 显微照片。图3显示达托霉素的针状晶体的显微照片。图4显示达托霉素的棒状晶体的显微照片。图5显示达托霉素样本在100X放大率下的显微照片。无定形达托霉素的显微照 片是用平面透射光(A)和正交偏振光(B)显示的。达托霉素晶体的显微照片是用平面透射 光(C和E)和正交偏振光(D和F)显示的。达托霉素晶体是由实施例7所公开的方案生产 的。图6显示无定形达托霉素的X-射线粉末衍射图样。图7显示由实施例7所述方案生产的达托霉素晶体的X-射线粉末衍射图样。图8显示由实施例7所述方案生产的第二份达托霉素晶体状本的X-射线粉末衍射图样。图9显示达托霉素的晶体状粒子在曝露于偏振光时的双折射。晶体状粒子是由实 施例12所述方法生产的。图10显示示范性结晶方法的流程图。图11显示不采用结晶或沉淀的示范性制造方法的流程图。该制造方法采用细菌 发酵，生成含有达托霉素的发酵培养物，然后利用微过滤、阴离子交换色谱、尺寸排阻超滤、 疏水作用色谱、用于溶剂除去的阴离子交换色谱、用于热原除去的超滤、反渗透来纯化达托 霉素，再将达托霉素装瓶。例如参见2001年6月21日公布的国际PCT公报W001/44274，引 用在此作为这种方法的详细说明参考。图12显示脂肽化合物的示范性制造方法的流程图，该方法包含发酵、微过滤、阴 离子交换色谱、尺寸排阻超滤、结晶或沉淀、晶体或沉淀的干燥和化合物的无水装瓶等步 骤。例如参见实施例13。图13显示脂肽化合物的示范性制造方法的流程图，该方法包含发酵、微过滤、阴 离子交换色谱、结晶或沉淀、晶体或沉淀的干燥和化合物的无水装瓶等步骤。例如参见实施 例14。图14显示脂肽化合物的示范性制造方法的流程图，该方法包含发酵、微过滤、尺 寸排阻超滤、结晶或沉淀、晶体或沉淀的干燥和化合物的无水装瓶等步骤。例如参见实施例 15。图15显示脂肽化合物的示范性制造方法的流程图，该方法包含发酵、微过滤、结 晶或沉淀、晶体或沉淀的干燥和化合物的无水装瓶等步骤。例如参见实施例16。图16描绘CB-131M7的结构，它是达托霉素的环状脂肽类似物。发明的详细说明发明目的本发明的一个目的是提供使脂肽结晶或沉淀的方法。在一种实施方式中，这些方 法用于使达托霉素或达托霉素相关性脂肽结晶或沉淀。在另一种实施方式中，与结晶或沉 淀之前的脂肽纯度相比，这些方法增加脂肽的纯度。这些方法包含提供脂肽的无定形制备 物和使脂肽在一定条件下结晶或沉淀的步骤，其中结晶性或沉淀的晶体状脂肽比脂肽的无 定形制备物更纯。在一种实施方式中，无定形制备物的纯度不大于92%，由此纯化的结晶性 或晶体状脂肽的纯度是至少95%，并且可以是至少96%、97%或98%或者更纯。在另一种 实施方式中，无定形制备物的纯度不大于80%，由此纯化的结晶性或晶体状脂肽的纯度是 至少95 %，并且可以是至少96 %、97 %或98 %或者更纯。在另一种实施方式中，无定形制备 物的纯度不大于60%，由此纯化的结晶性或晶体状脂肽的纯度是至少95%，并且可以是至 少96 %、97 %或98 %或者更纯。在另一种实施方式中，无定形制备物的纯度不大于40 %， 由此纯化的结晶性或晶体状脂肽的纯度是至少95%，并且可以是至少96%、97%或98%或 者更纯。在另一种实施方式中，无定形制备物的纯度不大于20%，由此纯化的结晶性或晶 体状脂肽的纯度是至少95 %，并且可以是至少96 %、97 %或98 %或者更纯。在另一种实施 方式中，无定形制备物的纯度不大于10%，由此纯化的结晶性或晶体状脂肽的纯度是至少 95%，并且可以是至少96%、97%或98%或者更纯。本发明的另一个目的是提供制备和纯化脂肽的方法，尤其包含使脂肽结晶或沉淀。在一种实施方式中，结晶或沉淀步骤用于纯化脂肽。在优选的实施方式中，结晶或沉淀 是通过成批结晶或沉淀进行的。在另一种实施方式中，该方法是用于一种脂肽商业生产的 大规模方法，该脂肽优选为达托霉素或达托霉素相关性脂肽。在一种实施方式中，脂肽是由 发酵作用产生的。发酵产物然后经过各种纯化技术纯化，包括结晶或沉淀。在一种实施方 式中，结晶或沉淀步骤可以与其他纯化技术联合使用，包括微过滤、尺寸排阻超滤和/或阴 离子交换色谱。在一种实施方式中，结晶或沉淀步骤用于代替一种或多种用在不采用结晶 或沉淀的纯化方法中的纯化技术。在另一种实施方式中，与没有结晶或沉淀步骤的其他步 骤相比，结晶或沉淀步骤用于增加纯化作用。在优选的实施方式中，该方法包含在结晶或沉 淀后收集结晶性或晶体状脂肽的步骤。本发明的另一个目的是提供高度纯化的、例如无菌的脂肽的结晶性或晶体状形 式。在一种实施方式中，这些脂肽是达托霉素或达托霉素相关性脂肽。脂肽的结晶性或晶体 状形式可以具有任意结晶性或晶体状形状，包括urchin状(连接在一起的针簇，视觉上类 似于sea urchir^seaurchin))(见图2)、针状(见图3)、棒状(见图4)、板状或片状。在一 种实施方式中，结晶性或晶体状脂肽的纯度是至少80%，可以是至少85%、90%。在另一种 实施方式中，脂肽的结晶性或晶体状形式的纯度是至少95%，可以是至少96<%、97%、98% 或更高。本发明的进一步的目的是提供包含脂肽的结晶性或晶体状形式的药物组合物。在 一种实施方式中，这些脂肽是达托霉素或达托霉素相关性脂肽。在一种实施方式中，药物组 合物被包以肠溶衣，用于口服给药，或者被配制成微粒或微球的形式。在其他实施方式中， 本发明提供对需要的受治疗者给以药物组合物的方法。定义除非另有定义，本文所用的全部技术与科学术语具有本发明所属领域普通技术人 员所普遍理解的含义。除非另有指示，本发明的实施采用化学、生物化学、生物物理学和微 生物学的常规技术和其中所用的基本术语。术语“脂肽”指的是包含与肽部分共价连接的脂质样部分的分子，以及它们的盐、 酯、酰胺和醚。术语“脂肽”还涵盖脂肽的被保护形式，其中一个或多个氨基、羧基或羟基被 保护起来° 例如参见"ProtectiveGroups in Organic Synthesis'^by Theodora W. Greene, John Wileyand Sons,New York，1981关于保护基团的实例。在一种实施方式中，脂肽是一 种抗生素。在另一种实施方式中，脂肽是LY 303366、棘白菌素、pneumocandin、棘孢曲菌素、 粘液菌素、枯草菌表面活性剂、制磷脂菌素Bi、安福霉素或公开在美国专利5，629，288中的 脂肽衍生物。这些脂肽是本领域已知的。例如参见美国专利5，202，309和国际PCT申请WO 00/08197。在另一种实施方式中，脂肽是一种达托霉素相关性分子。在另一种实施方式中， 脂肽是达托霉素。“达托霉素相关性分子”尤其包括达托霉素、AM145或其他在结构上与达托霉素有 关的脂肽，例如达托霉素相关性脂肽，包括关于这些分子中的任意手性中心而存在的所有 立体异构体。“达托霉素相关性脂肽”非限制性地包括公开在美国专利4，537，717,4, 482，487、 RE32, 311、RE32, 310和5，912，226中的脂肽，目前被重新发行为美国申请No. 09/547, 357。 达托霉素相关性脂肽还包括公开在2001年6月21日公布的国际PCT公报WO 01/44272、2001年6月21日公布的国际PCT公报TO 01/44274和2001年6月21日公布的国际PCT 公报WO 01/44271中的那些，所有这些申请都具体结合在此作为参考。公开在上述申请中 的达托霉素相关性脂肽涉及合成和半合成的脂肽，其中达托霉素的鸟氨酸和/或犬尿碱残 基、和/或脂肪酸侧链被修饰了。达托霉素相关性脂肽进一步包括A-21978Q抗生素，其中 达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一碳酰基、正十二碳酰基、正 十三碳酰基或正十四碳酰基脂肪酸侧链所代替。术语“达托霉素”指的是含有α -天冬氨酰基的因子A-21978Q型抗生素的正癸酰 基衍生物。“达托霉素”与LY 146032是同义的。术语“脱水达托霉素”指的是这样一种达托 霉素相关性脂肽，其中达托霉素的α-天冬氨酰基被环化为琥珀酰亚氨基。例如参见’ 2 专利关于脱水达托霉素的结构。术语“β_异构体”或“达托霉素的异构体”指的是含有天冬氨酰基代替 α-天冬氨酰基的达托霉素相关性脂肽。例如参见’ 2 专利关于达托霉素异构体的结 构。术语“分离的”指的是这样一种化合物或产物，该化合物在混合物中至少占5%、 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。将不言而喻的是术语“分离的”还指 的是这样一种化合物，它在混合物中至少占5-10%、10-2020-3030-4040-50%、 50-60 %、60-70 %、70-80 %或80-90 %。化合物在混合物中的百分比可以借助本领域已知的 任意手段测量，如下关于测量化合物的纯度所述。“基本上纯的”指的是具有至少95%所需化合物的样本。优选地，当至少95%至至 少97%的样本是达托霉素时，达托霉素是“基本上纯的”。类似地，当至少95%至至少97% 的样本是达托霉素相关性脂肽时，达托霉素相关性脂肽是“基本上纯的”。当至少98%至至少99%的样本分别是达托霉素或达托霉素相关性脂肽时，达托 霉素或达托霉素相关性脂肽是“本质上纯的”。当其他化合物的含量分别不超过达托霉素或达托霉素相关性脂肽制备物量的1 % 时，达托霉素或达托霉素相关性脂肽是“基本上不含”另一种化合物的。当其他化合物的含量分别不超过达托霉素或达托霉素相关性脂肽制备物量的 0.5%时，达托霉素或达托霉素相关性脂肽是“本质上不含”另一种化合物的。当其他化合物的含量分别不超过达托霉素或达托霉素相关性脂肽制备物量的 0. 时，达托霉素或达托霉素相关性脂肽是“不含”另一种化合物的。作为替代选择，当其 他化合物在最大灵敏度条件下不能被HPLC检测时，其中检测限分别是达托霉素或达托霉 素相关性脂肽制备物量的大约0. 05%或以下，达托霉素或达托霉素相关性脂肽是“不含”另 一种化合物的。“纯化的”达托霉素指的是基本上纯的达托霉素、本质上纯的达托霉素、或它们的 盐，或者指的是基本上不含、本质上不含或不含另一种化合物的达托霉素或其盐。类似地， “纯化的”达托霉素相关性脂肽指的是基本上纯的达托霉素相关性脂肽、本质上纯的达托霉 素相关性脂肽、或它们的盐，或者指的是基本上不含、本质上不含或不含另一种化合物的达 托霉素相关性脂肽或其盐。“粗的”达托霉素指的是纯度小于90%的达托霉素或其盐。类似地，“粗的”达托霉 素相关性脂肽指的是纯度小于90%的达托霉素相关性脂肽或其盐。
