专利名称：人工分枝菌酸膜的制作方法
人工分枝菌酸膜相关申请的交叉引用本申请要求2010年2月23日提交的美国临时申请系列No. 61/307，441，和2010年8月20日提交的美国临时申请系列No. 61/375，707的权利，各通过引用以其整体并入本文。政府许可证权利的声明本发明在由美国健康学会颁发的资金号R01HG005115和5R21HG004145的政府支持下完成。政府在本发明中具有特定权利。
背景技术：
分枝杆菌属(Mycobacterium),包括结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis),开发了抵抗当代多-药物治疗方案的株。随着由结核分枝杆菌(M. tuberculosis)的感染导致的几乎2百万每年死亡及随着由麻风分枝杆菌(M. leprae)感染衰弱的多于200，000人，有对明白分枝杆菌复原的机理的伴随的需求。这些疾病的存留和致死部分是由于不通透的分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞壁。相比大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的细胞壁,分枝杆菌属(Mycobacterium)的独特 8nm厚外部细胞箱具有远远更低的对亲水剂的通透性，且在分枝杆菌属(Mycobacterium)的药物和环境抗性中是关键因素。尽管含有其他成分，分枝杆菌外膜含有30% 40%分枝菌酸。分枝菌酸含有具有不等的长度的2个疏水尾的羧酸头基。见图I例示分枝菌酸。在体内，分枝菌酸通过羧酸基团与肽聚糖或海藻糖共价连接。分枝杆菌膜的显著不通透性导致对亲水溶质通路的需求。此通路由蛋白孔介导。对与结核分枝杆菌(M. tuberculosis)密切关联的耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)的分枝杆菌细胞-壁中的孔隙蛋白的体内研究导致外膜孔隙耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)孔蛋白A (MspA)的发现。在耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)中，MspA是最丰富的蛋白和形成用于亲水营养的主要通路，以横过外膜。已在分枝杆菌属(Mycobacterium)物种中分离OmpATb，另一蛋白孔，及离子转运子，但在它们的天然的环境中它们的行为尚待探索。为了研究孔隙的各种性质，该孔隙常常被嵌入膜中。有对开发用于涉及分枝菌酸膜的这些和其他实验的适合的膜的需求。发明概述本文提供包含分枝菌酸的人工膜，包含该膜的系统，及制造及使用该膜的方法。因此，一些实施方式提供包含分枝菌酸的人工膜。一些实施方式提供由多种分枝菌酸组成的人工膜。一些实施方式提供由多种分枝菌酸和其他脂质的混合物组成的人工膜。其他实施方式提供基本上由多种分枝菌酸和纳米孔组成的人工膜。其他实施方式提供基本上由多种分枝菌酸，其他脂质的混合物，及纳米孔组成的人工膜。还提供的是包含人工膜的系统，所述人工膜包含在第I液体导电介质和第2液体导电介质之间定位的分枝菌酸。也提供的是包括向系统施加电场的方法。
也提供制备包含分枝菌酸的人工未支持的分支菌膜的方法。一实施方式提供制造包含分枝菌酸的人工未支持的膜的方法，其包括(a)用一个或更多分枝菌酸-己烷混合物的包被预处理直径约500nm 约500 μ m的孔及移出己烷以提供干分枝菌酸；(b)将烃溶剂应用于干分枝菌酸，之后是加热以促进烃溶剂掺入以提供分枝菌酸-烃溶剂组合物；(c)在第I液体导电介质和第2液体导电介质之间放置孔；(d)将分枝菌酸-烃溶剂组合物应用于孔，同时监控离子电流通过孔直到孔电阻增加到1ΤΩ以上，之后是迫使液体导电介质之一从反式侧通过孔以根据需要消除离子电流阻断；及&)在孔上放置气泡，之后是气泡收缩，其中由孔电阻增加到IT Ω以上指示膜形成，且其中如果纳米孔可在膜内形成，则指示双层膜形成。
本发明的上述方面和许多伴随优势会变得更容易被同意，如通过参考以下详述结合附图变得更佳明白。图I显示存在于分枝杆菌外膜的例示分枝菌酸的化学结构。见Annu Rev Biochem 64:29 (1995)。图2显示在添加MspA之后随着离散电流步骤而跨分枝菌酸(MA)膜的导电性的变化。观察的电流步骤与在DPhPC膜中观察到的电流水平无法区别。图3显示MA膜(N=330)和DPhPC膜(N=205)的破裂电压的计量的直方图，及包括来自几个不同 20μηι孔的数据。MA膜经MspA蛋白的插入确认。图4提供MA和DPhPC膜中MspA I_V曲线的比较。在负电压，在两个膜中的MspA选通使开放状态电流不明了，及忽略。对于DPhPC膜中的MspA，N=9孔隙，对于MA中的MspA，N=2。图5是在难以形容的膜中MspA的风格化的形式；双链DNA不能穿过孔隙的最小收缩。像不不可计量。图6显示由嵌入MA (红色)或DPhPC (蓝色)膜的MspA孔隙中暂时把持的同聚物腺嘌呤发卡尾导致的离子电流阻断水平。电流表达为在给定电压下开放状态电流的级分。在200mV以上的电压，DPhPC膜变得对于扩展实验太脆性，而MA膜允许在更高得多的电压测量。记录到400mV以上的事件的持续时间对于安心地提取特征性离子电流而言太短。发明详述本文提供包含分枝菌酸的人工膜。这些膜寿命长且高度抗电穿孔，展示它们的普遍强度。分枝菌酸膜适合于，例如，分枝杆菌外膜的控制的研究，和可用于纳米孔分析物转位实验以及以下描述的其他应用。因此，本文提供包含分枝菌酸的人工膜。在本文中的任何实施方式中，膜可为未支持的或栓系的。分枝菌酸可还被定义为修饰的分枝菌酸。修饰的分枝菌酸可为交联的分枝菌酸。分枝菌酸可还被定义为不修饰的分枝菌酸。在一些实施方式中，膜具有平均厚度约5 约22nm。在一些实施方式中，平均厚度为约，至多约，或至少约5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21或22nm或更大，或可来源于它们的任何范围。