有效的肽偶联及其在环戊二烯并[g]喹唑啉三钠盐的合成和分离中的用途
【专利摘要】本发明提供了一种合成L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的新方法及其在合成(2R)-((4S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1中的用途。还提供了一种有效的分离和纯化上述酸的三钠盐2的方法，该三钠盐2呈适合长期储存和用于肠胃外剂型的形式。
【专利说明】有效的肽偶联及其在环戊二烯并[G]喹唑啉三钠盐的合成和分离中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及(R)-2-((S)-4-氨基-4-羧基丁酰胺基)戊二酸(L-谷氨酰基-Y -D-谷氨酸，L-Glu- y -D-Glu)的合成，及其在合成中的用途，尤其是在合成(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羟基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)_戊二酸中的用途，以及上述酸的三钠盐的分离和纯化。
【背景技术】
[0002]为更充分地描述和公开本发明以及其所属的【技术领域】，此处引用了多篇专利和公开。这些参考文献中的每一篇均在此整体引入作为本文内容的参考，如同每一篇单独的引文均具体地、单独地指出引入作为参考。
[0003]在整个本说明书中，包括其后的权利要求，除非上下文另有所指，“包含”及其变型“包括”和“含有”，应当理解为意味着包括所述的整数或步骤或者整数组或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数组或步骤组。
[0004]必须指出，如本说明书和所附权利要求使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文明确的另有指定。因此，例如，提及“一种药用载体”包括两种或多种该载体的混合物，等。
[0005]此处范围经常表示为从“约”某一具体值，和/或至“约”另一具体值。当范围如此表达时，另一实施方案包括从一个具体值和/或至另一具体值。类似地，数值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应理解为该具体值形成另一实施方案。
[0006]当方法或过程在本文表示为步骤的列表或顺序(包括数字编号、字母编号，或项目符号编号的步骤的列表)时，列表中步骤呈现的顺序并不意味着该方法中这些步骤有任何特殊的顺序或时限，除非特殊顺序是要求的或明确说明的。因此，除非另有规定，每种公开方法的步骤可以任何合理的顺序进行，如本领域技术人员所明确的，即任何适合达到该方法所陈述的目的和产物的顺序。而且，除非明确的说明，本方法中不排除存在附加的步骤。
[0007]该新的胸苷酸合成酶抑制剂(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羟基甲基)-4_氧代_3，4，7，8-四氢-3!1-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1，作为其三钠盐也称为CB300945、BCG945或0NX-0801)是胸苷酸合成酶很有效的抑制剂，对该酶的IC5(I为3nM。
[0008]不像大多数胸苷酸合成酶抑制剂如甲氨蝶(呤和培美曲塞)，2的活化或细胞滞留不需要聚谷氨酰化(polyglutamoylation),而且它并不是聚谷氨酰化合成酶的底物。
[0009]此外,2不是普遍表达的Ki>250 μ Μ的还原性叶酸载体蛋白(reduced folatecarrier protein, RFCP)的底物，并且不能轻易地穿过正常的细胞膜。然而，它以很高的亚纳摩尔级亲和力(ΚΑ5ηΜ)与叶酸受体a (FRa)结合，并且可通过该受体以适当的速率转运至细胞中，即使2的血清水平非常低。
[0010]一旦进入细胞，2抑制胸苷酸合成酶并且随着其慢慢地降解和从细胞中排出，它对胸苷酸合成酶产生长效的抑制作用。这造成DNA加工错误，而启动了修复周期，而由于缺乏三磷酸胸苷掺入到DNA中，该修复最终是无效的。这导致了凋亡DNA损伤反应和细胞死亡。
[0011]这是胸苷酸合成酶抑制剂通常的作用方式，临床经验表明胸苷酸合成酶抑制剂对人类肿瘤有强烈的细胞毒作用，但是由于相当广谱的毒性，其使用受到了限制；靶组织，特别是骨髓，受到该药物细胞毒性的严重影响。
[0012]目前这代胸苷酸合成酶抑制剂是普遍表达的RFCP的良好底物，可很好的分布到大多数组织，而2仅仅有效地分布到表达或优选过表达FRa的组织中。相对地很少有组织内源性表达FRa，即使在适中水平。大多数组织在细胞远极面以极化方式表达FRa，意味着细胞面向循环内皮一面没有运载体。这样的结果是，即使在这些组织中，之的穿透也往往是非常无效的。这意味着血浆中高循环水平的2导致相当低的全身毒性。
