专利名称：一种硫酸粘杆菌素b的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及多肽类抗生素的制备，具体是一种硫酸粘杆菌素B 的制备方法。
背景技术：
粘杆菌素是由多粘芽孢杆菌产生的，由多种氨基酸和脂肪酸组成的一族碱性环多肽类抗生素的总称。研究到目前为止已发现粘杆菌素A、B、C、D、E、M等多个组分中，其中只有粘杆菌素 B (polymyxin B 简称 polymyxin)、粘杆菌素 E (polymyxin E 简称 Colistin) 具有较低的毒性及良好的抗菌活力。因此对粘杆菌素B和粘杆菌素E研究相对较多，且目前已有相应的产品在临床上使用。临床上常用它们的硫酸盐或甲磺酸盐。粘杆菌素B为抗革兰氏阴性杆菌的抗生素，具杀菌作用，对大多数革兰氏阴性杆菌有较强的抗菌作用，对绿脓杆菌的作用更为显著，对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、流感杆菌、百日咳杆菌、产气杆菌及肺炎杆菌等也有良好的作用。临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。目前制备硫酸粘杆菌素B主要是离子交换法，此方法分离步骤长、收率低、成本高，而且带来大量废水，严重污染环境。
发明内容
针对现有技术的上述问题，本发明提供了一种提高硫酸粘杆菌素B的收率和品质的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的
一种硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于，它依次包括如下步骤
(1)发酵液的预处理将含有粘杆菌素B的发酵液用酸调pH为2.(Γ3. 5，边搅拌边加入 2^5%wt的助滤剂后过滤，得到一次滤液；
(2)减压浓缩将一次滤液在-0.095 -0. 098Mpa下浓缩，温度为5(T90°C，浓缩后得到液相含量为2000(T30000ug/ml的浓缩液；
(3)加热将浓缩液边搅拌边加热至温度为8(T10(TC，保温l(T30min，然后冷却至室温，得到浑浊液；
(4)抽滤按每IOOml浑浊液取0.5 lg助滤剂，将助滤剂加入纯水中，搅拌后进行抽滤形成滤饼层，再向滤饼层加入步骤(3)所得浑浊液进行抽滤，得到二次滤液；
(5)沉淀分离将二次滤液用碱调pH为10.(Γ12.0，搅拌0.5、h，在(TlO°C条件下静止2、h，将沉淀后的二次滤液抽滤，得到滤饼，用纯水洗涤滤饼2 3次，向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至PH为3. (Γ7. 0，得到酸化液；
(6)喷雾干燥将酸化液喷雾干燥后得到硫酸粘杆菌素B，喷雾干燥时进风温度为 140^2000C，出风温度为 7(Tl20°C。针对现有技术存在的缺点，本发明提供了一种制备硫酸粘杆菌素B的新工艺。其特点在于，它不仅提高了硫酸粘杆菌素B的收率和品质，而且更加绿色环保，对硫酸粘杆菌素B的生产具有可持续发展的意义。本发明采用先过滤除去发酵液中的菌体，再浓缩滤液、 加热除去浓缩液中的杂蛋白，然后沉淀分离，最后喷雾干燥，得到硫酸粘杆菌素B。具有专一性强、工序短、设备投资少、收率高、成本低，而且整个过程不采用溶剂，减少环境污染等优点。具体来说，本发明先除去菌体，再进行分离纯化。由于粘杆菌素B是一种多肽类物质，发酵液滤液中的杂蛋白与粘杆菌素B的性质有类似之处，在沉淀分离过程中会同时沉淀出来，影响产品质量，因此，本发明采用加热使杂蛋白变性然后过滤的方法除去杂蛋白， 制备的硫酸粘杆菌素B纯度高、产品质量好。浓缩滤液的目的在于提高滤液的浓度，杂蛋白和粘杆菌素B的含量同时会提高，这样会使加热除去杂蛋白更加彻底，同时也能提高粘杆菌素B沉淀分离时的收率，对整个工艺具有重要作用。沉淀分离是在一定的条件下将粘杆菌素B以某种形式沉淀出来，杂质溶解在溶质中，过滤后得到固体，再将固体用硫酸酸化溶解，得到高纯度的硫酸粘杆菌素B溶液，起到分离纯化的效果，专一性强，产品质量好。作为优选，步骤(1)所述的酸为草酸、硫酸、盐酸、磷酸的一种或多种。作为优选，所述的助滤剂为珍珠岩、硅藻土、纤维素、酸性白土、活性炭、石棉的一种或多种。作为优选，步骤(2)所述温度为6(T70°C。作为优选，步骤(3)所述保温时间为15 20min。作为优选，步骤(5)所述碱为氢氧化钠、氨水、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠的一种或多种。作为优选，步骤(5)所述用碱调pH为10. 5 11. 5。作为优选，步骤(5)所述用稀硫酸调pH为6. (Γ7. 0。作为优选，步骤(6)所述的进风温度为17(Tl80°C。作为优选，步骤(6)所述的出风温度为9(Tl00°C。本发明的主要优点是与现有技术中离子交换法相比具有工序短、废水少、污染少、 成本低，而且总收率高，可达75 80%。
具体实施例方式以下实施例中所述粘杆菌素B发酵液为由多粘芽孢杆菌突变菌株产生的含有粘杆菌素B的发酵液。目前已知多种菌株可发酵得到上述发酵液，例如保藏在美国模式培养物集存库(American type culture collection)即 ATCC 的编号为 ATCC10401、保藏于药用微生物菌种中心(CPCC)的编号为CPCC 140301、CPCC 140855的菌株均能发酵得到粘杆菌素B发酵液。实施例1
