专利名称：一种在固体表面固定蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的固定方法，具体地说，涉及是一种利用氮化铝薄膜固定蛋白质的方法，属于生物检测和传感器领域。
背景技术：
近年来，随着生物技术的不断发展，生物传感器和生物芯片的研究和应用日益广泛。如何有效的将蛋白质固定在生物传感器和生物芯片上，是生物检测中的关键问题。目前，在固体表面固定蛋白质常用的固定方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法等，如(1) Hoyer-Hansen G， Hamers M J， Pedersen A N， etc.Loss of ELISA specificity due to biotinylation of monoclonal antibodies. ImmunolMethods 2000，235 (1-2) :91-9 ；Haodan,Wayne M. Mullett and JanuszPawliszyn, Biological sample anysis with immounaffinity solid-phasemicroextraction, The Analyst，2001，126，1456-1461 中所述。虽然上述方法也实现了蛋白质的固定，但是也存在着相应的缺陷，主要有第一，步骤比较繁琐；第二，固定效果不太明显；第三，成本较高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种在固体表面固定蛋白质的方法，使蛋白质高效地固定在固体表面，其优势在于步骤简单、固定效果好、成本低。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤(1)固体表面清洗；(2)在固体表面沉积氮化铝薄膜；(3)蛋白质的固定直接将蛋白质滴加在氮化铝薄膜表面，孵育后冲洗。所述固体表面清洗，是指依次用丙酮、无水乙醇、去离子水各自超声处理3分钟， 氮气吹干。所述固体材料可以为表面平整度和光洁度较高的玻璃、硅片、陶瓷、金属、有机聚合物等。所述的氮化铝薄膜采用溅射、金属有机化学气相沉积或脉冲激光沉积的方法制备。所述的氮化铝薄膜的厚度是10纳米到100纳米。所述氮化铝薄膜通过刻蚀、剥离工艺形成各种图形，实现蛋白质的图形化固定。所述蛋白质的固定，是指在氮化铝薄膜表面滴加蛋白质，恒温孵育后用磷酸缓冲液清洗，氮气吹干。所述恒温孵育，是指37°C温育2小时。所述磷酸缓冲液，是指PH = 7. 0的磷酸缓冲液。本发明的有益效果在于1本发明操作步骤简单，可以省略蛋白质固定中的固体表面修饰和活化过程，缩短了实验周期。2本发明固定蛋白质的含量高、活性好、均勻、牢固。3本发明使用的氮化铝薄膜制备方便，成本较低。4本发明可以通过刻蚀氮化铝薄膜的方法，实现蛋白质固定的图形化。5本发明可以制备的氮化铝薄膜固定表面具有较高的稳定性，易于长时间保存。
具体实施例方式下面对本发明的具体实施例作详细说明本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1本实施例是在以下的实施条件和技术条件要求下实施的本实施例所使用的固体基底为上面覆盖一层100纳米厚金膜的硅片。具体的蛋白质固定过程为(1)将硅片依次放入丙酮、无水乙醇、去离子水中，各自超声清洗3分钟后取出，氮气吹干。(2)利用溅射沉积技术在金膜表面沉积一层厚度为10纳米的氮化铝薄膜。(3)在氮化铝薄膜表面滴加0. 2mg/mL的人IgG，37°C恒温孵育2小时。(4)用PH = 7. 0的磷酸缓冲液冲洗3次，氮气吹干。(5)在氮化铝表面滴加lOmg/mL的牛血清白蛋白封闭液，37°C温育1小时。(6)用PH = 7. O的磷酸缓冲液冲洗3次，氮气吹干。(7)在氮化铝表面滴加0. 2mg/mL的FITC标记羊抗人IgG溶液，37°C温育浊。(8)用PH = 7. O的磷酸缓冲液冲洗3次，氮气吹干。通过荧光显微镜观察，本实施例最终在固体表面的蛋白固定量明显高于金表面巯基自组装共价固定样品，并且蛋白固定层均勻，超声2分钟后无脱落。实施例2本实施例是在以下的实施条件和技术条件要求下实施的本实施例所使用的固体基底为玻璃载玻片。(1)将玻璃载玻片依次放入丙酮、无水乙醇、去离子水中，各自超声清洗3分钟后取出，氮气吹干。(2)利用溅射沉积技术在金膜表面沉积一层厚度为50纳米的氮化铝薄膜。(3)在氮化铝薄膜表面滴加0. 2mg/mL的人IgG，37°C恒温孵育2小时。(4)用PH = 7. O的磷酸缓冲液冲洗3次，氮气吹干。(5)在氮化铝表面滴加lOmg/mL的牛血清白蛋白封闭液，37°C温育1小时。(6)用PH = 7. O的磷酸缓冲液冲洗3次，氮气吹干。(7)在氮化铝表面滴加0. 2mg/mL的FITC标记羊抗人IgG溶液，37°C温育2小时。(8)用PH = 7. O的磷酸缓冲液冲洗3次，氮气吹干。通过荧光显微镜观察，本实施例最终在固体表面的蛋白固定量明显高于金表面巯基自组装膜共价固定样品，并且蛋白固定层均勻，超声2分钟后无脱落。实施例3