“半纯化的”达托霉素指的是纯度至少90%而小于95%的达托霉素或其盐。类似 地，“半纯化的”达托霉素相关性脂肽指的是纯度至少90%而小于95%的达托霉素相关性脂 肽或其盐。达托霉素、达托霉素相关性脂肽或另一种脂肽的纯度指的是在其配制成药物组合 物之前的脂肽。脂肽的纯度用“百分比纯度”表示。纯度的量度不是结晶性制备物的结晶 度的量度。纯度可以借助任意手段测量，包括核磁共振(NMR)、气相色谱/质谱(GC/MS)、液 相色谱/质谱(LC/MQ或微生物学测定。一种优选的测量达托霉素纯度的手段是分析型高 效液相色谱(HPLC)。分析型HPLC的两种方法描述在2001年7月沈日公布的国际PCT公 报WO 01/53330中，具体结合在此作为参考。“脂肽晶体”指的是脂肽或脂肽盐的一种或多种晶体。脂肽是否为晶体可以借助任 意手段测定，尤其包括光学显微镜检查、电子显微镜检查、X-射线粉末衍射、固态核磁共振 (NMR)或偏振光显微镜检查。显微镜检查可以用于测定晶体的长度、直径、宽度、大小和形 状，以及该晶体是否以单一粒子存在或者是否是多晶的。如果当借助一种手段测定时，例如肉眼观察或光学或偏振光显微镜检查，具有结 晶特征，但是当借助另一种手段测定时，例如χ-射线粉末衍射，不具有结晶特征，那么脂肽 或脂肽粒子是“晶体状”的。是“晶体状”的脂肽可以在某些条件下是结晶性的，但是在处 于其他条件下时可能变为非结晶性的。“结晶性脂肽”或“脂肽的结晶形式”指的是包含脂肽晶体的脂肽或其盐的制备物。 在一种实施方式中，结晶性脂肽可以包含一定量的无定形脂肽。在一种实施方式中，结晶 性脂肽包含超过50重量％的脂肽晶体。在另一种实施方式中，结晶性脂肽包含超过60%、 70 %、80 %、90 %或95 %的脂肽晶体。结晶性脂肽可以包含50-60 %、60-70 %、70-80 %、 80-90%或90-95%的脂肽晶体。在另一种实施方式中，结晶性脂肽包含超过95%的脂肽晶 体，例如至少96197198%或99%的脂肽晶体或100%的脂肽晶体。结晶性脂肽还可以 包含任意95-100%的脂肽晶体。脂肽晶体的重量百分比指的是在其配制成药物组合物之前 的脂肽制备物。脂肽的“无定形”形式指的是这样一种脂肽制备物，它包含很少或者没有如本文所 定义的脂肽晶体或晶体状脂肽(或晶体状粒子)。在一种实施方式中，无定形脂肽包含小 于20重量％的脂肽晶体或晶体状脂肽。在另一种实施方式中，无定形脂肽包含小于10重 量％的脂肽晶体或晶体状脂肽。在另一种实施方式中，无定形脂肽包含小于5重量％的脂 肽晶体或晶体状脂肽。在另一种实施方式中，无定形脂肽包含小于1重量％的脂肽晶体或 晶体状脂肽。“成批结晶”指的是这样一种方法，其中将有关脂肽与结晶试剂混合在溶液中，允 许脂肽在溶液中结晶。“成批沉淀”指的是这样一种方法，其中将有关脂肽与沉淀试剂混合 在溶液中，允许脂肽在溶液中沉淀。在一种实施方式中，从溶液中收集结晶性或沉淀的制备 物。在另一种实施方式中，借助过滤或离心收集结晶性或沉淀的制备物。“有机沉淀剂”指的是聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇一甲醚(PEG-MME)或化学上相似 的化合物。“盐”指的是离子化合物。这些离子化合物可以充当沉淀剂。“小分子醇”是含有至少一个醇官能团和八个碳原子或以下的有机化合物。例如，
8小分子醇非限制性地包括甲醇、异丙醇和叔丁醇。“多元醇”指的是含有多于一个醇基和少于八个碳原子的化合物。多元醇例如非 限制性地包括1，6_己二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、1，2-丙二醇、2-甲基_2，4-戊二醇和1， 4-丁二醇。“容器”指的是容纳物品的接受器。例如，容器可以非限制性地包括安瓿、小瓶、试 管、瓶子或圆筒。生产纯化脂肽的方法本发明的一个目的是提供纯化脂肽的方法，包含提供脂肽的无定形制备物和使该 脂肽结晶或沉淀的步骤。在一种实施方式中，脂肽的纯度在结晶或沉淀后高于结晶或沉淀 之前。可以这样使脂肽结晶，悬滴、sitting drop或sandwich drop蒸汽扩散、液-液或自 由界面扩散、微量透析或透析、缓慢溶剂蒸发、升华、微量成批或成批结晶。一般而言，可以 按相似方式使脂肽沉淀，优选地借助成批沉淀使脂肽沉淀。在优选的实施方式中，所结晶或 沉淀的脂肽是达托霉素或达托霉素相关性脂肽。在更优选的实施方式中，所结晶或沉淀的 脂肽是达托霉素。可以遵照本说明书的教导使脂肽结晶或沉淀。在一种实施方式中，可以 这样使脂肽结晶或沉淀，提供一种溶液，包含脂肽和小分子或多元醇、PH缓冲剂和包含一价 或二价阳离子的盐，允许沉淀或结晶发生，进一步讨论在下。在另一种实施方式中，盐具有 缓冲能力，以便额外的PH缓冲剂不必存在于溶液中。在另一种实施方式中，盐包含二价阳 离子。在优选的实施方式中，所提供的溶液不包括PEG或PEG-MME或化学上相似的化合物。 在一种实施方式中，使脂肽沉淀或结晶的方法一般包含下列步骤a)将脂肽与包含一价或二价阳离子的盐、可选的pH缓冲剂和小分子或多元醇混 合；b)允许脂肽在适当的温度条件下从溶液中沉淀或结晶出来。尤其可以借助显微镜检查监测样本的晶体或沉淀生成，并且可以按照分光光度法 测定收率。在优选的实施方式中，所结晶或沉淀的脂肽是达托霉素或达托霉素相关性脂肽。在另一种实施方式中，可以这样使脂肽结晶，提供一种溶液，包含小分子或多元 醇、盐和有机沉淀剂，进一步讨论在下。在更优选的实施方式中，所结晶的脂肽是达托霉素。 一般而言，关于成批结晶，将脂肽溶于溶液，向该溶液加入小分子醇、盐、缓冲剂和/或有机 沉淀剂。然后在适当的温度条件下使样本结晶，并搅拌或不搅拌。尤其可以借助显微镜检 查监测样本的晶体生成，并且可以按照分光光度法测定收率。如上所述，在一种或多种醇的存在下使脂肽、优选达托霉素或达托霉素相关性脂 肽结晶或沉淀。在优选的实施方式中，醇是小分子或多元醇。小分子或多元醇的实例非限 制性地包括甲醇、异丙醇、叔丁醇、1，6-己二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、1，2-丙二醇、2-甲 基-2，4_戊二醇和1，4_ 丁二醇。在优选的实施方式中，醇是异丙醇、叔丁醇、甘油、1，6_己 二醇、1，2_丙二醇、1，4_ 丁二醇、丙二醇和/或乙二醇。在更优选的实施方式中，醇是异丙 盐尤其包括镁或钠的甲酸盐、硫酸铵、磷酸二氢铵、乙酸钙、乙酸锌、柠檬酸三钠二 水合物、乙酸镁、乙酸钠、氯化镁、氯化钙、乙酸铵、氯化钠和硫酸锂。在一种实施方式中，盐 包含一价阳离子，例如钠。在优选的实施方式中，盐包含二价阳离子。在进而更优选的实施 方式中，盐包含钙阳离子、镁阳离子或锰阳离子。在进一步优选的实施方式中，盐包含钙的二价阳离子。在一种实施方式中，盐是氯化钙、乙酸钙、乙酸锌、柠檬酸钠、柠檬酸三钠二水 合物、氯化镁、硫酸锂、氯化钠、乙酸镁、乙酸钠或一种锰盐，例如乙酸锰或氯化锰。在优选的 实施方式中，盐是乙酸钙。其他包含二价阳离子、例如钙阳离子的盐的实例是本领域已知 的，尤其包括列在2000Sigma目录中的那些，结合在此作为参考。不希望拘泥于任何理论地 认为，盐阳离子可以中和脂肽上的负电荷，例如达托霉素的四羧酸。尤其沉淀剂尤其包括聚 乙二醇(PEG)，平均分子量可以在300与10，000之间变化，或聚乙二醇一甲醚(PEG-MME)。 在优选的实施方式中，有机沉淀剂是PEG 300、PEG 600、PEG 2000、PEG4000、PEG 8000或 PEG 10，000。使脂肽从被缓冲至pH 5. 0至9. 5的溶液中沉淀或结晶出来。在一种实施方式中， 在被缓冲之前，溶液的PH约为1. 5、2. 0或3. 0。在一种实施方式中，使达托霉素或达托霉 素相关性脂肽从大约PH 5. 5至大约pH 7. 5的溶液中沉淀或结晶出来。在另一种实施方式 中，缓冲液的PH为大约5. 9至大约6. 3。在一种实施方式中，使用pH缓冲剂可以得到被缓 冲的溶液。PH缓冲剂的实例非限制性地包括Tris、磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES, CHES,乙酸钠 或2-吗啉代乙磺酸(MES)、硼酸钠、二甲胂酸钠、咪唑和柠檬酸三钠二水合物。在优选的实 施方式中，盐是二甲胂酸钠、乙酸钠、柠檬酸三钠二水合物、HEPES, MES、CHES、咪唑、乙酸钙 和Tris-HCl。在更优选的实施方式中，pH缓冲剂是乙酸钙pH6. 1、乙酸钠pH 6. 