测量膜厚度的方法在本领域熟知和一例在以下实施例中提供。在一些实施方式中，膜在用IOmM HEPES缓冲到pH8. 0±0. 05的去离子水中的I. OMKCl溶液存在下制备，其当施加穿过膜的电压以约100mV/S渐变时具有约2. OV的平均破裂电压。测定平均破裂电压的一例在本文提供。在一些实施方式中，膜在用IOmM HEPES缓冲到pH8. 0±0. 05的用去离子水制备的I. OM KCl溶液存在下具有抵御大于IV的电压大于几小时的能力。在一些实施方式中，在用IOmMHEPES缓冲到pH8. 0±0. 05的用去离子水制备的1.0M KCl溶液存在下，膜具有抵御大于IV的电压至少约2，3，4或5或更多小时，或可来源于它们的任何范围的能力。在一些实施方式中，膜当除去顺式或反式侧上的缓冲剂时具有对破裂的抗性。当暴露于提供到其顺式侧的PH2 pH9缓冲剂时，膜可形成及改性。在一些实施方式中，膜可在超过55 °C的温度形成及改性。包含分枝菌酸的人工膜可还包含各种物质。在一些实施方式中，膜还包含纳米孔。在一些实施方式中，膜还包含多个纳米孔。任选地，纳米孔是蛋白孔。在一些实施方式中，蛋白孔还被定义为α -溶血素或其变体，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白，或OmpATb。在一些实施方式中，蛋白孔还被定义为α-溶血素或其变体。在一些实施方式中，纳米孔是突变MspA孔蛋白。在一些实施方式中，突变MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。任何膜可还包含药物。在一些实施方式中，药物是结核治疗用抗细菌性药物。在一些实施方式中，膜还包含酶，分子发动机，纳米粒子，光 珠，磁珠，或光。在一些实施方式中，膜还被定义为双层膜。也提供的是由多种分枝菌酸组成的人工膜。也提供的是由多种分枝菌酸和其他脂质的混合物组成的人工膜。—些实施方式提供基本上由多种分枝菌酸和纳米孔组成的人工膜。不实质上影响该实施方式的基本和新特征的材料或步骤包括不影响分枝菌酸的脂质性质或预防膜的形成的那些。一些实施方式提供基本上由多种分枝菌酸，其他脂质的混合物，及纳米孔组成的人工膜。不实质上影响该实施方式的基本和新特征的材料或步骤包括不影响分枝菌酸或其他脂质的脂质性质或预防膜形成的那些。在一些实施方式中，系统提供为包含人工膜，所述人工膜包含在第I液体导电介质和第2液体导电介质之间定位的分枝菌酸。至少一个液体导电介质可包含分析物，诸如核酸或蛋白。在一些实施方式中，膜还包含纳米孔。纳米孔可还被定义为插入膜后形成隧道的蛋白。在一些实施方式中，蛋白是突变耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)孔蛋白A孔蛋白(突变MspA孔蛋白)。在一些实施方式中，突变MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。在一些实施方式中，至少一个液体导电介质包含分析物，其中膜还包含纳米孔，且其中系统用于检测分析物的性质。分析物的性质可为电，化学或物理性质。在一些实施方式中，至少一个液体导电介质包含分析物，其中膜还包含具有隧道的蛋白孔，且其中系统用于通过隧道电泳转位分析物。系统可还包含膜片钳放大器，数据获取装置，一个或更多与第I液体导电介质或第2液体导电介质，或其任何组合交通的温度调控装置。方法可包括向本文所述的任何系统施加电场。一些方法还包括以包括测量随着分析物与纳米孔的开口相互作用的离子电流的方法检测系统中的分析物以提供电流图案，其中电流图案中阻断的呈现指示分析物的存在。在一些实施方式中，施加电场足以导致分析物通过开口电泳转位。方法可还包括鉴定分析物。鉴定分析物可包括比较电流图案与已知的分析物的已知的电流图案。也提供的是制造包含分枝菌酸的人工未支持的膜的方法，其包括(a)用一个或更多分枝菌酸_己烧混合物的包被预处理直径约500nm 约500 μ m的孔及移出己烧以提供干分枝菌酸；(b)将烃溶剂应用于干分枝菌酸，之后是加热以促进烃溶剂掺入以提供分枝菌酸-烃溶剂组合物；(C)在第I液体导电介质和第2液体导电介质之间放置孔；(d)将分枝菌酸-烃溶剂组合物应用于孔，同时监控离子电流通过孔直到孔电阻增加到1ΤΩ以上，之后是迫使液体导电介质之一从反式侧通过孔以根据需要消除离子电流阻断；及&)在孔上放置气泡，之后是气泡收缩，其中由孔电阻增加到1ΤΩ以上指示膜形成，且其中如果纳米孔可在膜内形成，则指示双层膜形成。烃溶剂可为十六碳烷或十六碳烯或可掺入膜的任何其他烃溶剂。采用的烃溶剂类型依赖于想要制备膜的温度。分枝菌酸是作为全部分枝杆菌属(Mycobacterium)的细胞包膜组分的高分子量《
分支的，β_羟基脂肪酸。分枝菌酸含有具有不等的长度的2个疏水尾的羧酸头基。分枝菌酸具有基本结构R2CH(OH) CHR1COOH,其中R1是C2tl C24线性烷和R2是可含有各种数的 碳-碳双键，环丙烷环，甲基枝或氧官能诸如羰基，羧酸和甲氧基的30 60个碳原子的更复合结构。分枝菌酸的结构根据家族和物种而改变。在分枝杆菌细胞包膜中，分枝菌酸作为游离的脂质，诸如二分枝菌酸海藻糖(TDM)或索状因子和单分枝菌酸海藻糖(TMM)存在。它们也可酯化为阿拉伯糖半乳聚糖，肽聚糖-连接的多糖的末端五-阿拉伯糖呋喃糖基单元。在本文中，分枝菌酸可还被定义为任何这些变体。在一些实施方式中，分枝菌酸还被定义为本领域知道的可为天然存在的或合成的海藻糖-修饰的分枝菌酸。见，例如，美国专利No. 4，307, 229,4, 720, 456，5，006, 514和5，049，664，各通过引用以其整体并入本文。该长链脂肪酸的存在是大大地负责分枝杆菌细胞包膜的高疏水性和非常低通透性。分枝菌酸已报道于非分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌物种，例如，棒杆菌属(Corynebacterium)和诺卡菌属(Nocardia)。