专利名称：用于固相肽合成的方法
用于固相肽合成的方法本发明专利申请是国际申请日为2005年10月19日、国际申请号为PCT/ EP2005/011226、进入中国国家阶段的申请号为200580043573. 1、发明名称为“用于固相肽合成的方法”的发明专利申请的分案申请。本发明涉及和改进了抗凝血肽比伐卢定(bivalirudin)，即所谓的“二价水蛭素 (hirulog)”的固相肽合成方法。本发明还涉及相应的肽-固相接合产物，该产物含有结合于树脂的仍受保护的肽。凝血酶抑制剂被认为是很有前途的抗血栓药通过凝血酶进行的蛋白水解过程是血液凝结控制的关键所在。水蛭素是一种获自吸血水蛭——医用水蛭Hirudo medicinalis 的有效治疗性凝血酶肽抑制剂，其包含65个氨基酸。业已证明了水蛭素第45-65位氨基酸的肽片段短肽类似物(即所谓的二价水蛭素)在治疗血栓症(一种危及生命的病症)中的有效性。Okayama 等(1996，Chem. Pharm. Bull. 44 :1344-1350)和 Steinmetzer 等(1999， Eur. J. Biochem. 265 =598-605)发明了在Wang树脂上固相合成不同二价水蛭素的方法，即将Fmoc氨基酸的C末端通过形成酯结合到被酯化为对-苄氧-苄醇基团的树脂上。使用 Wang树脂需要用浓三氟乙酸将肽从树脂上切割下，其中树脂切割等于相伴进行的肽的完全脱保护(global deprotection)。从Wang树脂上通过酸解切割(Acidolytic cleavage)是在强酸性条件下进行了， 且已知如果在酸水解过程中不使用清除剂，则该方法会不可避免地引起作为副反应的Trp 残基不良烷基化(Giraud等，1999，J. P印tide Science 5:457-461)。C末端Trp尤其容易发生该副反应(Atherton等，1988，Tetrahedron 44 :843-857)。烷基化是由Wang树脂接头苯氧基部分产生的芳香性碳鐺离子所造成的。-当二价水蛭素不含Trp残基时，它们在邻近 C末端的位置含有Tyr残基。我们发现并在此首次报告在从Wang树脂切割下时，该Tyr残基同样倾向于对烷基化不稳定，并对产物纯度产生不良的影响。本发明的目的是消除现有技术中的缺点，提供不同的或改进的二价水蛭肽 (Hirulog peptide)合成方法。通过肽-树脂偶联物和本发明的相应合成方法来实现该目的。在本发明中提供了一种用于对肽-固相偶联物进行分离和脱保护，最终获得肽的方法，所述肽优选具有式 D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Gl u-Tyr-Leu.所述肽-固相偶联物包括式I中的2-氯-三苯甲基手臂(handle)
权利要求
1.肽-树脂偶联物A-W，其特征在于，其中 A = Boc-D-Phe-Pro-Arg (R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3)-Gly-Asp (R4)-Phe -Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9) -Leu-O-或 A = Fmoc-D-Phe-Pro-A rg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9) -Leu-O-或 A = NH2-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-As η (R3)-Gly-Asp (R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-, 且其中R2是五甲基二氢苯并呋喃基、金刚烷氧基-羰基或异冰片氧基羰基，R9是叔丁基， R3-R8是酸不稳定性保护基，并且W是如下所示包含树脂手臂或接头的固相复合物， a.如式II所示
2.如权利要求1所述的肽-树脂偶联物，其特征在于，式II的手臂或接头选自 2-氯-三苯甲基、4-甲氧基-三苯甲基、4，4' - 二甲氧基三苯甲基或4-甲基三苯甲基。
3.如权利要求1所述的肽-树脂偶联物，其特征在于，所述固相是聚合的且按照US标准局粒度为100-400目。
4.如权利要求1所述的肽-树脂偶联物，其特征在于，R2是mrf，R3-R9是需要至少 50%三氟乙酸来去除的酸不稳定性保护基。
5.如权利要求4所述的肽-树脂偶联物，其特征在于，R3是三苯甲基，R4、R5、R6、R7和 R8是叔丁基。
6.如权利要求1所述的肽-树脂偶联物，其特征在于，凝血酶切割位点-Arg(I^)-Pro-是-ArgbsiCH2NH]Pro-。
全文摘要
本发明提供了一种用于固相肽合成的方法，还涉及肽-树脂偶联物。
文档编号C07K7/08GK102225966SQ20111011209
公开日2011年10月26日 申请日期2005年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者A·-S·德罗兹, C·温格, J·施尼德里格, N·施图德, O·韦尔比茨基, S·瓦雷 申请人:隆萨股份公司