1、二甲胂酸 钠pH 6. 5、柠檬酸三钠二水合物pH 5. 6、HEPES pH 7. 5、咪唑pH 8、MES pH 6. 0、乙酸钙pH 6和Tris-HCl pH8. 5。在另一种实施方式中，可以使用也具有缓冲能力的盐使溶液缓冲。在 优选的实施方式中，PH缓冲剂是乙酸钙pH 6. 1。利用悬滴蒸汽扩散使脂肽从溶液中沉淀或结晶出来，该溶液含有2至40%小分子 或多元醇、0. 001至0. 5M盐和0. 005至0. 2M pH缓冲剂。在优选的实施方式中，使脂肽从含 有3至30%小分子或多元醇、0. 01至0. 3M盐和0. 01至0. IM pH缓冲剂的溶液中沉淀或结 晶出来。在更优选的实施方式中，使脂肽从含有5至20%小分子或多元醇、0. 02至0. IM盐 和0.02至0.07M pH缓冲剂的溶液中沉淀或结晶出来。所提供的溶液可以包括或者可以不 包括聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇一甲醚(PEG-MME)。利用成批结晶使脂肽从溶液中沉淀或结晶出来，该溶液含有65至95%小分子或 多元醇、0. 001至0. 5M盐和0. 001至0. 2M pH缓冲剂。在优选的实施方式中，使脂肽从含有 70至90%小分子或多元醇、0. 005至0. 04M盐和0. 005至0. 04M pH缓冲剂的溶液中沉淀或 结晶出来。在有些实施方式中，使脂肽从还包含3-8%有机沉淀剂的溶液中结晶出来。在更 优选的实施方式中，使脂肽从含有80至85%小分子或多元醇、0. 01至0. 03M盐和0. 01至 0.03M pH缓冲剂的溶液中沉淀或结晶出来。在有些实施方式中，溶液进一步包含4-5%有 机沉淀剂，例如PEG或PEG-MME。在其他实施方式中，所提供的溶液不包括聚乙二醇(PEG) 或聚乙二醇一甲醚(PEG-MME)。使脂肽在大约0°C至大约30°C的温度下沉淀或结晶，分别得到沉淀或晶体。在优 选的实施方式中，使脂肽在大约20-30°C的温度下结晶或沉淀。在更优选的实施方式中，使 混合物在大约23-28°C的温度下结晶或沉淀。在进而更优选的实施方式中，使混合物在大约 27°C的温度下结晶或沉淀。可以使混合物结晶或沉淀达导致结晶或沉淀的任意时间，优选 大约一小时至大约两周。在优选的实施方式中，将混合物贮存大约3小时至大约M小时， 更优选大约8-18小时。
脂肽晶体或晶体状粒子可以具有一定形状，非限制性地有针状、棒状、urchin状、 片状、板状或其簇。在一种实施方式中，脂肽晶体或晶体状粒子是urchin状、棒状或针状 的。晶体或晶体状粒子的形状尤其可以借助光学或电子显微镜检查加以测定。在另一种 实施方式中，脂肽晶体或晶体状粒子可以是任意大小的，在任意一维上的直径至少大约 0.5μπι。在更优选的实施方式中，脂肽晶体或晶体状粒子有至少5 μ m，更优选至少10 μ m。 在进而更优选的实施方式中，脂肽晶体或晶体状粒子有至少50 μ m,更优选至少100 μ m。 晶体的大小可以借助本领域普通技术人员已知的任意方法加以测定。例如参见美国药典 (USP) pp. 1965-67。结晶性或晶体状脂肽的性质可以借助本领域普通技术人员已知的任意方法加以 测定。可以测定的性质包括结晶性或晶体状脂肽的大小、形状、双折射性质、粉末χ-射线 衍射性质、固态NMR性质、熔点和对热、光、潮湿与降解作用的稳定性。在优选的实施方式 中，本领域普通技术人员可以借助粉末χ-射线衍射测定脂肽是否为结晶性。粉末χ-射线 衍射非常适用于测定当样本是小晶体的随机取向集合体时，制备物是否为结晶性。随机 取向的微晶物的衍射作用产生一系列所研究分子及其结构所特有的线或环(因检测器而 异)。在优选的实施方式中，为了测定脂肽是否为结晶性，用自动粉末衍射仪测量粉末衍 射。例如参见Atkins等，Physical Chemistry,pp. 710-716 (1978)，结合在此作为参考关于 Debye-Scherrer法粉末衍射的讨论。配有本领域已知的任意粉末衍射检测器的、本领域已 知的任意粉末衍射测定仪都可以用于测量衍射图样。在优选的发明实施方式中，在大约2448°C的温度下，使用大约pH 5.0与9. 5之 间的缓冲剂、盐和醇，使脂肽结晶或沉淀大约3至M小时。在优选的实施方式中，盐是缓 冲剂，包含二价阳离子，醇是小分子醇，PH在大约5. 5与7. 5之间。在进而更优选的实施方 式中，盐是钙盐，醇是异丙醇，pH在大约5. 9与6. 3之间。在实施方式中，溶液包括有机沉 淀剂，优选地有机沉淀剂是PEG 4000或PEG 8000。在另一种实施方式中，使脂肽从含有12 至18%甘油、0.3至0. an盐、0.03至0.08m pH缓冲剂和12-18% PEG 600的溶液中沉淀或 结晶出来。在进一步优选的实施方式中，脂肽是达托霉素或达托霉素相关性脂肽。实施例 2-3提供了使非常纯的晶体状达托霉素沉淀的方法。本领域普通技术人员遵照本说明书的 教导，可以调整实施例所提供的结晶/沉淀条件，以使达托霉素、达托霉素相关性脂肽或其 他有关脂肽结晶或沉淀。进而，尽管本说明书的教导描述了在纯化脂肽的方法中使用单一 的结晶或沉淀步骤，不过本领域普通技术人员遵照本说明书的教导可以在纯化脂肽的方法 中使用多个结晶或沉淀步骤。为了进一步增加脂肽的纯度，采用多个如本文所公开的结晶 或沉淀循环可能是有利的。结晶或沉淀后，可以借助本领域已知的任意方法收集结晶物或晶体状沉淀。在优 选的实施方式中，借助离心或过滤收集结晶物或晶体状沉淀。在进而更优选的实施方式中， 借助过滤收集结晶物或晶体状沉淀，因为过滤容易结合在生产脂肽的大规模方法中。收集 结晶物或晶体状沉淀后，洗涤除去过量结晶试剂或沉淀试剂。可以选择本领域已知的任意 洗涤溶剂，只要它不明显溶解结晶物或晶体状沉淀即可。实施例12提供了洗涤溶剂的实 例。洗涤结晶物或晶体状沉淀后，可以借助本领域已知的任意方法干燥。干燥方法的实例 包括风干、冻干(冷冻干燥)或干燥(desiccation)。在优选的方法中，将结晶物或晶体状 沉淀干燥(desiccate)。例如参见实施例12。在另一种实施方式中，结晶性脂肽的稳定性
11可以借助它的残留抗生活性或它的降解作用加以测定。抗生活性可以在针对各种菌株的 标准琼脂扩散测定法中测量。例如参见美国专利4，537，717实施例32，具体结合在此作为 参考。降解量尤其可以借助HPLC分析测量，例如2001年7月沈日公布的国际PCT公报 W001/53330所述。在优选的实施方式中，结晶性脂肽的稳定性大于脂肽的无定形形式。结 晶性脂肽的稳定性可以这样测定，使结晶性脂肽和其无定形形式曝露于热、光、潮湿之下， 测量结晶形式和无定形形式的降解程度。脂肽的降解作用可以借助测定脂肽的生物活性或任意适用的物理参数加以测量。 在一种实施方式中，降解作用可以这样测量，测定脂肽在经受热、光、潮湿、PH改变或极端 PH后的特定生物活性，并与脂肽在任意稳定性试验之前的相同生物活性进行比较。降解量 例如可以借助测定稳定性试验后剩余的生物活性百分比加以测定。可以将剩余生物活性的 百分比与经受相同试验的脂肽的无定形形式进行比较。在一种实施方式中，如果脂肽是抗 生素，可以在稳定性试验之前和之后测试结晶性脂肽的抗生活性，再与降解试验前后的无 定形形式进行比较。在优选的实施方式中，脂肽是达托霉素或达托霉素相关性脂肽，生物活 性试验测定脂肽对革兰氏阳性细菌的抗生活性量。脂肽的降解作用还可以借助物理测定法测量。在一种实施方式中，降解作用可以 借助测定稳定性试验后保留的完整结晶性脂肽的百分比加以测量。可以将保留的完整脂肽 的百分比与经受相同稳定性试验的脂肽的无定形形式进行比较。在优选的实施方式中，脂 肽的降解作用可以借助HPLC、紫外分光术、红外分光术、NMR或质谱加以测量。在进而更优 选的实施方式中，使用HPLC测定在脂肽结晶形式经受稳定性试验后保留的完整脂肽百分 比。不希望拘泥于任何理论的是，申请人相信利用上述方法使达托霉素结晶。不过，据 认为洗涤和/或干燥达托霉素晶体导致达托霉素结晶物恢复非结晶性，但是仍然为晶体状 形式。虽然如此，即使上述方法仅仅使达托霉素或其他脂肽沉淀而非结晶，这些方法仍然是 有利的，因为这些方法纯化了脂肽。本发明还提供由上述方法生产的结晶性或晶体状脂肽。在一种实施方式中，与结 晶或沉淀前的脂肽相比，结晶性或晶体状脂肽包含更少量的一种或多种杂质。在一种实施 方式中，结晶性或晶体状脂肽是达托霉素，它与结晶或沉淀前的达托霉素相比，包含更低水 平的脱水达托霉素和/或达托霉素异构体。在另一种实施方式中，与无定形达托霉素 相比，结晶性或晶体状达托霉素包含更低水平的所有杂质。类似地，在另一种实施方式中， 结晶性或晶体状脂肽是达托霉素相关性脂肽，如上所述，它与达托霉素相关性脂肽的无定 形形式相比，包含更低水平的一种或多种杂质。在另一种实施方式中，与达托霉素相关性脂 肽的无定形形式相比，结晶性或晶体状达托霉素相关性脂肽包含更低水平的所有杂质。由上述方法生产的结晶性或晶体状脂肽同样包含一价或二价阳离子和水。在优 选的实施方式中，结晶性或晶体状脂肽是包含二价阳离子的达托霉素或达托霉素相关性脂 肽。在更优选的实施方式中，二价阳离子是钙阳离子。在进而更优选的实施方式中，根据原 子吸收或热重分析的测定，结晶性或晶体状达托霉素或达托霉素相关性脂肽包含大约1-10 重量％的二价钙阳离子和大约0-15重量％的水。在进一步优选的实施方式中，根据HPLC 分析，结晶性或晶体状脂肽是包含大约5重量％二价钙阳离子和大约10重量％水的达托霉 素，结晶性或晶体状达托霉素的纯度是至少95^^96^^97%或98%，或者是在95-98%之间的任意纯度，相对于相关物质和有机污染物而言。