因而,3种主要类别的分枝菌酸是区别的(The Merck Index, 1989),即( i )白喉菌酸(C28 C4tl酰基链长度)( i i )诺卡分枝菌酸(C4tl C6tl酰基链长度)及(iii)分枝杆菌分枝菌酸(C6tl C9tl酰基链长度)。MA的结构，基序和变异的详述在Prog Lipid Res 37:143 (1998)中提供。MA可购买，诸如自Sigma Aldrich,或如本领域已知制备。见例如,美国专利No. 6，171，830,通过引用以其整体并入本文。分枝菌酸的定义也包括修饰的分枝菌酸。因此，膜可包含一种或更多修饰的分枝菌酸。例如，分枝菌酸可由交联分枝菌酸修饰。分枝菌酸膜可通过端基聚合或通过分枝菌酸的内部基团的交联制成更凝胶-样和稳定。可采用类似于交联二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPhPC)或其他脂质的方法的交联方法，如本领域知道，来制备修饰的分枝菌酸。见，例如，A. Singh and J.M.Schnur, Polymerizable Phospholipids in PhospholipidsHandbook,C. Cevc, ed. , Marcel Dekker Inc.，NY, pp233_287 (1993)。本文所述的膜可包含一种或更多类型的分枝菌酸(S卩，分枝菌酸的混合物)。在一些实施方式中，膜包含约，至少约，或至多约1%，2%，5%，10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%,45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 或更多分枝菌酸，或可来源于它们的任何范围。在一些实施方式中，膜包含100%分枝菌酸。在一些实施方式中，分枝菌酸源于结核分枝杆菌(M. tuberculosis)。说到“人工”，其是指不是天然存在的而是人造的膜。构建包含分枝菌酸的人工膜的能力可提供检查膜中分枝菌酸脂质的设置和构型的新工具。此外，膜可允许通过见于分枝杆菌外膜的外膜孔隙，诸如MspA和可能Rvl689的药物和化学品的控制的检查。该检查可辅助改善分枝杆菌感染的治疗。在分枝杆菌属(Mycobacterium)中的研究之外，膜可提供用于依赖于脂质膜的稳定性的纳米技术(例如，生物-纳米技术)应用的构件。这些包括下一代核酸测序及纳米孔力光谱学。在这点上，本申请通过引用以其整体并入由Jens H. Gundlach, IanM. Derrington,和Marcus D. Collins在2011年2月23日提交到美国受理局的标题为"Analyte Sequencing with Nanopores"的国际申请。本申请也通过引用各以其整 体合并美国临时申请系列No.61/098，938和其相关的PCT申请，WO 2010/034018，标题为"Msp Nanopores and Related Methods”。可随本文公开的分枝菌酸膜采用这些申请中公开的方法。而且，作为在纳米孔测序及分析物检测中的读数机理探索几种类型的可观察的信号。原本建议的，最直接的和最探索的读数方法依赖于通过核苷酸或占据孔隙中最窄的收缩的其他分析物的鉴定来唯一地测定的离子"阻断电流"或"共经过电流"。此方法被称为"阻断电流纳米孔测序”，或BCNS。已在蛋白孔α-溶血素，突变MspA孔蛋白，及固态纳米孔中展示核酸的阻断电流检测和表征。阻断电流检测和表征已显示提供有关在各种情景中经过，或把持进纳米孔的DNA的结构的信息的宿主。类似实验可用嵌入本文所述的分枝菌酸膜的该纳米孔进行。一般而言，"阻断"通过与噪音波动明显可区分的及通常与在孔隙的中心开口分析物分子的存在关联的离子电流的变化来证明。阻断强度会依赖于存在的分析物类型。更特别，"阻断"指称离子电流降到未阻断的电流水平的约5 100%的阈值以下，保持至少l.Oys，及自发返回到未阻断的水平的间隔。例如，离子电流可降到约，至少约，或至多约 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%或100%，或可来源于它们的任何范围的阈值以下。如果直接在其前或后的未阻断的信号具有自典型未阻断的水平偏离未阻断的信号的rms噪音大于两倍的平均电流，则阻断被拒绝。"深度阻断"鉴定为离子电流降到未阻断的水平的〈50%的间隔。电流保持未阻断的水平的80%和50%之间的间隔鉴定为"部分阻断"。在一些实施方式中，可将通过孔隙的离子电流幅度转化为荧光光学系统，如本领域熟知。见，例如，J Amer Chem Soc 13:1652 (2009)。人工分枝菌酸膜也可用于筛选改善了通透性的药物，以明白对药物的膜不通透性，及评价膜中的已知的及未知的药物流出泵(见Trends Microbiol 18:109 (2010))。膜也可用于评价膜蛋白诸如Msp孔蛋白(例如，MspA和突变MspA)和OmpATb作为药物靶。也涵盖的是方法，其中在药物已呈递到膜的反式或顺式侧之后观察到分枝菌酸膜的穿孔。可通过监控离子电流或通过采用荧光粒子，或通过观察在膜的另一侧的药物来观察膜的穿孔。也涵盖的是适应于执行该方法的系统。如本文所用，"未支持的膜"是跨在沿着膜表面的任意侧上无支持物的孔的开口的膜。膜在任意侧或两侧具有液体，气体或真空，但不与任意侧上的固体(基材)接触。如本文所用，"栓系的膜"是分枝菌酸的头基附接，或栓系到基材(例如，塑料，玻璃，芯片，珠)的膜。通过头基的化学修饰将脂质附接到基材以形成栓系的膜的方法为本领域熟知，及该方法可用于类似地修饰及附接分枝菌酸的头基。"纳米孔"指称具有在其最窄点具有约O.3nm 约2nm的直径的开口的孔隙。例如，纳米孔可为固态纳米孔，石墨烯纳米孔，弹性体纳米孔，或可为插入双层，薄膜，膜或固态孔后形成隧道的天然存在的或重组蛋白，也在本文称之为蛋白孔或蛋白纳米孔(例如，跨膜孔隙)。如果蛋白插入膜，则蛋白是隧道-形成蛋白。测定是否蛋白是隧道-形成蛋白的方法为本领域熟知。例如，可通过测定是否蛋白插入双层来测定是否Msp孔蛋白形成隧道，诸如描述于美国临时申请系列No. 