专利名称：多肽cw7213纯化工艺方法
技术领域：
本发明设计化学合成多肽的分离纯化方法，属于生物制品加工领域
背景技术：
多肽是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质。在自然界，所有细胞都能合成多肽物质，其细胞功能活动也受多肽的调节控制。随着现代蛋白质工程、生物酶工程技术迅速发展，大量具有特殊功能的生物活性肽被发现、开发出来，应用于食品配方、功能性食品、食品添加剂、药品、化妆品、无公害饲料添加剂等领域。多肽广泛存在于自然界中，对多肽的研究和应用一直是科学研究的一个主要方向。生物活性多肽由于具有多种人体代谢和生理调节功能，且可作为药物或药物前体，食用安全性极高而广泛受到人们的关注，因此多肽的分离纯化也成了一个研究热点。随着分离纯化技术的进展，大大加快了新活性多肽的发现和合成速度。在多肽合成中，许多杂质显示与产物类似的性质，随着肽链的增长，分离的难度也增大，因此纯化的方法和工艺显得异常重要。离子交换色谱是以离子交换剂作为固定相，交换剂由固定离子基团及可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时，组分离子与可交换的离子进行可逆变换，最后达到交换平衡。离子交换色谱法的原理就是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。离子交换色谱又可分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。对于不同的多肽提取，所选用的离子交换剂不同，因此环境条件及洗脱条件的确定非常重要，一旦条件选取不当，分离纯化效果将会很差。故而，对于各种多肽，研究其最适离子交换剂及其对应最适条件以不断提高提取效果是研究工作者的研究方向。反相高效液相色谱是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂或其水溶液作为流动相，根据溶质疏水性的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。RP-HPLC主要用于分子量低于5000的多肽的分离纯化，因其具有分离效果好、分辨率高、重复性好、分析速度快等优点，在多肽的分离纯化和制备中得到广泛应用。反相高效液相色谱由于操作简单，色谱过程稳定，加之分离技术灵活多变性，已成为高效液相色谱中应用最广泛的一个分支。然而反相高效液相色谱虽具有高选择性却不具有毛细管电泳的高柱效性，且费时，价高，因此研究其与其他分离纯化方法的联用技术具有现实意义，成为近年来的一个研究热点。传统化学降糖药的广泛使用，已出现了一定耐药性，并具有相应的副作用。重组人胰岛素虽然效果较好，但是也具有用药不方便的特点。CW7213是胰高血糖素样肽-I(GLP-I)类似物，具有多种生理功能能够降低患者体重，更平稳地控制血糖水平，不会产生低血糖。此外，GLP-I类似物还能维持、并且改善II型糖尿病患者的基础和葡萄糖刺激后的β细胞功能，延缓疾病进程。由于这些无可比拟的治疗优点，CW7213有非常广阔的市场前景。利用固相合成CW7213多肽，合成工艺简单，合成速度快，产品纯度较高。但是不可避免的，在合成中会产生相应的副产物，如合成多肽中的各种副反应产物，脱保护时肽键断裂或者保护基去除不完全等。由于合成方法国内外有较多报道天然产物多肽的分离纯化方法，但化学合成多肽的分离纯化方法却鲜有报道。与单独的使用C18柱的高效制备液相色谱法或者离子交换色谱纯化法不同，通过联合使用离子交换色谱法和高效制备液相色谱法，综合了离子交换色谱的分表率高、分离容量大、易于放大和反向高效制备液相色谱法的依亲疏水性差别分离的特性，实现了对化学合成多肽的高效，快速分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种分离效果较好的多肽CW7213纯化工艺方法，采用离子交换色谱柱和反相C18色谱柱，磷酸盐缓冲系统和含三氟乙酸的甲醇/水系统，进行色谱柱的平衡、进样、吸附、洗脱等工艺，最后进行转盐，冻干，使获得的多肽纯度达到99%以上。