作为替代选择，结晶性或晶体状达托霉 素或达托霉素相关性脂肽包含一价阳离子，例如钠。不希望拘泥于任何理论地认为达托霉 素或达托霉素相关性脂肽当结晶或沉淀时，可以与一价或二价阳离子生成盐。脂肽的结晶形式可以比脂肽的无定形形式表现增加了的在溶液中的溶解度或增 加了的在溶液中的再生率。人们可以借助本领域已知的任意方法测量结晶性脂肽是否表 现增加了的溶解度或增加了的再生率。例如，人们可以将一定量结晶性脂肽溶于水溶液， 测量所溶解的脂肽浓度，并将等量无定形脂肽溶于水溶液，比较二者所溶解的脂肽浓度。类 似地，人们可以这样测量结晶性脂肽的再生率，向水溶液加入结晶性脂肽，然后测量经过一 定时间所溶解的脂肽浓度，并与无定形脂肽的再生率进行比较。脂肽的浓度是用HPLC测量 的。上述方法提供了结晶性或晶体状脂肽的生产方法，它们是从无定形脂肽结晶或沉 淀而来的，但是更纯。在一种实施方式中，脂肽是达托霉素或达托霉素相关性脂肽。在另 一种实施方式中，达托霉素或达托霉素相关性脂肽在结晶前纯度不超过92%，在结晶或沉 淀出晶体状脂肽后纯度至少是大约95 %、96 %、97 %或98 %，或者是在95-98 %之间的任意 纯度。在进一步优选的实施方式中，达托霉素或达托霉素相关性脂肽在结晶前纯度不超过 90 %，在结晶后纯度大约是至少97 %或98 %。在另一种实施方式中，达托霉素在结晶或沉淀前纯度不超过80%，优选不超过 70 %，更优选不超过60%，在纯化后纯度至少是大约95%、96%、97%或98%，或者是在 95-98%之间的任意纯度。在另一种实施方式中，达托霉素在结晶前纯度不超过50%，优选 不超过40 %，更优选不超过30 %，在结晶或沉淀纯化后纯度至少是大约95 %、96 %、97 %或 98%，或者是在95-98%之间的任意纯度。进一步优选的是这样一种实施方式，其中达托霉 素在结晶前纯度不超过20 %，更优选不超过15 %，进而更优选不超过10 %，在纯化后纯度 至少是大约95 %、96 %、97 %或98 %，或者是在95-98 %之间的任意纯度。在更优选的实施方式中，脂肽是达托霉素。达托霉素制备物可以借助任意已 公开的方法获得，例如美国专利 RE32, 333、RE32，455、4，800，157、RE32，310、RE32，311、 4，537，717,4, 482，487,4, 524，135,4, 874，843,4, 885，243 或 5，912，226，它们被具体结 合在此作为参考。达托霉素制备物还可以借助2001年7月沈日公布的国际PCT公报 W001/53330所述方法之一获得。制成脂肽制备物后，遵照本说明书的教导使脂肽制备物结 晶或沉淀，生成结晶性或晶体状脂肽，它比纯化前的脂肽制备物更纯或者含有更低水平的 特定杂质，例如脱水达托霉素。从发酵培养物生产纯化脂肽的方法本发明的另一种实施方式涉及联合色谱步骤和结晶或纯化以生产纯化脂肽的方 法。在优选的实施方式中，该方法包含这样的步骤，借助本领域已知的任意方法生产脂肽， 例如天然存在或重组生物的发酵，然后对脂肽制备物进行任意一种或多种纯化方法，例如 微过滤、阴离子交换色谱、疏水作用色谱、和/或尺寸排阻色谱(经由传统的尺寸排阻色谱 介质或者经由超滤)，以生成已被部分纯化的脂肽制备物，然后使脂肽制备物结晶或沉淀， 得到纯化的结晶性或晶体状脂肽。在优选的实施方式中，脂肽是达托霉素或达托霉素相关 性脂肽。关于发酵、微过滤、阴离子交换色谱、疏水作用色谱和超滤，各步骤在本领域中已 有公开，例如美国专利 RE32, 333、RE32, 455,4, 800，157、RE32, 310、RE32, 311,4, 537，717、4，482，487,4, 524，135,4, 874，843,4, 885，243 或 5，912，226,2001 年 7 月 26 日公布的国际 PCT公报WO 01/53330的任意一篇。该方法可选地包含在结晶或沉淀步骤后收集和/或洗涤结晶性或晶体状物的步 骤。在优选的实施方式中，结晶性脂肽制备物可以借助过滤收集。在另一种实施方式中，将 结晶性或晶体状物干燥。在一种实施方式中，纯化方法包含发酵玫瑰孢链霉菌，得到含有达托霉素的发酵 培养物。在一种实施方式中，玫瑰孢链霉菌可以如美国专利4，885，243所述被发酵。在另一 种实施方式中，其中由玫瑰孢链霉菌产生含有A-21978Q的粗产物的发酵条件被改变了，目 的是增加达托霉素产量，减少杂质和由玫瑰孢链霉菌发酵培养产生的相关污染物，如2001 年7月沈日公布的国际PCT公报WO 01/53330所述。WO 01/53330公报描述了如，243专 利所述发酵玫瑰孢链霉菌，并作了调整在于癸酸原料被保持在尽可能低的水平，不会降低 发酵的总收率。作为替代选择，发酵重组产生达托霉素的菌株或其他生物，可以得到达托霉素。在 一种实施方式中，重组菌株或其他重组生物包含达托霉素生物合成基因簇。在另一种实施 方式中，达托霉素生物合成基因簇或其蛋白质是经由细菌人工染色体(BAC)而被引入到 生物或菌株内的。在另一种实施方式中，所用重组菌株是包含BAC的玫瑰孢链霉菌或浅 青紫链霉菌，BAC含有达托霉素生物合成基因簇。2001年2月观日提交的美国临时申请 60/272，207描述了来自玫瑰孢链霉菌的达托霉素生物合成基因簇及其用途，全文结合在此 作为参考。发酵后，借助离心、微过滤或萃取使发酵肉汤澄清，这是本领域已知的或者如WO 01/53330公报所述。在优选的实施方式中，澄清是借助微过滤进行的。例如参见实施例 13-16和图11-15。图11显示不采用结晶或沉淀的示范性制造方法。使发酵肉汤澄清后，达托霉素在肉汤中的浓度大约是5-10%。在本发明的一种实 施方式中，在微过滤之后立即对达托霉素制备物进行上述结晶/沉淀方法。在一种实施方 式中，结晶或沉淀是在无菌条件下进行的。结晶或沉淀完全后，可选地将结晶性或晶体状达 托霉素收集、洗涤和干燥，如下面进一步详述。干燥的活性药物然后可以用于无水无菌装 瓶。例如参见实施例16和图12。发酵肉汤的澄清后，借助阴离子交换色谱可以将脂肽富集在制备物中，这是本领 域已知的或者如WO 01/53330公报或本文所述。例如参见实施例13-14和图12-13。阴离 子交换色谱后，肉汤中达托霉素的纯度大约是35-40%。在本发明的一种实施方式中，在阴 离子交换色谱之后立即对达托霉素制备物进行上述结晶或沉淀方法。在一种实施方式中， 结晶或沉淀是在无菌条件下进行的。结晶或沉淀完全后，可选地将结晶性或晶体状达托霉 素收集、洗涤和干燥，如下所述。干燥的活性药物然后可以用于无水无菌装瓶。例如参见实 施例14和图13。在本发明的另一种实施方式中，在阴离子交换色谱后对达托霉素制备物进行尺寸 排阻超滤。尺寸排阻超滤描述在WO 01/53330公报中。2001年7月沈日公布的申请描述 了利用标称分子量(NMW)为10，000至30，000的超滤膜除热原、过滤和浓缩达托霉素的方 法。该申请公开了这样一种方法，其中脂肽穿过超滤膜，而大分子杂质、例如内毒素被滤膜 截留。脂肽穿过滤膜后，改变脂肽溶液的PH、温度和/或盐浓度，以便脂肽形成胶束。然后在这样的条件下在超滤膜上过滤脂肽溶液，其中脂肽胶束被留在膜上，而更小的杂质穿过 滤膜。按照这种方式，脂肽被进一步纯化了。该申请公开了可以形成和分离脂肽胶束的条 件和以及过滤脂肽溶液以得到更纯的脂肽应用的方法。在进而更优选的实施方式中，脂肽 是达托霉素或达托霉素相关性脂肽。然后可以使脂肽结晶，如本文所述。阴离子交换色谱 和尺寸排阻超滤之后，达托霉素的纯度大约是80-90%。如上所述，然后对达托霉素制备物 进行上述结晶/沉淀方法，优选地在无菌条件下。可以可选地将结晶性或晶体状达托霉素 收集、洗涤、干燥，用于无水装瓶，如下所述。例如参见实施例13和图12。在本发明的另一种实施方式中，对粗达托霉素制备物进行尺寸排阻超滤，无需阴 离子交换色谱。在尺寸排阻超滤后，达托霉素的纯度大约是35-40%。然后可以使脂肽结晶 或沉淀，如本文所述，优选地借助无菌的方法。如上所述，可以将结晶性或晶体状达托霉素 收集、洗涤、干燥，用于无水装瓶。例如参见实施例15和图14。在替代的实施方式中，在阴离子交换色谱或尺寸排阻过滤之后，对脂肽制备物进 行疏水作用色谱(HIC)，例如WO 01/53330公报所述。然后可以使脂肽结晶或沉淀，如本文 所述。结晶或沉淀后，可以借助本文所述方法收集结晶性或晶体状脂肽，例如过滤或离 心。可选地洗涤结晶性或晶体状脂肽，以除去残留的结晶或沉淀溶剂。洗涤晶体或晶体状 物的方法如下所述。例如参见实施例3。经过洗涤或未经洗涤的晶体或晶体状物可以被干 燥。干燥可以借助本领域已知的任意方法进行，非限制性地包括真空干燥、喷雾干燥、盘式 干燥或冷冻干燥。在一种实施方式中，干燥是在无菌条件下进行的。在另一种实施方式中， 干燥是借助真空干燥进行的。在更优选的实施方式中，利用0. 65m3Klein Hastelloy-B双锥 体真空干燥机或等价设备进行干燥。经过干燥的结晶性或晶体状脂肽是稳定的，容易贮存。在一种实施方式中，用任意适量的经过干燥的结晶性或晶体状脂肽装瓶。在一 种实施方式中，在无菌条件下装瓶，然后密封。在另一种实施方式中，向每支小瓶装入50 至5000mg经过干燥的结晶性或晶体状脂肽。在另一种实施方式中，每支小瓶装入100至 lOOOmg。在另一种实施方式中，每支小瓶装入200至500mg。在另一种实施方式中，经过干 燥的结晶性或晶体状脂肽用于脂肽的批量包装。每份批量包装通常大于5000mg经过干燥 的结晶性或晶体状脂肽。在一种实施方式中，批量包装是在无菌条件下进行的。在一种实施方式中，结晶或沉淀步骤是在无菌条件下进行的。在这种实施方式中， 采用无菌的结晶或沉淀试剂和无菌、受控的工作环境。在一种实施方式中，在与无菌的结 晶/沉淀试剂混合之前，将脂肽在超滤膜上过滤，如上所述。结晶或沉淀后，在无菌条件下 借助离心或过滤收集结晶性或晶体状脂肽制备物。在一种实施方式中，借助无菌过滤收集 脂肽制备物。在另一种实施方式中，将结晶性或晶体状脂肽在收集后灭菌。无菌结晶、沉 淀和过滤的方法以及对最终药物产品灭菌的方法是本领域已知的。例如参见ReminRton The Science and Practice ofPharmacy, Easton, Pennsylvania, Mack Publishing Company (1995)，pp. 1474-1487，结合在此作为参考。在另一种实施方式中，不将结晶性或晶体状脂肽干燥。在这种实施方式中，优选地 将结晶性或晶体状脂肽贮存在保持脂肽的结晶性或晶体状性质的溶液中。可以在无菌或非 无菌条件下向小瓶装入脂肽和溶液。在一种实施方式中，条件是无菌的。作为替代选择，结 晶性或晶体状脂肽和溶液可以用于批量包装。
