一种硫酸粘杆菌素的制备方法

文档序号:3509478阅读:342来源:国知局
专利名称:一种硫酸粘杆菌素的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程领域,涉及多肽类抗生素的制备,具体是一种硫酸粘杆菌素的制备方法。
背景技术
粘杆菌素(colistin)是一种对多重耐药性革兰氏阴性致病菌(如铜绿假单胞菌, Pseudomonas ae/T^i/^m )具有特效抗性的多肽类抗生素,粘杆菌素含有二氨基丁酸,存在游离氨基,因此呈碱性,在临床上常制成盐使用,目前商品化以两种形式存在,硫酸粘杆菌素(colistin sulphate,CS)是其中一种形式。硫酸粘杆菌素可用于猪、禽、牛和羊等动物, 由于其抗菌作用强、残留低,不易产生耐药性,中国、美国、欧盟和日本等许多国家批准作为饲料添加剂或兽药。可治疗多种病菌引起的动物饲养疾病,并能促进动物生物和提高饲料的利用率。目前从发酵液中分离粘杆菌素主要有离子交换法、泡沫分离法。采用离子交换法,此方法分离步骤长、设备多、收率低,而且带来大量废水,严重污染环境;采用泡沫分离法分离硫酸粘杆菌素,中国专利申请号200510122187. 3发明公开了一种泡沫分离法制备硫酸粘杆菌素的方法,在起泡过程中,其他肽类物质和蛋白会跟产品同时起泡,带入产品中,影响产品纯度,专一性不强,而且起泡用到溶剂,给环境带来污染,且成本较高。

发明内容
针对现有技术的上述缺陷,本发明提供了一种提高硫酸粘杆菌素的收率和品质的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的
一种硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于,它依次包括如下步骤
(1)发酵液的预处理将含有粘杆菌素的发酵液用酸调PH为2.(Γ3. 5,边搅拌边加入广5%wt的助滤剂后过滤,得到一次滤液;
(2)减压浓缩将一次滤液在-0.095 -0. 098Mpa下浓缩,温度为5(T90°C,浓缩后得到液相含量为2500(T35000ug/ml的浓缩液;
(3)加热将浓缩液边搅拌边加热至温度为8(T10(TC,保温l(T30min,然后冷却至室温,得到浑浊液;
(4)抽滤按每IOOml浑浊液取0.5 lg助滤剂,将助滤剂加入纯水中,搅拌后进行抽滤形成滤饼层,再利用滤饼层对步骤(3)所得浑浊液进行抽滤,得到二次滤液;
(5)沉淀分离将二次滤液用碱调pH为10.(Γ12. 0,搅拌0. 5^4 h,在(TlO°C条件下静止2、h,将沉淀后的二次滤液抽滤,得到滤饼,用纯水洗涤滤饼2 3次,向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至PH为3. (Γ7. 0,得到酸化液;
(6)喷雾干燥将酸化液喷雾干燥后得到硫酸粘杆菌素,喷雾干燥时进风温度为 140^2200C,出风温度为70 120°C。
针对现有技术存在的缺点,本发明提供了一种制备硫酸粘杆菌素的新工艺。其特点在于,它不仅提高了硫酸粘杆菌素的收率和品质,而且更加绿色环保,对硫酸粘杆菌素的生产具有可持续发展的意义。本发明采用先过滤除去发酵液中的菌体,再浓缩滤液、加热除去浓缩液中的杂蛋白,然后沉淀分离,最后喷雾干燥,得到硫酸粘杆菌素。具有专一性强、工序短、设备投资少、收率高、成本低,而且整个过程不采用溶剂,减少环境污染等优点。具体来说,本发明先除去菌体,再进行分离纯化。由于粘杆菌素是一种多肽类物质,发酵液滤液中的杂蛋白与粘杆菌素的性质有类似之处,在沉淀分离过程中会同时沉淀出来,影响产品质量,因此,本发明采用加热使杂蛋白变性然后过滤的方法除去杂蛋白,制备的硫酸粘杆菌素纯度高、产品质量好。浓缩滤液的目的在于提高滤液的浓度,杂蛋白和粘杆菌素的含量同时会提高,这样会使加热除去杂蛋白更加彻底,同时也能提高粘杆菌素沉淀分离时的收率,对整个工艺具有重要作用。沉淀分离是在一定的条件下将粘杆菌素以某种形式沉淀出来,杂质溶解在溶质中,过滤后得到固体,再将固体用硫酸酸化溶解,得到高纯度的硫酸粘杆菌素溶液,起到分离纯化的效果,专一性强,产品质量好。作为优选,步骤(1)所述的酸为草酸、硫酸、盐酸、磷酸的一种或多种。作为优选,所述的助滤剂为珍珠岩、硅藻土、纤维素、酸性白土、活性炭、石棉的一种或多种。作为优选,步骤(2)所述温度为6(T70°C。作为优选,步骤(3)所述保温时间为15 20min。作为优选,步骤(5)所述碱为氢氧化钠、氨水、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠的一种或多种。作为优选,步骤(5)所述用碱调pH为10. 5 11. 5。作为优选,步骤(5)所述用稀硫酸调pH为6. (Γ7. 0。作为优选,步骤(6)所述的进风温度为17(Tl80°C。作为优选,步骤(6)所述的出风温度为9(Tl00°C。本发明的主要优点是与离子交换法相比工序短、设备投资少、废水少、污染少、收率高,达75、5%,与现有技术中泡沫分离法相比专一性强、成本低,而且整个过程不采用溶剂,减少环境污染。
具体实施例方式以下实施例中所述粘杆菌素发酵液,由多粘芽孢杆菌产生的含有粘杆菌素的发酵液。实施例1
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH为2. 5,边搅拌边加入l%wt的珍珠岩助滤剂,通过板框过滤,至无滤液滴出为止,得到一次滤液;板框过滤收率为95% ;