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH为2. 7，边搅拌边加入3%wt的珍珠岩助滤剂，通过板框过滤，至无滤液滴出为止，得到一次滤液。板框过滤收率为94. 5%。(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩，温度为75°C，真空度为-0. 098MPa，浓缩至液相含量为^300ug/ml，得到浓缩液。浓缩收率为97. 5%。(3)加热
将浓缩液边搅拌边加热至90°C，保温lOmin，然后冷却至室温，得到浑浊液。(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取0. 9g珍珠岩，将珍珠岩加入纯水中，搅拌后进行抽滤形成滤饼层， 再向滤饼层加入步骤(3)所得浑浊液进行抽滤，得到二次滤液。(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为10. 6，搅拌2. 5 11，在41条件下静止3.5 h，将沉淀后的二次滤液抽滤，得到滤饼，用纯水洗涤滤饼2次，向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH 为6. 2，得到酸化液。沉淀分离收率为84. 5%。(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥，进风温度为190°C，出风温度为105°C，得到硫酸粘杆菌素B。喷雾干燥收率为99%，硫酸粘杆菌素B含量为81. 6%。实施例2
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH为3. 0，边搅拌边加入4. 2%wt的珍珠岩助滤剂，通过板框过滤，至无滤液滴出为止，得到一次滤液。板框过滤收率为95%。(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩，温度为80°C，真空度为-0. 095MPa，浓缩至液相含量为 20000ug/ml，得到浓缩液。浓缩收率为98. 5%。(3)加热
将浓缩液边搅拌边加热至80°C，保温25min，然后冷却至室温，得到浑浊液。(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取0. 8g珍珠岩，将珍珠岩加入纯水中，搅拌后进行抽滤形成滤饼层， 再向滤饼层加入步骤(3)所得浑浊液进行抽滤，得到二次滤液。(5)沉淀分将二次滤液用氨水调PH为10，搅拌3 h，在10°C条件下静止2 h，将沉淀后的二次滤液抽滤，得到滤饼，用纯水洗涤滤饼2次，向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH为3，得到酸化液。沉淀分离收率为86%。(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥，进风温度为200°C，出风温度为110°C，得到硫酸粘杆菌素B。喷雾干燥收率为98. 5%，硫酸粘杆菌素B含量为80. 9%。 实施例3
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH为2，边搅拌边加入2%wt的硅藻土助滤剂，通过板框过滤，至无滤液滴出为止，得到一次滤液。板框过滤收率为97%。(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩，温度为90°C，真空度为-0. 097MPa，浓缩至液相含量为 ^840ug/ml，得到浓缩液。浓缩收率为97. 5%。
5
(3)加热
将浓缩液边搅拌边加热至100°c，保温15min，然后冷却至室温，得到浑浊液。(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取0. 8g硅藻土，将硅藻土加入纯水中，搅拌后进行抽滤形成滤饼层， 再向滤饼层加入步骤(3)所得浑浊液进行抽滤，得到二次滤液。(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为11，搅拌0.5 h，在8°C条件下静止4 h，将沉淀后的二次滤液抽滤，得到滤饼，用纯水洗涤滤饼1次，向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至PH为7。 得到酸化液，沉淀分离收率为88%。(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥，进风温度为180°C，出风温度为120°C，得到硫酸粘杆菌素B。喷雾干燥收率为96%，硫酸粘杆菌素B含量为83. 1%。实施例4
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH为3. 5，边搅拌边加入5%wt的珍珠岩助滤剂，通过板框过滤，至无滤液滴出为止，得到一次滤液。板框过滤收率为98%。(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩，温度为50°C，真空度为-0. 096MPa，浓缩至液相含量为 22400ug/ml，得到浓缩液。浓缩收率为95%。(3)加热
将浓缩液边搅拌边加热至95°C，保温30min，然后冷却至室温，得到浑浊液。(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取Ig珍珠岩，将珍珠岩加入纯水中，搅拌后进行抽滤形成滤饼层，再向滤饼层加入步骤(3)所得浑浊液进行抽滤，得到二次滤液。(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为12，搅拌4 h，在6°C条件下静止3 h，将沉淀后的二次滤液抽滤，得到滤饼，用纯水洗涤滤饼2次，向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH为6. 5， 得到酸化液。沉淀分离收率为87. 5%。(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥，进风温度为170°C，出风温度为70°C，得到硫酸粘杆菌素B。喷雾干燥收率为97%，硫酸粘杆菌素B含量为81. 5%。实施例5