图10和11提供流程图，描述采用结晶的示范性达托霉素制造方案。在制造方案 中结合无菌结晶可显著缩短方案，消除该方法中的3至4个步骤。结晶性或晶体状脂肽、其药物组合物和使用方法本发明的另一个目的是提供结晶性或晶体状脂肽或其盐，以及包含结晶性或晶体 状脂肽或其盐的药物制剂。在一种实施方式中，结晶性或晶体状脂肽是达托霉素。不过，本 文所有结晶性或晶体状脂肽的提法具体涵盖达托霉素、达托霉素相关性分子，尤其包括达 托霉素、AM145和达托霉素相关性脂肽，如上所述。达托霉素晶体或晶体状粒子以及其他脂肽晶体或晶体状粒子可以具有一定形状， 尤其例如针状、板状、条状、equant状、urchin状或棒状的形状。在一种实施方式中，达托霉 素晶体或晶体状粒子具有urchin状、针状或棒状的形状。晶体或晶体状粒子的大小可以从 大约0. 5μπι至大于ΙΟΟμπι。在一种实施方式中，粒子大小是至少5μπι或以上。在更优选 的实施方式中，粒子大小是至少10 μ m或以上，更优选至少50 μ m。在进而更优选的实施方 式中，粒子大小是至少100 μ m。进而，在一种实施方式中，达托霉素晶体的X-射线衍射图样如图6、7和8所示。在 另一种实施方式中，脂肽晶体表现不同于脂肽的无定形形式的熔点。在本发明的一种实施方式中，脂肽的结晶形式表现等于或大于脂肽的无定形形式 的稳定性。在优选的实施方式中，结晶形式是达托霉素或达托霉素相关性脂肽。在另一种 优选的实施方式中，结晶性脂肽是无菌的。在另一种优选的实施方式中，结晶性脂肽的稳定 性大于脂肽的无定形形式。结晶性脂肽可以表现比无定形形式更高的对热、光、降解作用或 潮湿的稳定性。脂肽的稳定性可以借助任意手段测量，例如包括抗生活性、脂肽的降解作用 或达托霉素向脱水达托霉素或达托霉素β-异构体的转化作用。在本发明的另一种实施方 式中，脂肽的结晶形式可以比脂肽的无定形形式更快速地在水溶液中再生。结晶性或晶体状脂肽、例如达托霉素或达托霉素相关性脂肽、其药学上可接受的 盐、酯、酰胺、醚和被保护的形式可以被配制成口服、静脉内、肌内、皮下、气雾、局部或肠胃 外给药剂型，用于疾病、特别是细菌感染的治疗性、实验性或预防性处置。本文“结晶性或晶 体状脂肽”或“结晶性或晶体状达托霉素”的提法包括其药学上可接受的盐。结晶性或晶体 状脂肽、例如达托霉素对药物组合物而言可能是特别有利的，因为它们容易被配制成微粒 或微球，这有利于制备用于口服释放的肠溶衣脂肽、用于气雾剂释放(例如至肺)的药物组 合物和用于持续释放的脂肽制剂。结晶性或晶体状脂肽和结晶性或晶体状达托霉素还可更 容易地溶解在水溶液中。结晶性或晶体状脂肽、包括达托霉素或达托霉素相关性脂肽可以使用任意药学 上可接受的载体或赋形剂加以配制，它们与达托霉素或有关脂肽是相容的。例如参见 Handbook of Pharmaceutical Additives :An International Guide to More than 6000 Products by TradeName, Chemical， Function， and Manufacturer， AshgatePublishing Co.，eds.，Μ. Ash and I.Ash,1996 ；The Merck Index :An Encyclopedia of Chemicals， Drugs and Biologicals，ed.S.Budavari, annual ；Remington’ s Pharmaceutical Sciences， MackPublishing Company, Easton， PA ；Martindale :The Complete DrugReference，ed. K. Parfitt,1999 ；Goοdman&Gi1man' s ThePharmaceutical Basis of Therapeutics，Pergamon Press, NewYor k，NY，ed· L S· Goodman et al ；其内容结合在此作为参考关于人用各种抗微生物剂给药方法的一般说明。本发明化合物可以与常规药物载体 和赋形剂混合，以片剂、胶囊剂、酏剂、悬液、糖浆剂、纸囊剂、霜剂等形式使用。本发明化合 物还可以与治疗剂和抗生素混合，例如本文所述。包含本发明化合物的组合物将含有约0. 1 至约90重量％的活性化合物，更一般为约10至约30%。本发明组合物可以利用控释释放系统(例如胶囊剂)或缓释释放系统(例如生物 可侵蚀的基质)加以释放。适合于本发明组合物给药的、用于药物释放的示范性延迟释放 系统描述在美国专利4，452，775 (颁给Kent)、5，239，660 (颁给Leonard)、3，854，480 (颁给 Zaffaroni) cIll0组合物可以含有常用的载体和赋形剂，例如玉米淀粉或明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤 维素、高岭土、甘露糖醇、磷酸二钙、氯化钠和藻酸。组合物可以含有交联羧甲基纤维素钠、 微晶纤维素、玉米淀粉、淀粉羟乙酸钠和藻酸。可以包括在内的片剂粘合剂是阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡 咯烷酮(聚维酮)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。可以使用的润滑剂包括硬脂酸镁或其他金属的硬脂酸盐、硬脂酸、硅酮液、滑石、 蜡、油和胶体二氧化硅。还可以使用矫味剂，例如薄荷油、冬青油、樱桃矫味剂等。还可能需要加入着色剂， 以使剂型在外观上更美观或者有助于鉴别产品。关于口用，固体制剂是特别有用的，例如片剂和胶囊剂。还可以设计持续释放或肠 溶衣的制剂。在另一种实施方式中，结晶性或晶体状脂肽可以与一种载体组合物联合，后者 增强脂肽的口服利用度。在优选的实施方式中，结晶性或晶体状脂肽是达托霉素。关于儿童 和老人用药，悬液、糖浆剂和咀嚼片是尤其适合的。关于口服给药，药物组合物例如是片剂、 胶囊剂、悬液或液体的形式。药物组合物优选地被制成剂量单元的形式，其中含有治疗有效 量的活性成分。这类剂量单元的实例是片剂和胶囊剂。出于治疗目的，片剂和胶囊剂除了活 性成分以外还可以含有常规的载体，例如粘合剂，例如阿拉伯胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、山 梨糖醇或黄蓍胶；填充剂，例如磷酸钙、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨糖醇或蔗糖；润滑剂， 例如硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化硅或滑石；崩解剂，例如马铃薯淀粉；矫味或着色剂；或可 接受的湿润剂。口服液体制剂一般是水性或油性溶液、悬液、乳液、糖浆剂或酏剂的形式，可 以含有常规的添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、除水剂(non-aqueousagent)、防腐剂、着色剂和 矫味剂。口服液体制剂可以包含脂肽胶束或脂肽的单体形式。液体制剂添加剂的实例包括 阿拉伯胶、杏仁油、乙醇、分馏椰子油、明胶、葡萄糖浆、甘油、氢化食用脂肪、卵磷脂、甲基纤 维素、甲基或丙基对羟基苯甲酸酯、丙二醇、山梨糖醇或山梨酸。关于静脉内(IV)使用，可 以将本发明化合物的水溶性形式溶于任意常用的静脉内流体，输注给药。静脉内制剂可以 包括载体、赋形剂或稳定剂，非限制性地包括钙、人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、氯化钙、 碳酸盐和其他盐类。静脉内流体非限制性地包括生理盐水或林格氏溶液。还可以将达托霉 素或其他脂肽置于注射器、套管、导管和线中。肠胃外给药制剂可以是水性或非水性等渗无 菌注射溶液或悬液的形式。这些溶液或悬液可以从无菌的粉末或颗粒制备，具有一种或多 种口服给药制剂所用的载体。可以将结晶性或晶体状脂肽溶于聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉 米油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲液。关于肌内、肠胃外或静脉内制剂，可以将结晶性或 晶体状脂肽化合物或该化合物的适合的可溶性盐形式、例如盐酸盐的无菌制剂溶于药物稀