(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩,温度为78 °C,真空度为-0. 095MPa,浓缩至液相含量为 32300ug/ml,得到浓缩液;浓缩收率为98% ;
(3)加热
4将浓缩液边搅拌边加热至88°C,保温lOmin,然后冷却至室温,得到浑浊液;
(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取0. 7g珍珠岩,将珍珠岩助滤剂加入纯水中,搅拌后进行抽滤形成滤饼层,再利用滤饼层对步骤(3)所得浑浊液进行抽滤,得到二次滤液;
(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为10. 6,搅拌1 h,在4°C条件下静止3. 5 h,将沉淀后的二次滤液抽滤,得到滤饼,用纯水洗涤滤饼2次,向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH为 3,得到酸化液;沉淀分离收率为86. 5% ;
(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥,进风温度为140°C,出风温度为105°C,得到硫酸粘杆菌素;喷雾干燥收率为98%,硫酸粘杆菌素含量为79. 5%,生物效价为19986U/mg。实施例2
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH为3. 0,边搅拌边加入3. 5%wt的硅藻土助滤剂,通过板框过滤,至无滤液滴出为止,得到一次滤液。板框过滤收率为96. 5% ;
(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩,温度为80°C,真空度为-0. 098MPa,浓缩至液相含量为 31040ug/ml,得到浓缩液;浓缩收率为99% ;
(3)加热
将浓缩液边搅拌边加热至92°C,保温25min,然后冷却至室温,得到浑浊液;
(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取0. 6g硅藻土,将硅藻土助滤剂加入纯水中,搅拌后进行抽滤形成滤饼层,再利用滤饼层对步骤(3)所得浑浊液进行抽滤,得到二次滤液;
(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为10,搅拌3 h,在10°C条件下静止2 h,将沉淀后的二次滤液抽滤,得到滤饼,用纯水洗涤滤饼3次,向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH为6. 4, 得到酸化液;沉淀分离收率为87% ;
(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥,进风温度为210°C,出风温度为120°C,得到硫酸粘杆菌素;喷雾干燥收率为98. 5%,硫酸粘杆菌素含量为82%,生物效价为22139U/mg。实施例3
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH为2. 8,边搅拌边加入2. 5%wt的硅藻土助滤剂,通过板框过滤,至无滤液滴出为止,得到一次滤液;板框过滤收率为94% ;
(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩,温度为75 °C,真空度为-0. 096MPa,浓缩至液相含量为 30800ug/ml,得到浓缩液;浓缩收率为98. 5% ;
(3)加热
将浓缩液边搅拌边加热至93°C,保温25min,然后冷却至室温,得到浑浊液;(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取0. 5g硅藻土,将硅藻土助滤剂加入纯水中,搅拌后进行抽滤形成滤饼层,再利用滤饼层对步骤(3)所得浑浊液进行抽滤,得到二次滤液;
(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为10. 4,搅拌4 h,在8°C条件下静止3 h,将沉淀后的二次滤液抽滤,得到滤饼,用纯水洗涤滤饼3次,向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH为6. 5 ; 得到酸化液,沉淀分离收率为85% ;
(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥,进风温度为200°C,出风温度为110°C,得到硫酸粘杆菌素;喷雾干燥收率为98%,硫酸粘杆菌素含量为80%,生物效价为21074U/mg。实施例4
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH为2,边搅拌边加入4%wt的珍珠岩助滤剂,通过板框过滤,至无滤液滴出为止,得到一次滤液;板框过滤收率为90% ;
(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩,温度为50°C,真空度为-0. 098MPa,浓缩至液相含量为 25000ug/ml,得到浓缩液;浓缩收率为90% ;
(3)加热
将浓缩液边搅拌边加热至100°C,保温30min,然后冷却至室温,得到浑浊液;
(4)抽滤
按每IOOml浑浊液取1. Og珍珠岩,将硅藻土珍珠岩助滤剂加入纯水中,搅拌后进行抽滤形成滤饼层,再利用滤饼层对步骤(3)所得浑浊液进行抽滤,得到二次滤液;