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH3. 2，边搅拌边加入3. 5%wt的珍珠岩助滤剂，通过板框过滤，至无滤液滴出为止，得到一次滤液。板框过滤收率为95%。(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩，温度为65°C，真空度为-0. 098MPa，浓缩至液相含量为 30000ug/ml，得到浓缩液。浓缩收率为96%。(3)加热将浓缩液边搅拌边加热至85°C，保温20min，然后冷却至室温，得到浑浊液。(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取0. 5g珍珠岩，将珍珠岩加入纯水中，搅拌后进行抽滤形成滤饼层， 再向滤饼层加入步骤(3)所得浑浊液进行抽滤，得到二次滤液。(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为11. 5，搅拌3. 5h，在0°C条件下静止3. 5 h，将沉淀后的二次滤液抽滤，得到滤饼，用纯水洗涤滤饼3次，向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至 PH6. 0，得到酸化液。沉淀分离收率为89. 5%。(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥，进风温度为140°C，出风温度为120°C，得到硫酸粘杆菌素B。喷雾干燥收率为97%，硫酸粘杆菌素B含量为82. 4%。
权利要求
1.一种硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于所述方法依次包括如下步骤(1)发酵液的预处理将含有粘杆菌素B的发酵液用酸调PH为2.(Γ3. 5，边搅拌边加入 2^5%wt的助滤剂后过滤，得到一次滤液；(2)减压浓缩将一次滤液在-0.095 -0. 098Mpa下浓缩，温度为5(T90°C，浓缩后得到液相含量为2000(T30000ug/ml的浓缩液；(3)加热将浓缩液边搅拌边加热至温度为8(T10(TC，保温l(T30min，然后冷却至室温，得到浑浊液；(4)抽滤按每IOOml浑浊液取0.5 lg助滤剂，将助滤剂加入纯水中，搅拌后进行抽滤形成滤饼层，再向滤饼层加入步骤(3)所得浑浊液进行抽滤，得到二次滤液；(5)沉淀分离将二次滤液用碱调pH为10.(Γ12. 0，搅拌0. 5^4 h，在(TlO°C条件下静止2、h，将沉淀后的二次滤液抽滤，得到滤饼，用纯水洗涤滤饼2 3次，向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至PH为3. (Γ7. 0，得到酸化液；(6)喷雾干燥将酸化液喷雾干燥后得到硫酸粘杆菌素B，喷雾干燥时进风温度为 140^2000C，出风温度为 7(Tl20°C。
2.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的酸为草酸、硫酸、盐酸、磷酸的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(1)和(3)所述的助滤剂为珍珠岩、硅藻土、纤维素、酸性白土、活性炭、石棉的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(2)所述温度为 60^70 0C ο
5.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(3)所述保温时间为15 20min。
6.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(5)所述碱为氢氧化钠、氨水、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(5)所述用碱调 PH 为 10. 5 11. 5。
8.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(5)所述用稀硫酸调PH为6. (Γ7. 0。
9.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(6)所述的进风温度为17(Tl80°C。
10.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素B的制备方法，其特征在于步骤(6)所述的出风温度为9(Tl00°C。
全文摘要
本发明公开了一种硫酸粘杆菌素B的制备方法。该方法通过发酵液预处理、减压浓缩、加热、沉淀分离和喷雾干燥，从发酵液中提取粘杆菌素B，制备硫酸粘杆菌素B。本发明专一性强、工序短、设备投资少、成本低、废水少、污染少，而且收率高，达75~80%。
文档编号C07K1/14GK102250219SQ20111019283
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者储消和, 刘树鹏, 姚亚红, 熊莉, 生英涛 申请人:浙江升华拜克生物股份有限公司