61/098，938和其相关的PCT申请，WO 2010/034018，各通过引用以其整体并入本文，及Proc Natl Acad Sci 105:20647 (2008)。一般而言，隧通形成通过观察导电性的离散变化来检测。见，例如，Mol Microbiol33:933 (1999)。开口一般处于与纳米孔的顺式和反式侧液体或气体交通。纳米孔可包含固态材料，诸如氮化硅， 修饰的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其组合(例如，纳米孔可通过制造第ISiN孔来制备，将石墨烯片材放到其上，然后在石墨烯中制造纳米孔)。蛋白纳米孔(也称之为蛋白孔)的非限制性例包括ct -溶血素和其变体,耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白，及 OmpATb。"液体介质"包括水性，有机-水性和仅有机液体介质。有机介质包括，例如，甲醇，乙醇，二甲基亚砜和其混合物。在本文所述的方法中可采用的液体为本领域熟知。该介质，包括导电液体介质的描述和例提供于美国专利No. 7，189，503，例如，通过引用以其整体并入本文。可将盐,去污剂或缓冲剂加入该介质。可采用该剂来改变液体介质的pH或离子强度。粘度-改变物质，诸如甘油或各种聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，聚乙烯基醇，纤维素聚合物)和其混合物，可包括在液体介质中。任何实施方式中采用的第I和第2液体介质可相同或不同，及任意者或两者可包含一种或更多盐，去污剂，或缓冲剂。任选地，至少一个液体介质是导电的。任选地，至少一个液体介质不是导电的。液体介质可包含本文所述的任何分析物。在本文中的任何实施方式中，分析物可为核苷酸，核酸，氨基酸，肽，蛋白，聚合物，药物，离子，污染物，纳米观对象，或生物学战剂。任选地，分析物是聚合物，诸如蛋白，肽，或核酸。任选地，聚合物是核酸。核酸可为ssDNA，dsDNA，RNA，或其组合。本文所述的任何分析物可包含光珠或磁珠。如本文所用，"药物"指称可改变受试者的生物学过程的任何物质。药物可设计或用于受试者的疾病，病症，综合征或其他健康痛苦的诊断，治疗或预防。药物可为在性质上休养的，即，简单用来改变生物学过程及不用于受试者的疾病，病症，综合征或其他健康痛苦的诊断，治疗或预防。生物制品，其指称通过涉及重组DNA技术的生物学机理产生的物质，也被术语"药物"包括。药物包括，例如，抗细菌剂，抗炎剂，抗凝剂，抗病毒剂，抗高血压药，抗抑郁药，抗微生物剂，镇痛药，麻醉剂，β -阻断剂，双膦酸盐，化学治疗剂，造影剂，生育药品，致幻剂，激素，麻醉药，阿片剂，镇静剂，抑制素，留和血管扩张剂。药物的非限制性例也可见于Merck Index。结核治疗中使用的抗细菌性药物，例如，包括异烟肼，利福平，吡嗪酰胺和乙胺丁醇。
如本文所用，"聚合物"指称包含2个或更多线性单元的分子(也称之为"聚体")，其中各单元可相同或不同。聚合物的非限制性例包括核酸，肽和蛋白，以及各种烃聚合物(例如，聚乙烯，聚苯乙烯)及官能化的烃聚合物，其中聚合物主链包含碳链(例如，聚氯乙烯，聚甲基丙烯酸酯)。聚合物包括共聚物，嵌段共聚物及分支的聚合物诸如星状聚体和树状聚体。如本文所用，"生物学战剂"指称任何能导致植物或动物(包括人)死亡或疾病或食品或水供给降解，或环境降解的该微生物的任何生物或任何天然存在的，生物加工的或合成的组分。非限制性例包括埃博拉病毒，Marburg病毒，炭疽芽孢杆菌(BaciIIusanthracis)和肉毒梭菌(Clostridium botulinum),重型天花(Variola major),轻型天花(Variola minor),炭疽和蓖麻毒素。如本文所用，"污染物"指称污染空气，水或土壤的物质。污染物的非限制性例包括肥料，杀虫剂，杀昆虫剂，去污剂，石油烃，烟和含有重金属的物质，诸如含有锌，铜或汞(例如，甲基汞)的那些。
如本文所用，"氨基酸"指称见于蛋白的20种天然存在的氨基酸的任何，天然存在的氨基酸的D-立体异构体(例如，D-苏氨酸)，非天然的氨基酸，及化学修饰的氨基酸。氨基酸的各这些类型不是相互排他的。&氨基酸包含氨基，羧基，氢原子，及称之为"侧链"的特征性的基团所键合的碳原子。天然存在的氨基酸的侧链为本领域熟知及包括，例如，氢(例如，如在甘氨酸)，烷基(例如，如在丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸)，取代的烷基(例如，如在苏氨酸，丝氨酸，甲硫氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，精氨酸和赖氨酸)，芳基烷基(例如，如在苯丙氨酸和色氨酸)，取代的芳基烷基(例如，如在酪氨酸)，及杂芳基烷基(例如，如在组氨酸)。以下缩写用于20种天然存在的氨基酸丙氨酸(Ala;A)，天冬酰胺(Asn;N)，天冬氨酸(Asp;D)，精氨酸(Arg;R)，半胱氨酸(Cys;C)，谷氨酸(Glu;E)，谷氨酰胺(Gln;Q)，甘氨酸(Gly;G)，组氨酸(His;H)，异亮氨酸(116;1)，亮氨酸(1^11丄)，赖氨酸(1^8;10，甲硫氨酸(Met;M),苯丙氨酸(Phe;F)，月甫氨酸(Pro;P)，丝氨酸(Ser; S)，苏氨酸(Thr;T),色氨酸(Trp; W),酪氨酸(Tyr; Y),及纟颜氨酸(Val; V)。非天然的氨基酸(S卩，不天然地见于蛋白的那些)也为本领域熟知，如见于，例如，Mol Cell Biol 9:2574 (1989)；J Amer Chem Socll2:4011-4030 (1990)；J Amer Chem Soc56:1280-1283 (1991) ；J Amer Chem Soc 113:9276-9286 (1991);及该文引用的全部参考
文献。和￥氨基酸为本领域所知及也涵盖在本文为非天然的氨基酸。以下表显示在本
文涵盖的非天然的氨基酸的非限制性例。表I.例示非天然的氨基酸
氨基酸FmM氨基酸
Aad 2-氨基己二酸EtAsnN-乙基天冬酰胺