(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为10. 7,搅拌2. 5 h,在6°C条件下静止4 h,将沉淀后的二次滤液抽滤,得到滤饼,用纯水洗涤滤饼2次,向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH为 6. 2,得到酸化液;沉淀分离收率为86. 5% ;
(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥,进风温度为200°C,出风温度为105°C,得到硫酸粘杆菌素;喷雾干燥收率为97%,硫酸粘杆菌素含量为79. 5%,生物效价为19569U/mg。实施例5
(1)发酵液的预处理
将发酵液用硫酸调PH3. 5,边搅拌边加入5%wt的珍珠岩助滤剂,通过板框过滤,至无滤液滴出为止,得到一次滤液;板框过滤收率为95% ;
(2)减压浓缩
将一次滤液进行减压浓缩,温度为90°C,真空度为-0. 097MPa,浓缩至液相含量为 35000ug/ml,得到浓缩液。浓缩收率为93% ;
(3)加热
将浓缩液边搅拌边加热至80°C,保温^min,然后冷却至室温,得到浑浊液;
(4)抽滤按每IOOml浑浊液取0. 8g硅藻土,将硅藻土助滤剂加入纯水中,搅拌后进行抽滤形成滤饼层,再利用滤饼层对步骤(3)所得浑浊液进行抽滤,得到二次滤液;
(5)沉淀分离
将二次滤液用氨水调PH为12,搅拌0. 5h,在0°C条件下静止3. 5 h,将沉淀后的二次滤液抽滤,得到滤饼,用纯水洗涤滤饼3次,向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH为7, 得到酸化液;沉淀分离收率为86. 5% ;
(6)喷雾干燥
将酸化液用喷雾干燥器进行干燥,进风温度为220°C,出风温度为70°C,得到硫酸粘杆菌素;喷雾干燥收率为98%,硫酸粘杆菌素含量为79. 5%,生物效价为19M5U/mg。
权利要求
1.一种硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于所述方法依次包括如下步骤(1)发酵液的预处理将含有粘杆菌素的发酵液用酸调PH为2.0 3. 5,边搅拌边加入 1 5%wt的助滤剂后过滤,得到一次滤液;(2)减压浓缩将一次滤液在-0.095 -0. 098Mpa下浓缩,温度为50 90°C,浓缩后得到液相含量为25000 35000ug/ml的浓缩液;(3)加热将浓缩液边搅拌边加热至温度为80 100°C,保温10 30min,然后冷却至室温,得到浑浊液;(4)抽滤按每IOOml浑浊液取0.5 Ig助滤剂,将助滤剂加入纯水中,搅拌后进行抽滤形成滤饼层,再利用滤饼层对步骤(3)所得浑浊液进行抽滤,得到二次滤液;(5)沉淀分离将二次滤液用碱调pH为10.0 12. 0,搅拌0. 5 4 h,在0 10°C条件下静止2 4 h,将沉淀后的二次滤液抽滤,得到滤饼,用纯水洗涤滤饼2 3次,向洗涤后的滤饼中边搅拌边加入稀硫酸至pH为3. 0 7. 0,得到酸化液;(6)喷雾干燥将酸化液喷雾干燥,得到硫酸粘杆菌素;喷雾干燥时进风温度为140 220°C,出风温度为70 120°C。
2.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(1)所述的酸为草酸、硫酸、盐酸、磷酸的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(1)和(3)所述的助滤剂为珍珠岩、硅藻土、纤维素、酸性白土、活性炭、石棉的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(2)所述温度为 60 70 。
5.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(3)所述保温时间为15 20min。
6.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(5)所述碱为氢氧化钠、氨水、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(5)所述用碱调 pH 为 10. 5 11. 5。
8.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(5)所述用稀硫酸调pH为6. 0 7. 0。
9.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(6)所述的进风温度为170 180°C。
10.根据权利要求1所述的硫酸粘杆菌素的制备方法,其特征在于步骤(6)所述的出风温度为90 100°C。
全文摘要
本发明公开了一种硫酸粘杆菌素的制备方法。该方法通过发酵液预处理、减压浓缩、加热、沉淀分离和喷雾干燥,从发酵液中提取粘杆菌素,制备硫酸粘杆菌素。其总收率高达75~85%。本发明的制备方法专一性强、收率高、工序短、设备投资少、成本低,而且整个过程不采用溶剂,减少环境污染。
文档编号C07K7/62GK102250220SQ201110192839
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者余炜, 储消和, 孙振华, 熊莉, 赵祖亮 申请人:浙江升华拜克生物股份有限公司
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