本发明的目的可以通过以下措施达到多肽CW7213纯化工艺方法①利用固相多肽合成方法合成多肽，将得到的粗肽加入纯水，温度保持在20-40 度，用超声波振荡10-30分钟进行溶解；完全溶解后，膜过滤得到澄清溶液，得到CW7213的粗肽溶液，再先后进行离子交换色谱和反向高效液相色谱的分离纯化；②离子交换色谱分离，采用粒径为5μπι的离子交换色谱填料，流动相为磷酸盐缓冲液与高氯酸钠磷酸盐缓冲液体系，流速lml/min ；所述的离子交换色谱缓冲液体系为 A液50 %乙腈+50 %含0. lmol/L KH2P04的磷酸水溶液PH3. 3 ；B液50 %乙腈+50 %含 0. ImoVLKH2PO4,0. lmol/L NAClO4 的磷酸水溶液 PH3. 3 ；洗脱条件为 0% -60% B yf 30min。 所述的离子交换色谱柱为Waters Spherisorb SCX 4. 6X250mm。③反相制备液相色谱分离，采用粒径为5μπι的反向液相色谱填料，流动相为含三氟乙酸的甲醇/水溶液体系，流速2ml/min ；所述的反相制备液相色谱的流动相体系为A 液5%甲醇+水相中0. 05%三氟乙酸，B液95%甲醇+水相中0. 05%三氟乙酸；洗脱条件为 40%-50% B 液 30min。所述的反相 C18 柱为 Kromasil C18 10X250mm。④转盐，反相制备液相色谱分离方式，采用粒径为5 μ m的反相液相色谱填料，流动相为含醋酸的甲醇/水溶液体系，流速lml/min ；所述的转盐流动相体系为A液2%醋酸 +纯水，B液甲醇；流速为2ml/min ；洗脱条件为40% -60% B液30min。⑤将各收集组分，质谱分析目标产物，然后冷冻干燥，得到多肽成品。与现有技术相比，本发明的优点在于易于工艺放大；整个工艺无三废产生，属于绿色环保工艺，其产品安全可靠；本发明采用的色谱分离纯化技术，无相变发生，无热原导入，保证了产品的高纯度；本发明离子交换色谱采用新颖的恒组成流动相，相对于现有梯度而言，分离效果更好。转盐之后使样品更稳定更易储存。
具体实施例方式通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此声明的是以下实施例只用于对本发明进行进一步的描述，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整，以作他用。实施例1固相合成多肽CW7231纯化工艺方法①利用固相多肽合成方法合成多肽，将得到的粗肽加入纯水，温度保持在20-40
4度，用超声波振荡10-30分钟进行溶解；完全溶解后，膜过滤得到澄清溶液，得到CW7213的粗肽溶液，再先后进行离子交换色谱和反向高效液相色谱的分离纯化；②应用离子交换色谱分离，分离纯化条件离子交换柱离子交换色谱填料，粒径5 μ m ；所用的离子交换色谱柱为Waters Spherisorb SCX 4.6X250mmo流动相A:50% 乙腈 +50% 含 0. Imol/L KH2P04 的磷酸水溶液(pH3. 3)B :50% 乙腈+50%含 0. lmol/L KH2P04，0. lmol/L NaC104 的磷酸水溶液(pH3. 3)；流速lmL/min；梯度0%-60% B 液 30min检测波长214nm③离子交换色谱的操作步骤I色谱柱平衡50%乙腈+50%含0. lmol/LKH2P04的磷酸水溶液(pH3.幻，平衡至基线稳定为止。II 进样；III吸附50%乙腈+50%含0. lmol/L KH2P04的磷酸水溶液(pH3. 3)，待样品穿透
后至基线平稳；IV 洗脱50 % 乙腈 +50 % 含 0. lmol/LKH2P04,，0. lmol/LNaC104 的磷酸水溶液 (pH3. 3)，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；V清洗与再生90%乙腈进行清洗，至基线平稳；④将所得到的各组分，经质谱分析，判定目标产物所在组分，然后将目标产物组分进行反相高效液相色谱分离纯化；⑤应用反相高效液相色谱分离，分离纯化条件反相色谱柱采用粒径为5μπι的反向液相色谱填料，所述的反相C18柱为 Kromasil C18 10X250mm。流动相A 甲醇/水(0. 三氟乙酸)B :90%甲醇/水(0. 