17释剂后给药，例如注射用水(WFI)、生理盐水或5%葡萄糖。结晶性或晶体状脂肽的适合的 不溶性形式也可以被制成悬液给药，悬液具有水性基质或药学上可接受的油基质，例如长 链脂肪酸的酯，例如油酸乙酯。可注射的药库剂型可以这样制备，在生物可降解的聚合物中，例如聚交酯-聚乙 醇酸交酯，形成结晶性或晶体状脂肽的微囊包封基质。根据药物与聚合物的比例和所采用 的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解的聚合物的实例包括聚 (原酸酯)和聚(酸酐)。可注射的药库制剂还可以这样制备，在与机体组织相容的微乳中 捕集药物。关于局部使用，还可以将本发明化合物制成适合的剂型，用于皮肤或鼻咽粘膜，可 以采取霜剂、软膏剂、液体喷雾剂或吸入剂、锭剂或咽喉涂剂的形式。这类局部制剂可以进 一步包括二甲基亚砜(DMSO)等化合物，促进活性成分的表面渗透。关于局部制剂，可以以 霜剂、软膏剂、喷雾剂或其他局部敷剂的形式给以无菌制剂，其中包含结晶性或晶体状脂 肽，例如结晶性或晶体状达托霉素、其适合的盐形式。局部制剂还可以是绷带的形式，它已 经浸渍有脂肽组合物。关于眼部或耳部用药，本发明化合物可以是液体或半液体的形式，在疏水性或亲 水性基质中配制成软膏剂、霜剂、洗剂、涂剂或粉剂。关于直肠给药，本发明化合物可以以栓剂的形式给药，其中混合有常规的载体，例 如可可脂、蜡或其他甘油酯。关于气雾剂，结晶性或晶体状脂肽或该化合物的盐形式的无菌制剂可以用在吸入 器——例如计量吸入器——和喷雾器中。雾化形式尤其可以用于治疗呼吸感染，例如肺炎 和窦类感染。作为替代选择，本发明化合物可以是粉末的结晶性或晶体状形式，用于在释放时 再生在适当的药学上可接受的载体中。在另一种实施方式中，化合物的单元剂型可以是化 合物或其盐在适合稀释剂中的溶液，置于无菌的密封安瓿内。化合物在单元剂型中的浓度 可以各不相同，例如从约至约50%，这取决于所用化合物及其溶解度和医师所需的剂 量。如果组合物含有剂量单元，每个剂量单元优选地含有大约10-5000mg活性成分，更优选 50至lOOOmg，进而更优选100至500mg。关于成年人的治疗，所采用的剂量优选地从IOOmg 至3g每天，这取决于给药的途径和频率。在进一方面，本发明提供治疗由革兰氏阳性细菌导致的受治疗者感染的方法。在 优选的实施方式中，该方法可以用于治疗由革兰氏阳性细菌导致的感染。术语“治疗”被定 义为对受治疗者给以治疗有效量的本发明化合物，既预防感染的发生，也控制或消除感染， 例如既定的感染。本文所述的术语“受治疗者”被定义为哺乳动物、植物或细胞培养物。本 文所用的措辞“治疗有效量”表示根据本发明的达托霉素、达托霉素相关性脂肽或其他抗菌 性脂肽预防细菌感染的发生、减轻其症状或终止其进展的量。在优选的实施方式中，受治疗 者是需要脂肽治疗的人或其他动物患者。既定感染可以是急性的或慢性的。有效剂量一般 在约0. 1与约75mg/kg结晶性或晶体状脂肽之间，例如结晶性或晶体状达托霉素或达托霉 素相关性脂肽、或其药学上可接受的盐。优选的剂量为约1至约25mg/kg结晶性或晶体状 达托霉素或达托霉素相关性脂肽或其药学上可接受的盐。更优选的剂量为约1至iang/kg 结晶性或晶体状达托霉素或达托霉素相关性脂肽或其药学上可接受的盐。进而更优选的剂量为约3至8mg/kg结晶性或晶体状达托霉素或达托霉素相关性脂肽或其药学上可接受的 盐。释放抗菌剂的示范性工艺描述在美国专利5，041，567(颁给Rogers)和国际PCT公报 WO 95/05384中，这些文献的全部内容结合在此作为参考。结晶性或晶体状脂肽、例如达托霉素可以按单一的每日剂量或每天多次剂量给 药。治疗方案可能需要给药长达一定时间，例如数天或二至四周。每次给药剂量或给药总 量将取决于感染的性质与严重性、患者的年龄与一般健康状况、患者对脂肽的耐受性和感 染所牵涉的微生物等因素。给药的方法公开在2000年4月6日公布的WO 00/18419中，结 合在此作为参考。本发明的方法包含将本发明化合物或其药物组合物对需要的患者给药，给药量对 减少或消除革兰氏阳性细菌感染是有效的。脂肽可以通过口服、肠胃外、吸入、局部、直肠、 鼻、颊、阴道方式给药，或者借助植入药库、外部泵或导管给药。脂肽可以被制成眼用或雾化 使用的形式。本发明化合物或其药物组合物还可以被直接注射或给药至脓肿部位、室或关 节内。肠胃外给药包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、池内、鞘内、肝内、损伤部位内和 颅内注射或输注。在优选的实施方式中，结晶性或晶体状达托霉素、达托霉素相关性脂肽或 其他脂肽是静脉内、皮下或口服给药的。本发明的方法可以用于治疗患有细菌感染的患者，其中该感染是由任意类型革 兰氏阳性细菌所导致或恶化的。在优选的实施方式中，结晶性或晶体状达托霉素、达托霉 素相关性脂肽或其他脂肽、或其药物组合物是按照本发明的方法对患者给药的。在另一种 实施方式中，细菌感染可以是由下列细菌所导致或恶化的，包括但不限于甲氧西林敏感性 与甲氧西林耐药性葡萄球菌(包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人 葡萄球菌、腐物寄生性葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌)、糖肽中等敏感性金黄色葡萄球 菌(GISA)、青霉素敏感性与青霉素耐药性链球菌(包括肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球 菌、鸟链球菌、牛链球菌、乳链球菌、血链球菌、和C族链球菌、G族链球菌和亚急性链球菌)、 肠球菌(包括万古霉素敏感性与万古霉素耐药性菌株，例如屎肠球菌和粪肠球菌)、艰难梭 菌、梭状梭菌、无害梭菌、产气荚膜梭菌、多枝梭菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李司忒 氏菌、杰氏棒杆菌、双歧杆菌、产气真杆菌、迟缓真杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、胚芽乳杆 菌、乳球菌、明串珠菌、小球菌属、厌氧消化链球菌、不解糖消化链球菌、大消化链球菌、微小 消化链球菌、普氏消化链球菌、产生消化链球菌、疮疱丙酸杆菌和放线菌。达托霉素在体外实验中对经典“耐药性”菌株的抗菌活性相当于对经典“敏感性” 菌株的抗菌活性。另外，达托霉素对敏感性菌株的最低抑制浓度(MIC)值通常比万古霉素 低4倍。因而在优选的实施方式中，将本发明化合物、或任意一种这些结晶性或晶体状脂肽 的药物组合物按照本发明的方法对患者给药，该患者表现对其他抗生素、包括万古霉素是 耐药性的细菌感染。另外，不象糖肽类抗生素，达托霉素对革兰氏阳性生物表现迅速的、浓 度依赖性杀菌活性。因而在优选的实施方式中，将本发明化合物、或任意一种这些结晶性或 晶体状脂肽的药物组合物按照本发明的方法对患者给药，该患者需要迅速起效的抗生素疗 法。本发明的方法可以用于机体任意器官或组织的革兰氏阳性细菌感染。这些器官或 组织非限制性地包括骨骼肌、皮肤、血液、肾、心、肺和骨。本发明的方法可以用于非限制性 地治疗皮肤与软组织感染、菌血症和尿道感染。本发明的方法可以用于治疗公共获得性呼吸感染，非限制性地包括中耳炎、鼻窦炎、慢性支气管炎和肺炎，包括由耐药性肺炎链球菌 或流感嗜血杆菌导致的肺炎。本发明的方法还可以用于治疗混合型感染，包含不同类型的 革兰氏阳性细菌，包括需氧的、caprophilic或厌氧的细菌。这些类型的感染包括腹内感染、 肺炎、骨与关节感染和产科/妇科感染。本发明的方法还可以用于治疗这样一种感染，非限 制性地包括心内膜炎、肾炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。在优选的实施方式中，任意上述疾病 都可以用结晶性或晶体状达托霉素、达托霉素相关性脂肽、抗菌性脂肽或任意一种这些结 晶性或晶体状脂肽的药物组合物加以治疗。结晶性或晶体状达托霉素、达托霉素相关性脂肽或其他脂肽还可以在患者或动物 的饮食或饲料中给药。如果作为总饮食摄取的一部分给药，达托霉素或其他脂肽的量可以 低于饮食的1重量％，优选不超过0. 5重量％。动物饲料可以是正常的饲料，可以向其中加 入达托霉素或其他脂肽，或者可以加入到预混合物中。本发明的方法在实施时还可以同时给以另一种形式的达托霉素或其他脂肽抗生 素，例如不是结晶性或晶体状的，或者除结晶性或晶体状达托霉素或其他结晶性或晶体状 脂肽抗生素以外的一种或多种抗真菌剂和/或一种或多种抗生素。除结晶性或晶体状达托 霉素或另一种脂肽抗生素以外的抗真菌剂和抗生素的共同给药可以用于混合型感染，例如 由不同类型革兰氏阳性细菌导致的那些，或者由细菌和真菌导致的那些。进而，结晶性或晶 体状达托霉素或其他脂肽抗生素可以改良一种或多种共同给药的抗生素的毒性。已经显示 达托霉素与一种氨基苷的给药可以改善由该氨基苷导致的肾毒性。在优选的实施方式中， 抗生素和/或抗真菌剂可以与本发明化合物同时给药，或者在包含本发明化合物的药物组 合物中给药。