Baad 3-氨基己二酸H^l轻基赖氨酸Bala~ e-丙氨酸，e-氨基-丙酸AHyl别-羟基赖氨酸
Ib^2-氨基丁酸3-羟脯氨酸
4Abu 4-氨基丁酸，哌啶酸4H^4-羟脯氨酸
^6-氨基己酸Id^异锁链素
2-氨基庚酸AH^别-异亮氨酸
Hb2-氨基异丁酸N-甲基甘氨酸，肌氨酸
Baib 3-氨基异丁酸MeIleN-甲基异亮氨酸
Apm2-氨基庚二酸MeLys6N-甲基赖氨酸 2,4- 二氨基丁酸MeValN-甲基缬氨酸
Des锁链素Nva正缴氨酸
2,2' - 二氨基庚二酸Nl^正亮氨酸
2, 3- 二氨基丙酸鸟氨酸 EtGly N-乙基甘氨酸如本文所用，"化学修饰的氨基酸"指称其侧链已化学修饰的氨基酸。例如，可将侧链修饰为包含信号传导部分，诸如荧光团或放射性标记。可将侧链修饰为包含新官能团，诸如氢硫基，羧酸，或氨基。翻译后修饰的氨基酸也包括在化学修饰的氨基酸的定义中。如本文所用，"肽"指称由酰胺键(即，"肽键")接合在一起的2个或更多氨基酸。肽包含达或包括50个氨基酸。肽可为线性或环状。肽可为α，β，Υ，δ或更高，或混合的。肽可包含本文定义的氨基酸的任何混合物，诸如包含D，L，α, β, y, δ或更高氨基酸的任何组合。如本文所用，"蛋白"指称具有51个或更多氨基酸的氨基酸序列。术语"核酸"指称单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，及除非另外限制的，包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交的天然的核苷酸的已知的类似物，诸如肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯DNA。除非另外指示的，特定核酸序列包括其互补序列。核苷酸包括，但不限于，ATP，dATP, CTP，dCTP, GTP，dGTP, UTP，TTP，dUTP，5_ 甲基-CTP，5-甲基-dCTP, ITP，dITP，2-氨基-腺苷-TP，2-氨基-脱氧腺苷-TP，2-三磷酸硫代胸苷，吡咯并-三磷酸嘧啶，及2-硫代胞苷，以及以上全部的α硫代三磷酸酯，及全部以上碱基的2’ -O-甲基-核糖核苷酸三磷酸酯。修饰的碱基包括，但不限于，5-Br-UTP，5-Br-dUTP, 5-F-UTP，5-F-dUTP，5-丙炔基 dC TP，及 5-丙炔基-dUTP。"分子发动机"为本领域熟知且指称与分析物，诸如聚合物(例如，多核苷酸)物理学相互作用及能相对固定的位置，诸如纳米孔的开口(例如，Msp孔蛋白的隧道)物理学运动分析物的分子(例如，酶)。尽管不旨在被理论束缚，分子发动机利用化学能量以产生机械力。在一些实施方式中，分子发动机可以连续方式与聚合物的各单元(或”聚体”)相互作用。分子发动机的非限制性例包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，解螺旋酶，核糖体和外切核酸酶。也知道非-酶促发动机，诸如包装DNA的病毒发动机。见Nature 413:748(2001)。各种分子发动机和该发动机的期望性质描述于美国专利No. 7，238，485，通过引用以其整体并入本文。分子发动机可布置在膜的顺式侧或反式侧和可任选地固定，诸如描述于^ 485专利。将分子发动机合并入纳米孔的方法可使用，例如，描述于’ 485专利的方法进行。关于包含本文也所述的纳米孔的膜可采用描述于’ 485专利的系统和设备。分子发动机也讨论于，例如，J Amer Chem Soc 130:818 (2008)；Nature Nanotech 2:718 (2007);及 ACS Nano3:1457(2009)。也可在本文所述的纳米孔和膜的情景中采用如描述于WO 2010/034018，通过引用以其整体并入本文的分子发动机。可采用的珠包括磁珠和光珠。例如，可使用链霉亲和素-包被的磁珠来施加拉DNA通过纳米孔的开口的静电力的相反的力。在此后来的技术中，磁珠附接于生物素化的DNA，及会使用强磁场梯度施加与静电驱动力可比较的力( ΙΟρΝ)。见Biophys J 82:3314(2002)。以此方式，阻断-电流读数会未受影响，但对DNA的力可独立地控制。几十或几百 的各DNA的完全，独立读数可然后关联及组装以重构精确的DNA序列。在一些实施方式中，珠可用于可视化膜的位置或指示膜破裂了。后者在不有用或可能测量离子电流的情况中有用。如本文所用，"纳米粒子"指称具有一个或更多IOOnm或更小量级的尺度的粒子。"纳米观对象”是在2个其尺度小于IOOnm的对象。如本文所用，"膜的顺式侧"指称放置任何分析物的膜侧，其中分析物任选地转位。如果无分析物检查，经灌注可接近的膜侧被认为是膜的顺式侧。如果膜的两侧是经灌注等同可接近的，则顺式侧可被定义为操作子。如本文所用，"膜的反式侧"指称与膜的顺式侧相反的膜侧。分枝菌酸膜可包含非分枝菌酸的脂质。脂质是本领域中已知的一类分子且含有疏水尾和亲水头基。见，例如，美国专利No. 7，514，267，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，脂质是3 28个碳的链长度及具有O 6个不饱和的键的饱和的或不饱和的脂肪酸。脂质可具有2个烃链，一般是酰基链，及头基，极性或非极性的。有各种合成和天然存在的脂质，包括磷脂，诸如磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酸，磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中2个烃链一般长度在约14 22个碳原子之间，及具有变化程度的不饱和。可包含在分枝菌酸膜的磷脂包括天然或合成磷脂。非限制性例包括磷脂酰胆碱(PO,磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI )，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酸(PA)，磷脂酰丝氨酸(PS)，及鞘磷脂(SM)。