三氟乙酸)流速lmL/min梯度40% -50 % B 液 30min检测:214nm⑥反相高效液相色谱的操作步骤I色谱柱平衡10%甲醇/水(0.1%三氟乙酸)溶液，平衡到基线稳定为止II 进样；III洗脱流动相由10%甲醇/水(0. 1 %三氟乙酸)溶液到90%甲醇/水(0. 1 % 三氟乙酸)溶液，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；IV清洗90%甲醇/水溶液进行清洗，至基线平稳；V保存色谱柱90%甲醇/水溶液保存色谱柱。⑦转盐反相色谱柱采用粒径为5μπι的反相液相色谱填料，所述的反相C18柱为 Kromasil C18 10X250mm。
流动相A :2%醋酸+纯水B:甲醇流速2mL/min梯度40 % -60 % B 液 30min检测214nm转盐的操作步骤I色谱柱平衡2%醋酸+纯水溶液，平衡到基线稳定为止II 进样；III洗脱流动相由2%醋酸+纯水溶液到甲醇溶液，线性梯度洗脱，并收集相应的组分；IV清洗甲醇溶液进行清洗，至基线平稳；V保存色谱柱90%甲醇/水溶液保存色谱柱。⑧将收集的各组分，进行质谱分析，选择目标产物组分，然后冷冻干燥，得到 CW7213成品，其纯度达到99%。
权利要求
1.一种化学合成多肽的分离纯化方法，其特征在于①利用固相多肽合成方法合成多肽，将得到的粗肽加入纯水，温度保持在20-40度，用超声波振荡10-30分钟进行溶解；完全溶解后，膜过滤得到澄清溶液，得到CW7213的粗肽溶液，再先后进行离子交换色谱和反向高效液相色谱的分离纯化；②离子交换色谱分离，采用粒径为5μ m的离子交换色谱填料，流动相为磷酸盐缓冲液与高氯酸钠磷酸盐缓冲液体系，流速lml/min ；③反相制备液相色谱分离，采用粒径为5μπι的反向液相色谱填料，流动相为含三氟乙酸的甲醇/水溶液体系，流速2ml/min ；④转盐，采用粒径为5μ m的反相液相色谱填料，流动相为含醋酸的甲醇/水溶液体系， 流速 2ml/min ；⑤将各收集组分，质谱分析目标产物，然后冷冻干燥，得到多肽成品。
2.根据权利要求1所述的化学合成多肽的分离纯化方法，其特征在于所述的离子交换色谱缓冲液体系为A液50%乙腈+50%含0. lmol/L KH2P04的磷酸水溶液PH3. 3 ;B液 50%乙腈+50%含0. lmol/L KH2PO4,0. lmol/L NACLO4的磷酸水溶液PH3. 3 ；洗脱条件为 0% -60% B 液 30min。
3.根据权利要求1所述的多肽的分离纯化方法，其特征在于所述的反相制备液相色谱的流动相体系为A液5%甲醇+水相中0. 05%三氟乙酸，B液95%甲醇+水相中0. 05% 三氟乙酸；流速为2ml/min ；洗脱条件为40% -50% B液30min。
4.根据权利要求1所述的化学合成多肽的分离纯化方法，其特征在于所述的离子交换色谱柱为 Waters Spherisorb SCX 4. 6 X 250mm。
5.根据权利要求1所述的化学合成多肽的分离纯化方法，其特征在于所述的反相C18 柱为 Kromasil C18 10X250mm。。
6.根据权利要求1所述的化学合成多肽的分离纯化方法，其特征在于所述的转盐流动相体系为A液2%醋酸+纯水，B液甲醇；流速为2ml/min ；洗脱条件为40% -60% B液 30mino
全文摘要
本发明公开了一种多肽CW7213纯化工艺方法，属于生物化学领域中多肽技术领域。其特征在于，利用固相多肽合成方法合成多肽，将得到的粗肽加入纯水，温度保持在20-40度，用超声波振荡10-30分钟进行溶解。溶解后用0.22μm的膜过滤，得到澄清溶液，再进行离子交换制备液相色谱与反向制备液相色谱的分离纯化，即采用离子交换色谱柱和反相C18色谱柱，磷酸盐缓冲系统和含三氟乙酸的甲醇/水系统，进行色谱柱的平衡、进样、吸附、洗脱等工艺，最后进行转盐获得高纯度的多肽样品，实现化学合成多肽的小试制备。
文档编号C07K14/605GK102174100SQ20111000368
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者刘会敏, 孔毅, 薛志婧, 赖伊丽, 颜天华, 黄海 申请人:中国药科大学