本实施例是在以下的实施条件和技术条件要求下实施的本实施例所使用的固体基底为硅片。(1)将硅片依次放入丙酮、无水乙醇、去离子水中，各自超声清洗3分钟后取出，氮气吹干。(2)氮化铝薄膜的图形化旋涂光刻胶5微米并进行光刻，形成与所需要的氮化铝图形相反的光刻胶图形。利用溅射沉积技术在光刻胶表面沉积一层厚度为100纳米的氮化铝薄膜。用丙酮浸泡样品10分钟，去除光刻胶，最终得到氮化铝图形。(3)在氮化铝薄膜表面滴加0. 2mg/mL人IgG，37°C恒温孵育2小时。(4)用PH = 7. 0的磷酸缓冲液冲洗氮化铝薄膜表面3次，氮气吹干。(5)在氮化铝表面滴加lOmg/mL的牛血清白蛋白封闭液，37°C温育1小时。(6)用PH = 7. O的磷酸缓冲液冲洗3次，氮气吹干。(7)在氮化铝表面滴加0. 2mg/mL的FITC标记羊抗人IgG溶液，37°C温育2小时。(8)用PH = 7. O的磷酸缓冲液冲洗3次，氮气吹干。通过荧光显微镜观察，本实施例最终在固体表面的蛋白固定量明显高于金表面巯基自组装膜共价固定样品，并且蛋白固定层均勻，超声2分钟后无脱落。由以上实施例可以看出，本发明操作步骤简单，成本较低，蛋白质的固定量高、活性好、均勻、牢固，并且可以实现图形化固定，可以用于生物领域中生物芯片和生物探针上蛋白质的固定。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
权利要求
1.一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于包括如下步骤(1)固体表面清洗；(2)在固体表面沉积氮化铝薄膜；(3)蛋白质的固定直接将蛋白质滴加在氮化铝薄膜表面，孵育后冲洗。
2.如权利要求1所述的一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于所述固体材料为玻璃、硅片、陶瓷、金属、有机聚合物中一种。
3.如权利要求1所述的一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于所述的氮化铝薄膜采用溅射、金属有机化学气相沉积或脉冲激光沉积的方法制备。
4.如权利要求1或3所述的一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于所述的氮化铝薄膜的厚度是10纳米到100纳米。
5.如权利要求4所述的一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于所述氮化铝薄膜通过刻蚀、剥离工艺形成各种图形，实现蛋白质的图形化固定。
6.如权利要求1所述的一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于所述蛋白质的固定，是指在氮化铝薄膜表面滴加蛋白质，恒温孵育后用磷酸缓冲液清洗，氮气吹干。
7.如权利要求6所述的一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于所述恒温孵育是指37°C温育2小时。
8.如权利要求6所述的一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于所述磷酸缓冲液是指PH = 7. 0的磷酸缓冲液。
9.如权利要求1所述的一种在固体表面固定蛋白质的方法，其特征在于所述固体表面清洗，是指依次用丙酮、无水乙醇、去离子水各自超声处理3分钟，氮气吹干。
全文摘要
本发明公开一种涉及生物传感器领域的在固体表面固定蛋白质的方法，包括如下步骤(1)清洗固体表面；(2)在固体表面沉积氮化铝薄膜；(3)蛋白质的固定直接将蛋白质滴加在氮化铝薄膜表面，孵育后冲洗。本发明可以用于生物领域中生物芯片和生物探针上蛋白质的固定，其优势在于操作步骤简单，成本较低，蛋白质的固定量高、活性好、均匀、牢固，并且可以实现图形化固定。
文档编号C07K17/02GK102399290SQ20111034643
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者张亚非, 徐东, 徐航, 陈达, 韩程章 申请人:上海交通大学