磷脂中的脂肪酰基链通常是至少约7个碳原子长，一般12 20个碳长，及可完全饱和或部分不饱和的。磷脂的其他例包括磷脂酰胆碱，诸如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC或DPhPC)，二月桂基磷脂酰胆碱(DLPC) C12: 0，二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)C14: 0，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二植烷酰磷脂酰胆碱，十九烷酰磷脂酰胆碱，花生酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC) (C18:l)，二棕榈油酰磷脂酰胆碱(C16:l)，亚油酰磷脂酰胆碱(C18:2)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二油酰磷脂酰甘油(D0PG)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油(P0PG)，二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)大豆卵磷脂，卵黄卵磷脂，鞘磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，二磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺和磷脂酸。可使用的其他脂质包括1，2- 二酰基-sn-甘油基_3_[磷酸-消旋_(1_甘油)]，1，2- 二酰基-sn-甘油基_3-[磷酸-L-丝氨酸]，1，2- 二酰基_sn_甘油基_3_磷酸胆碱，1，2- 二酰基-sn-甘油基-3-磷酸和1，2- 二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，其中二酰基可为对称或不对称的，且含有链长度3 28个碳及具有达6个不饱和的键的各种类型的饱和的或不饱和的脂肪酸。其他脂质包括卵磷脂酰胆碱(EPC)，I, 2- 二肉豆蘧酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)，及1，2- 二肉豆蘧酰-sn-甘油基_3_[磷酸-消旋_(1_甘油)]。在一些实施方式中，非-磷脂，中性脂质，糖脂，胆留醇，留醇，留等包括在膜中。在一些实施方式中，使用阴离子脂质。阴离子脂质的例包括磷脂酸(PA)，磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰胆碱(PC)，I, 2- 二肉豆蘧酰-sn-甘油基-3-[磷酸-消旋-(I-甘油)](DMPG)。阳离子脂质也可使用，在一些实施方式中。该阳离子脂 质一般具有亲脂性部分，诸如留醇，酰基或二酰基链，且其中脂质具有总体净正电荷。月旨质的头基可携带正电荷。例示阳离子脂质包括1，2- 二油基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP) ；Ν-[1-(2, 3，- 二 -十四烷基氧基)丙基]-N，N- 二甲基-N-羟乙基铵溴化物(DMRIE) ;Ν-[1-(2，3，-二油基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟基乙基铵溴化物(DORIE)；N-[I-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵氯化物(D0TMA);3 [N-(N' ,N' - 二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆留醇(DC-Chol);及二甲基二-十八烷基铵(DDAB)。脂质也可为中性脂质，诸如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或两亲性脂质，诸如磷脂，用阳离子脂质衍生的，诸如聚赖氨酸或其他聚胺脂质。在一些实施方式中，选择脂质以达到膜的特定的程度的流动性或刚性，以控制膜的稳定性，或以控制膜内截留的剂(例如，分析物)的释放速度。例如，饱和的脂质可在脂质双层中贡献更大膜刚性。其他脂质组分，诸如胆留醇，也已知在脂质双层结构贡献于膜刚性。如本文所用，"转位"和语法变体是指进入纳米孔的开口的一侧及移动到及移动出开口的另一侧。特别涵盖包含转位的本文的任何实施方式可指称电泳转位或非-电泳转位，除非特别提及。电场可移动分析物使得其与开口相互作用。说到“相互作用”，其是指分析物移动入及，任选地，通过开口，其中"通过开口"(或"转位")是指进入开口的一侧及移动到及移动出开口的另一侧。任选地，涵盖不采用电泳转位的方法，诸如物理压力或磁压力，当采用磁珠时。"耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)"或"Msp 孔蛋白"指称包含2个或更多Msp单体的多聚体复合物。Msp单体由耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)中的基因编码。耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)具有4种鉴定的Msp基因，表不为MspA, MspB,MspC和MspD。Msp孔蛋白可，例如，包含野生型MspA单体,突变MspA单体,野生型MspA旁系同原物或同源物单体，或突变MspA旁系同原物或同源物单体。任选地，Msp孔蛋白是单链Msp孔蛋白或为几种单链Msp孔蛋白的多聚体。单链Msp孔蛋白可，例如包含由2个或更多由一种或更多氨基酸接头肽连接的Msp单体(例如，8单体)形成的多聚体。部分单链Msp孔蛋白指称必需二聚化，三聚化等而形成孔蛋白的单链多聚体复合物。全单链Msp孔蛋白指称无需二聚化，三聚化等而形成孔蛋白的形成孔蛋白的单链多聚体复合物。Msp孔蛋白为本领域所知，是制造突变Msp孔蛋白的方法。国际申请W02010/034018，通过引用以其整体并入本文，描述许多这些孔蛋白和制造这些孔蛋白的方法。"前庭"指称Msp孔蛋白内部的锥-形部分，其直径通常从一端到另一端沿着中心轴减小，其中前庭的最窄的部分连接于收缩区域。前庭也可被称为"杯状体"。见WO2010/034018的图I的野生型MspA孔蛋白的前庭的一例。前庭和收缩区域一起定义Msp孔蛋白的隧道。当说到Msp孔蛋白的前庭直径时，需知，因为前庭是锥-样形状，直径沿着中心轴的路径变化，其中直径是一端相比对置的端更大。直径可在约2nm 约6nm范围。任选地，直径为约，至少约，或至多约 2,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2，