可以与本发明化合物共同给药的抗菌剂及其分类非限制性地包括青霉素类与相 关药物、卡巴培南类、头孢菌素类与相关药物、氨基苷类、杆菌肽、短杆菌肽、莫匹罗星、氯霉 素、甲砜霉素、夫西地酸钠、林可霉素、克林霉素、大环内酯类、新生霉素、多粘菌素类、利福 霉素类、壮观霉素、四环素类、万古霉素、替考拉宁、链阳性菌素类、抗叶酸剂(包括磺胺类、 甲氧苄啶及其组合和乙胺嘧啶)、合成的抗菌剂(包括硝基呋喃类、扁桃酸乌洛托品和马尿 酸乌洛托品)、硝基咪唑类、喹诺酮类、氟喹诺酮类、异烟胼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、对氨基水 杨酸(PAQ、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、氨硫脲、紫霉素、扁枝衣霉素、糖 肽、glycylcylcline、酮醇类、唑烷酮类、亚胺培南、阿米卡星、奈替米星、磷霉素、庆大霉 素、头孢曲松、Ziracin, LY333328、CL 331002、HMR 3647、Linezolid, SynercicU氨曲南、甲 硝唑、依匹普林、0CA_983、GV_143253、Sanfetrinem sodium、CS_834、比阿培南、A_99058. 1、 A_165600、A_179796、KA 159、Dynemicin A、DX 8739、DU 6681、Cefluprenam、ER 35786、 Cefoselis、Sanfetrinem celexetil、HGP_31、头孢匹罗、HMR_3647、RU_59863、Mersacidin、 KP 736、Rifalazil、Kosan、AM 1732、MEN 10700、Lenapenem、BO 2502A、NE_1530、PR 39、 K130、OPC 20000、OPC 2045、Ven印rim、PD 138312、PD 140248、CP 111905、硫培南、利替 培南 acoxyl、R0_65_5788、Cyclothialidine、Sch_40832、SEP_132613、micacocidin A、 SB_275833、SR_15402、SUN A0026、TOC 39、卡芦莫南、头孢唑兰、头孢他美 pivoxil 和 T 3811。在优选的实施方式中，可以与本发明化合物共同给药的抗菌剂非限制性地包括亚 胺培南、阿米卡星、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、头孢曲松、替考拉宁、ZiraciruLY 333328、CL 331002、HMR 3647、Linezolid、Synercid、氨曲南和甲硝唑。可以与本发明化合物共同给药的抗真菌剂非限制性地包括Caspofimgen、 Voriconazole、舍他康唑、IB_367、FK_463、LY_303366、Sch_56592, Sitafloxacin, DB_289 多烯类，例如两性霉素、制霉菌素、Primaricin ；唑系，例如氟康唑、衣曲康唑和酮康唑；烯 丙胺类，例如萘替芬和特比萘芬；和抗代谢产物剂，例如氟胞嘧啶。其他抗真菌剂非限制性 地包括公开在I7Ostel等，Drug Discovery Today 5 25_32(2000)中的那些，结合在此作 为参考。Fostel等公开的抗真菌化合物包括Corynecandin、Mer_WF 3010、Fusacandins、 Artrichitin/LL15G256、Sordarins、Cispentacin、Azoxybacillin、Aureobasidin 禾口 Khafrefungin0本发明化合物、或任意一种或多种这些结晶性或晶体状脂肽的药物组合物可以按 照这种方法给药，直至细菌感染被根除或减少。在一种实施方式中，结晶性或晶体状脂肽给 药的时间从大约3天至大约6个月。在优选的实施方式中，结晶性或晶体状脂肽给药7至 56天。在更优选的实施方式中，结晶性或晶体状脂肽给药7至观天。在进而更优选的实 施方式中，结晶性或晶体状脂肽给药7至14天。结晶性或晶体状脂肽可以给药更长或更短 的时间，如果需要这样做的话。在优选的实施方式中，脂肽是达托霉素或达托霉素相关性脂 肽。为了更充分地理解本发明，列出下列实施例。这些实施例仅供举例说明之目的，决 不被解释为限制发明的范围。实施例1借助常规技术制备达托霉素。达托霉素制备物是淡黄色无定形粉末，在25°C下在 水中的溶解度大于lg/ml，在乙醇中的溶解度为2. 8mg/ml。无定形达托霉素制备物是吸湿 性的，在215°C下分解。其余实施例描述在有或没有有机沉淀剂(例如PEG)的存在下使脂肽结晶或沉淀。实施例2在微量成批结晶中，将25μ 1达托霉素储备液(含20mg/ml的甲醇)先后与15μ 1 试剂储备液QOOmM乙酸钙、0. IM 二甲胂酸盐(ρΗ 6. 5) ,18% (w/v)PEG 8000和15 μ 1乙二 醇)混合，得到一种溶液，它含有27. 5%水性组分、45%甲醇和27. 5%乙二醇。形成urchin 状晶体，收率50%，用HPLC测量的纯度98%。实施例3将440mg达托霉素溶于含有25mM乙酸钠(ρΗ 5. 0)和5mM CaCl2的Iml缓冲液，制 备达托霉素储备液。借助蒸汽扩散(悬滴)法进行结晶，其中向5μ 1 0. IM柠檬酸三钠二 水合物(ρΗ 5. 6)与35% (ν/ν)叔丁醇的水溶液加入5μ 1达托霉素储备液，形成液滴。在 气密环境中将液滴悬浮在贮存溶液(0. IM柠檬酸三钠二水合物(ρΗ 5.6)与35% (ν/ν)叔 丁醇的水溶液)中，直至结晶发生。这种方法得到urchin状达托霉素晶体。例如参见图2。实施例4向含有0. IM 二甲胂酸钠(pH 6. 5)、0. 2M乙酸钙与9% (w/v)PEG8000的5 μ 1溶液 加入根据实施例3制备的5 μ 1达托霉素储备液。如实施例3所述借助蒸汽扩散法进行结 晶。这种方法得到针状达托霉素晶体。例如参见图3。实施例5
向含有 0. IM 二甲胂酸钠(pH 6. 5)、0. 2M 乙酸锌、9% (w/v)PEG 8000 与 0· 1μ 1苄 脒的5μ 1溶液加入根据实施例3制备的5μ 1达托霉素储备液，得到达托霉素的最终浓度 为220mg/ml。如实施例3所述借助蒸汽扩散法进行结晶。这种方法得到棒状达托霉素晶 体。例如参见图4。实施例6 将浓度为20-25mg/ml的Iml达托霉素(根据HPLC测定纯度97.1%)水溶液先后 与 231 μ 1 水、77 μ 1 乙酸钙(pH 6. 0)、960 μ 1 丙二醇和 231 μ 150% (w/v)PEG 4000 混合。 将溶液在4°C下放置4-5小时。形成urchin状晶体，收率75%。将结晶性达托霉素用异丙 醇洗涤。根据HPLC的测定，达托霉素的纯度为98. 4%。实施例7将达托霉素(200mg，纯度97. )溶于2. 54ml水。将达托霉素溶液按顺序先后 与 10. Oml 甲醇、0. 78ml IM 乙酸钙(pH 6. 0)、9. 50ml 丙二醇和 2. 20ml 50% (w/v) PEG 4000 混合，得到最终体积为25.0&ι1。在室温下，将混合物在血液学混合机(Fischer)内颠倒 10-14小时。在几小时内有晶体开始出现。14小时后最终收率大约是70-80%。在IOOOrpm 下离心15分钟，收获晶体。除去上清液，将晶体再悬浮在12.5ml异丙醇中。将达托霉素悬 液转移到柱子(Biorad)上，借助重力滴下而除去异丙醇。用氮气流干燥晶体。在干燥工艺 期间打碎所有结块，得到均勻的干燥样本。用这种方法制备的晶体是urchin状的，纯度为 98. 37%。实施例8按照实施例7使达托霉素结晶，但是使用PEG 8000代替PEG 4000。所用试剂的量 等于实施例7。用这种方法制备的晶体是urchin状的，纯度为98. 84%。实施例9利用USP<695>结晶度试验分析按照实施例7制备的两份达托霉素样本和一份无 定形样本。在玻片上制作达托霉素粒子在矿物油中的标本，然后用偏振光显微镜(PLM)检 查。如果它们是双折射的(具有干扰色)，并且当载物台旋转时具有消光位置，那么确定这 些粒子是结晶性的。无定形达托霉素样本由花边状的、薄片状的粒子组成，它们不是双折射的。在有些 薄片中存在一些梳毛状区域，具有微弱的双折射，但是粒子主要还是无定形的。相形之下， 按照实施例7制备的达托霉素样本由多晶粒子组成，具有微弱的双折射和一些消光，说明 它们主要是结晶性的。参见图5。实施例10利用X-射线粉末衍射分析按照实施例7制备的两份达托霉素样本和一份无定 形样本的结晶度。样本是在Siemens D500自动粉末‘一‘“‘定仪(ORS ID No. LD-301-4) 上进行分析的，按照ORS标准操EQ-27Rev. 9操作仪器。衍射测定仪配有石墨单色器和 Cu (λ = 1. 54人)X-射线光源，在50kV、40mA下操作。利用NBS云母标准(SRM675)进行 双θ校准。利用下列仪器参数分析样本2 θ 测量范围(度)4.0-40.0步长(度)0.05每步测量时间(秒)1. 2