3.3，3. 4，3. 5，3. 6，3. 7，3. 8，3. 9，4. 0，4. 1，4. 2，4. 3，4. 4，4. 5，4. 6，4. 7，4. 8，4. 9，5. 0，5. 1，5. 2，5. 3，5. 4，5. 5，5. 6，5. 7，5. 8，5. 9或6. Onm,或可来源于它们的任何范围。中心轴的长度可在约2nm 约6nm范围。任选地，长度为约，至少约，或至多约2，2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5，2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5,3. 6,3. 7,3. 8,3. 9,4. 0,4. 1,4. 2,4. 3,4. 4,
4.5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9, 5. O, 5. 1, 5. 2, 5. 3, 5. 4, 5. 5, 5. 6, 5. 7, 5. 8, 5. 9 或 6. Onm,或可来源于它们的任何范围。当在本文指称"直径"时，可通过测量中心-到-中心距离或原子表面-到-表面距离来测定直径。"收缩区域"指称Msp孔蛋白的隧道的最窄的部分，从连接于前庭的直径而言。野生型MspA孔蛋白的收缩区域显示于WO 2010/034018的图1(标记的"内部收缩")。收缩区域的长度可在约O. 3nm 约2nm范围。任选地，长度为约，至多约，或至少约O. 3,0. 4，
0.5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9，I. O, I. I, I. 2，I. 3，I. 4，I. 5，I. 6，I. 7，I. 8，L 9，2 或 3nm,或可来源于它们的任何范围。收缩区域的直径可在约0.3nm 约2nm范围。任选地，直径为约，至多约，或至少约 O. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9，I. O, I. 1，I. 2，I. 3，I. 4，I. 5，I. 6，I. 7，I. 8，
1.9，2或3nm，或可来源于它们的任何范围。"中性收缩区域"指称当浸溃到水溶液时包含累积呈现无净电荷的氨基酸侧链的收缩区域。与收缩区域接触的液体介质(例如，缓冲的水溶液)的PH可影响是否收缩区域表征为中性或非中性。"隧道"指称气体，液体，离子或分析物可经过的被定义为前庭和收缩区域的Msp孔蛋白的中心，空部分。隧道是纳米孔的开口的一例。"突变MspA孔蛋白"是与其对应野生型MspA孔蛋白具有至少或至多70，75，80，85，90，95，98或99%或更高同一性，或可来源于它们的任何范围，但小于100%，及保留隧道-形成能力的多聚体复合物。突变MspA孔蛋白可为重组蛋白。任选地，突变MspA孔蛋白是在野生型MspA孔蛋白的收缩区域或前庭内具有突变的蛋白。任选地，突变可在野生型MspA孔蛋白的边缘或周质环之外发生。突变MspA孔蛋白可在本文所述的任何实施方式中米用。尤其是说到MspA孔蛋白，任选地,MspA孔蛋白是由8个184-氨基酸MspA单体组成的八聚体。一个或更多突变可在野生型MspA孔蛋白的一个或更多氨基酸MspA单体中发生，以产生突变MspA孔蛋白。此外，MspA孔蛋白可具有少于或多于8个单体，其中任何一个或更多可包含突变。野生型MspA孔蛋白包含由13个氨基酸组成及直接相邻于收缩区域的周质环。见J Biol Chem 284:10223(2009)。野生型MspB，C和D孔蛋白也含有周质环。一个或更多突变可在野生型Msp孔蛋白的周质环中发生以产生突变Msp孔蛋白。例如,达全部13个氨基酸的缺失可在野生型MspA孔蛋白的周质环中发生。一般而言，周质环中的缺失不影响Msp孔蛋白的隧道-形成能力。Msp孔蛋白或Msp单体也可为化学或生物学修饰的。例如，可用化学品修饰Msp孔蛋白或Msp单体以产生二硫桥，如本领域技术人员知道。Msp孔蛋白可包含核苷酸结合位点。如本文所用，"核苷酸结合位点"指称Msp孔蛋白中的位点其中核苷酸与氨基酸保持接触，或处于与氨基酸接触长于可归因于扩散移动的时间，诸如大于Ips或Ins。可采用分子动力学计算来评定这些临时静止时间。Msp孔蛋白中的一个或更多突变可在蛋白的前庭或收缩区域发生。任选地，突变Msp孔蛋白相比野生型Msp孔蛋白，在其周质环，前庭或收缩区域氨基酸序列中具有至少一个差异(例如，缺失，取代，添加)。其他任选的突变在本文所述。 本文的任何实施方式的Msp孔蛋白可为本文所述的任何Msp孔蛋白，诸如野生型MspA孔蛋白，突变MspA孔蛋白，野生型MspA旁系同原物或同源物孔蛋白，或突变MspA旁系同原物或同源物孔蛋白。Msp孔蛋白可由编码单链Msp孔蛋白的核酸序列编码。这里的任何Msp孔蛋白可包含本文所述的任何Msp单体,诸如突变Msp单体。营养经过分枝杆菌属(Mycobacterium)的野生型孔蛋白。野生型MspA孔蛋白，野生型MspB孔蛋白，野生型MspC孔蛋白，及野生型MspD孔蛋白是野生型隧道-形成孔蛋白的例。Msp孔蛋白可还被定义为本文所述的任何Msp孔蛋白，包括旁系同原物，同源物，突变体和单链孔蛋白。例示野生型MspA旁系同原物和同源物提供于表2。提供的是野生型MspA旁系同原物，其包括野生型MspB，野生型MspC和野生型MspD。本文定义的“旁系同原物”是自具有类似结构和功能的相同的细菌物种的基因。本文定义的“同源物”是自具有类似结构和进化来源的另一细菌物种的基因。作为一例，提供的是野生型MspA同源物，其包括MppA，PorMl, PorM2, PorMl 和 Mmcs4296。
表2.例示野生型MspA和野生型MspA旁系同原物和同源物单体
权利要求
1.人工膜，其包含分枝菌酸。
2.权利要求I的膜，其包含多种分枝菌酸。
3.权利要求I的膜，其还被定义为未支持的膜。
4.权利要求I的膜，其还被定义为栓系的膜。
5.权利要求I的膜，其中分枝菌酸还被定义为修饰的分枝菌酸。
6.权利要求5的膜,其中修饰的分枝菌酸是交联的分枝菌酸。
7.权利要求I的膜，其具有平均厚度约5 约22nm。
8.权利要求I的膜，其在用IOmMHEPES缓冲到pH8. 0±0. 05的去离子水中的I. OM KCl溶 液存在下制备，其当施加穿过膜的电压以约100mV/S渐变时具有约2. OV的平均破裂电压。
9.权利要求I的膜，其在用IOmMHEPES缓冲到pH8. 0±0. 05的用去离子水制备的I. OMKCl溶液存在下具有抵御大于IV的电压大于2小时的能力。
10.权利要求I的膜，其当除去顺式或反式侧上的缓冲剂时具有对破裂的抗性。
11.权利要求I的膜，其还包含纳米孔。
12.权利要求11的膜，其还包含多个纳米孔。
13.权利要求11的膜，其中纳米孔是蛋白孔。
14.权利要求13的膜，其中蛋白孔还被定义为α-溶血素或其变体，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白，或 OmpATb。
15.权利要求14的膜，其中蛋白孔还被定义为α-溶血素或其变体。
16.权利要求13的膜，其中纳米孔是突变MspA孔蛋白。
17.权利要求16的膜，其中突变MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。
18.权利要求I 17之任ー项的膜，其还包含药物。
19.权利要求18的膜，其中药物是结核治疗用抗细菌性药物。
20.权利要求I 17之任ー项的膜，其还包含酶，分子发动机，纳米粒子，光珠，磁珠，或光。
21.权利要求I的膜，其还被定义为双层膜。
22.人工膜，其由多种分枝菌酸组成。
23.人工膜，其由多种分枝菌酸和其他脂质的混合物组成。
24.人工膜，其基本上由多种分枝菌酸和纳米孔组成。
25.人工膜，其基本上由多种分枝菌酸，其他脂质的混合物，及纳米孔组成。
26.权利要求22 25之任ー项的膜,其还被定义为未支持的膜。
27.权利要求22 25之任ー项的膜，其还被定义为栓系的膜。
28.系统,其包含人工膜,所述人工膜包含在第I液体导电介质和第2液体导电介质之间定位的分枝菌酸。
29.权利要求28的系统，其中至少ー个液体导电介质包含分析物。
30.权利要求29的系统，其中分析物是核酸或蛋白。
31.权利要求30的系统，其中膜还包含纳米孔。
32.权利要求31的系统，其中纳米孔还被定义为插入膜后形成隧道的蛋白。
33.权利要求32的系统,其中蛋白是突变耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白A孔蛋白(突变MspA孔蛋白)。
34.权利要求33的系统，其中突变MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。
35.权利要求28的系统，其中至少ー个液体导电介质包含分析物，其中膜还包含纳米孔，且其中系统用于检测分析物的性质。
36.权利要求28的系统，其中至少ー个液体导电介质包含分析物，其中膜还包含具有隧道的蛋白孔，且其中系统用于通过隧道电泳转位分析物。
37.权利要求28的系统，其还包含膜片钳放大器，数据获取装置，一个或更多与第I液体导电介质或第2液体导电介质，或其任何组合交通的温度调控装置。
38.权利要求28 37之任ー项的系统,其中膜还被定义为未支持的膜。
39.权利要求28 37之任ー项的系统,其中膜还被定义为栓系的膜。
40.方法,其包括向权利要求28 37之任一项的系统施加电场。
41.权利要求40的方法，其还包括以包括测量随着分析物与纳米孔的开ロ相互作用的离子电流的方法检测系统中的分析物以提供电流图案，其中电流图案中阻断的呈现指示分析物的存在。
42.权利要求41的方法，其中施加电场足以导致分析物通过开ロ电泳转位。
43.权利要求42的方法，其还包括鉴定分析物。
44.权利要求43的方法，其中鉴定分析物包括比较电流图案与已知的分析物的已知的电流图案。
45.制造包含分枝菌酸的人工未支持的膜的方法，其包括 (a)用一个或更多分枝菌酸-己烧混合物的包被预处理直径约500nm 约500μ m的孔及移出己烷以提供干分枝菌酸； (b)将烃溶剂应用于干分枝菌酸，之后是加热以促进烃溶剂掺入以提供分枝菌酸-烃溶剂组合物； (C)在第I液体导电介质和第2液体导电介质之间放置孔； Cd)将分枝菌酸-烃溶剂组合物应用于孔，同时监控离子电流通过孔直到孔电阻増加到1ΤΩ以上，之后是迫使液体导电介质之ー从反式侧通过孔以根据需要消除离子电流阻断；以及 (e)在孔上放置气泡，之后是气泡收缩，其中由孔电阻増加到1ΤΩ以上指示膜形成，且其中如果纳米孔可在膜内形成，则指示双层膜形成。
46.权利要求45的方法，其中烃溶剂是十六碳烷。
47.权利要求45的方法，其中烃溶剂是十六碳烯。
全文摘要
本文提供人工分枝菌酸膜。膜可为未支持的或栓系的。这些膜寿命长及高度抗电穿孔，展示它们的普遍强度。分枝菌酸膜适合于分枝杆菌外膜的控制的研究和可在其他实验，诸如纳米孔分析物转位实验中使用。
文档编号C07H21/04GK102834716SQ201180018451
公开日2012年12月19日 申请日期2011年2月23日 优先权日2010年2月23日
发明者J·H·古德拉彻, I·M·德灵顿, K·W·朗福德 申请人:华盛顿大学