光束狭缝1(1° )，2(1° )，3(1° ),4(0.15° ),5(0. 15° )利用零背景样本平板，按照ORS标准操作工艺MIC_7Rev. 1进行样本制备。所有样本都是利用Cu (λ = 1. 54人)X-射线光源测量的。无定形达托霉素样 本不显示任何X-射线粉末衍射峰。参见图6。相形之下，两份达托霉素样本都显示X-射 线粉末衍射峰。第一份达托霉素样本(图7)的衍射角O θ )为19. 225,23. 242,23. 427 和23.603(度)。第二份达托霉素样本(图8)的衍射角ΟΘ)为10. 966、19. 205和 23. 344(度)。第一份结晶性达托霉素样本在10-11°之间还显示一个小峰。参见图7。实施例11将达托霉素溶于水。加入乙酸钠，最终浓度达到187mM。加入氯化钙，最终浓度达 到观福。混合达托霉素溶液，加入异丙醇，最终浓度达到78.4%。将溶液混合，培育。培育 后生成沉淀物。沉淀物似乎是urchin状晶体，光学显微镜检查直径大约60 μ m。然后将其 干燥。干燥物含有大约30-40%盐。干燥后，进行粉末X-射线衍射。粉末X-射线衍射不显 示在干燥后的达托霉素沉淀中存在晶体。实施例12向16. 8ml蒸馏水加入Ig达托霉素(根据HPLC测量纯度大约91. 5% )，溶解。加 入2. 5ml IM乙酸钙(pH 6. 1)和60ml异丙醇。将溶液置于27°C水浴中，达到与水浴温度的 平衡。缓慢加入5ml异丙醇等分试样，直至溶液变浑浊(总计大约30ml异丙醇)。将溶液 在27°C下培育过夜，生成沉淀。沉淀似乎含有urchin状晶体，光学显微镜检查大约60 μ m。 参见图2。将达托霉素沉淀倒入压力过滤/干燥漏斗内，借助重力过滤。将沉淀用洗涤溶液 (80%异丙醇与20% A溶液，其中A溶液由18ml水和2ml冰乙酸组成)洗涤，每次25ml，借 助重力滴下过夜。然后将沉淀转移至干燥器内，在真空下干燥。干燥后，进行粉末χ-射线 衍射。粉末X-射线衍射不显示在干燥后的达托霉素沉淀中存在晶体。不过，利用HPLC进 行沉淀物的纯度分析显示它是98. 2%纯的达托霉素。显然，沉淀后的达托霉素制备物比沉 淀前的达托霉素制备物具有显著更少的脱水达托霉素。不希望拘泥于任何理论的是，申请人相信实施例11和12中用于使达托霉素沉淀 的条件实际上生成达托霉素的结晶形式，但是随后的洗涤步骤和/或干燥步骤导致结晶性 达托霉素恢复为非结晶形式。尽管如此，非结晶性达托霉素仍然是晶体状的，如图3所示， 晶体样本在偏振光下具有双折射。实施例13在受控制的癸酸原料发酵中进行玫瑰孢链霉菌NRRL菌株15998的发酵培养，其水 平优化抗生素的产生同时减少污染物的产生。用气相色谱测量残留的癸酸原料，从开始引 入(大约第30小时)直至收获的目标残留水平是IOppm硅酸。培养物的离心和随后澄清 肉汤的分析用于借助HPLC测量达托霉素的产生。收获效价通常在1. 0与3. 0克每升发酵 肉汤之间。发酵培养物是这样收获的，利用I^ll-Sep或等价微过滤系统进行微过滤，或者进 行全商业规模离心和深度过滤。将澄清后的肉汤上阴离子交换树脂Mitsubishi FP-DA 13， 用 30mM NaCl pH 6. 5 洗涤，用 300mM NaCl pH 6. 0-6. 5 洗脱。作为替代选择,将 FP-DA 13 柱子用 30mM NaCl pH 6. 5 洗涤，用 300mM NaCl pH 6. 0-6. 5 洗脱。pH 调至 3. 0-4. 8，温度
23调至2-15°C。在这些条件下，达托霉素形成胶束。将胶束状达托霉素溶液用任意构型的 10，000NMW超滤器(AG TechnologyCorp. UF中空纤维或等价物)过滤-洗涤。达托霉素胶 束被滤器截留，但是大量杂质被排除了，因为它们穿过了 10，000NMW滤器。达托霉素胶束的 超滤增加达托霉素纯度至大约80-90%。然后利用上述方法之一，在无菌条件下使达托霉素制备物结晶或沉淀。在优选的 实施方式中，按照实施例7、8或12所述方案使达托霉素结晶或沉淀，但是可以按比例扩大， 用于达托霉素的大量制备。借助过滤，优选真空过滤，从结晶/沉淀溶液中分离结晶性或 晶体状达托霉素。将结晶性或晶体状达托霉素用洗涤溶液洗涤(见实施例幻。然后利用 0. 65m3Klein Hastelloy-B双锥体真空干燥机或等价设备，在无菌条件下真空干燥结晶性 或晶体状达托霉素。然后向每支小瓶装入250或500mg干燥后的结晶性达托霉素。图9显 示这种制造方法的流程图。实施例14如实施例13所述进行玫瑰孢链霉菌的发酵、发酵培养物的微过滤和阴离子交换 色谱。此时达托霉素制备物的纯度大约是35-40%。阴离子交换色谱后，按照实施例13所 述方案使达托霉素结晶或沉淀。然后按照实施例13所述方案将达托霉素洗涤和干燥。干 燥后的结晶性或晶体状达托霉素然后用于装入无菌小瓶，如实施例13所述。图6显示这种 制造方法的流程图。实施例15如实施例13所述进行玫瑰孢链霉菌的发酵和发酵培养物的微过滤。微过滤后， 对发酵培养物进行尺寸排阻超滤，如实施例13所述。此时达托霉素制备物的纯度大约是 35-40%。超滤后，按照实施例13所述方案使达托霉素结晶或沉淀。然后按照实施例13所 述方案将达托霉素洗涤和干燥。干燥后的结晶性或晶体状达托霉素然后用于装入无菌小 瓶，如实施例13所述。图7显示这种制造方法的流程图。实施例16如实施例13所述进行玫瑰孢链霉菌的发酵和发酵培养物的微过滤。此时达托霉 素制备物的纯度是5-10%。微过滤后，按照实施例13所述方案使达托霉素结晶或沉淀。然 后将达托霉素洗涤，干燥，用于装入无菌小瓶，如实施例13所述。图8显示这种制造方法的 流程图。实施例17经由半合成途径从达托霉素制备CB_131M7(见图X)，它是达托霉素的一种环 状脂肽类似物。CB-131547是淡黄色无定形粉末，在25°C下、在生理盐水中的溶解度为 80mg/ml。将CB-131547 (60mg， 90%纯)溶于2.5ml水。将CB-131547溶液按顺序先后与 5. Oml 甲醇、0. 2ml IM 乙酸钙(pH 6. 0)、2. 5ml 丙二醇和 1. Oml 50% (w/v)PEG 4000 混合， 得到最终体积为11. 2mL·将溶液在4°C下放置4至M小时。生成CB-131547晶体，收率 70 %，根据HPLC测定纯度 98. 0 %。实施例18经由半合成途径从达托霉素制备CB_131M7(见图X)，它是达托霉素的一种环 状脂肽类似物。CB-131547是淡黄色无定形粉末，在25°C下、在生理盐水中的溶解度为 80mg/ml。将CB-131547(60mg， 90%纯)溶于 2. 5ml 水。加入 0. 2ml IM 乙酸钙(pH 6. 0)
和8ml异丙醇。使溶液在室温(25°C )下平衡5分钟。缓慢加入Iml异丙醇等分试样，直至 溶液变浑浊。将溶液贮存在室温下过夜，生成晶体。本说明书引用的所有出版物和专利申请都结合在此作为参考，仿佛每篇出版物或 专利申请都被具体、单独结合在此作为参考一样。尽管出于清楚理解的目的，已经借助举例 说明和实施例详细描述了上述发明，不过按照本发明的教导对本领域普通技术人员来说显 而易见的是，可以对其进行某些改变和调整，而不背离所附权利要求的精神和范围。
权利要求
1.含有达托霉素的组合物，所述达托霉素由下述沉淀或者结晶a.在pH5.0至9. 5的范围内，将达托霉素与二价阳离子盐和具有八个碳原子以下的醇 在溶液中混合；b.使所述达托霉素从所述溶液中沉淀或结晶；以及c.收集所述沉淀或结晶的达托霉素。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述溶液的pH在5.5至7. 5的范围内。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述二价阳离子盐包括钙盐。
4.根据权利要求1-3的任一项的组合物，其中所述溶液包含聚乙二醇。
5.根据权利要求1-4的任一项的组合物，其中所述醇选自甲醇、异丙醇、叔丁醇、1， 6-己二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、1，2-丙二醇、2-甲基_2，4-戊二醇和1，4-丁二醇。
6.根据权利要求1-5的任一项的组合物，其中所述溶液包含PEG4000或PEG8000。
7.根据权利要求1-6的任一项的组合物，其中所述醇是异丙醇。
8.根据权利要求1-7的任一项的组合物，其中所述二价阳离子盐是乙酸钙。
9.根据权利要求1-8的任一项的组合物，其中a.所述pH是6.0 ；b.所述醇是甲醇；并且c.所述所述溶液包含PEG3000。
10.根据权利要求1-9的任一项的组合物，其中所述达托霉素经过一种或者多种选自 下述的纯化步骤疏水作用色谱(HIC)、阴离子交换色谱和过滤。
11.根据权利要求1-10的任一项的组合物，其中a.改变所述pH、温度和/或所述达托霉素盐浓度，以便达托霉素形成胶束；并且b.过滤所述胶束，以保留胶束，而更小的杂质穿过滤器。
12.根据权利要求1-11的任一项的组合物，其中在pH5. 5至7. 5的范围内，将达托霉 素在溶液中与a.选自氯化钙、乙酸钙、氯化镁和乙酸镁的阳离子盐；和b.2-40%的选自甲醇、乙醇和异丙醇的醇；和c.聚乙二醇(PEG)4000 或 PEG 8000 混合。
全文摘要
本发明涉及脂肽的结晶性和晶体状形式，脂肽包括达托霉素，它是一种对革兰氏阳性细菌、包括对常规抗生素具有耐药性的菌株都具有有力杀菌活性的脂肽抗生素。本发明涉及纯化脂肽的方法，脂肽包括达托霉素，它是一种对革兰氏阳性细菌、包括对常规抗生素具有耐药性的菌株都具有有力杀菌活性的脂肽抗生素。本发明还涉及包含纯化形式脂肽的药物组合物和使用这些组合物的方法。
文档编号C07K1/14GK102070703SQ20101057839
公开日2011年5月25日 申请日期2001年12月17日 优先权日2000年12月18日
发明者C·戈瓦尔丹, D·凯斯, N·哈拉夫, 赖正吉 申请人:卡比斯特制药公司