[0013]如果对于肿瘤同样如此，也可以预期其产生低抗肿瘤疗效。然而,有些种类的肿瘤组织倾向于过表达FRa。作为肿瘤细胞，它们已经失去极性并在近极面和远极面均表达FRa。因此，这些肿瘤组织有着异常的倾向，能够在细胞中聚集非常大量的、细胞毒性的2的剂量，而血浆药物水平足够低，只有非常小的毒性作用。这导致在过表达肿瘤类型中，之的治疗指数提闻。
[0014]有些肿瘤类型过表达FR α，最显著的是卵巢癌，其中90%最常见的肿瘤类型，粘液型卵巢癌，过表达FRa。因此4是一种非常有吸引力的化疗药物，用于治疗FRa过表达的癌症，特别是卵巢癌，然而并不限于那一种肿瘤类型，其中子宫癌、间皮瘤和肾癌均有高百分比的FRa过表达。
[0015]化合物I和I以及若干相似同源物，在W02003/020748中被公开，尽管是作为在6位的非对映异构体1:1的混合物。
[0016]
【权利要求】
1.一种合成L-Glu-Y-D-Glu 二妝的方法,其包括以下步骤: a)活化N-α O-双保护的L-Glu衍生物的Y -羧酸； b)甲硅烷基化D-谷氨酸；和 c)将步骤a)产生的活化的羧酸衍生物与步骤b)的甲硅烷基化产物反应以生成被保护的 L-Glu-Y-D-Glu 物质。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤a)中，活化包括将N-α O-双保护的L-Glu衍生物转化成活化的衍生物，例如混合酸酐。
3.根据权利要求2的方法，其中活化包括用氯甲酸烷基酯和叔胺碱处理N-αO-双保护的L-Glu衍生物。
4.根据权利要求3的方法，其中氯甲酸酯是氯甲酸异丁酯。
5.根据权利要求2至4的方法，其中缓慢加入N-α O-双保护的L-Glu衍生物至氯甲酸烷基酯和叔胺碱的低温溶液中。
6.根据权利要求5的方法，其中氯甲酸烷基酯和叔胺碱的溶液的温度为-10°C至-50°C，优选约-30°C。
7.根据权利要求3至6 任一项的方法，其中叔胺碱为N-甲基吗啉。
8.根据权利要求1至7任一项的方法，其中N-α O-双保护的L-Glu衍生物为N-苄氧基擬基_L_谷氨酸-α -节酯。
9.根据上述权利要求任一项的方法，其中在步骤b)中，甲硅烷基化包括用甲硅烷基化剂处理D-谷氨酸。
10.根据权利要求9的方法，其中甲硅烷基化剂为O，N-二-(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
11.根据上述权利要求任一项的方法，其中在步骤b)中，D-谷氨酸被若干当量的甲硅烷基化剂溶解；和步骤c)中，将该溶液加入来自步骤a)的羧酸衍生物的冷溶液，以形成被保护的L-Glu- Y -D-Glu物质的甲硅烷基酯化溶液。
12.根据权利要求11的方法，其中Ν-αO-双保护的L-Glu衍生物为N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α -苄酯且产物为2R- (N- (S) _4_ (苄氧基羰基)_4_苄氧羰基氨基)_1_氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化溶液。
13.根据权利要求12的方法，其中反应后，将2R-(N-(S)-4-(节氧基擬基)-4_节氧擬基氨基)-1_氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化溶液进行去甲硅烷基化水溶液后处理，从而以良好的收率和纯度产生2R- (N- (S) -4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸。
14.根据权利要求13的方法，其中去甲硅烷基后处理包括在水和有机溶剂之间分配溶液。
15.根据权利要求1至14任一项的方法，其还包括: d)脱保护该被保护的L-Glu-Y -D-Glu物质。
16.根据权利要求15的方法，其中脱保护包括除去苄基和/或苄氧基羰基保护基以产生L-谷氨酰基-Y -D-谷氨酸。
17.根据权利要求15或16的方法，其中脱保护包括氢解。
18.根据权利要求17的方法，其中氢解包括在乙醇水溶液中，使用合适的过渡金属催化剂氢解。
19.根据权利要求18的方法，其中催化剂包括钯碳催化剂。
20.根据权利要求15至19任一项的方法，其中脱保护后，该产物经硫代硅胶处理以获得含〈lOppm钯的产物。
21.合成(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其可药用盐或溶剂合物的方法，其包括将甲硅烷基-保护的L-Glu- Y -D-Glu物质与(63)-4，^((2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸偶联的步骤。
22.根据权利要求21的方法，其中偶联包括活化(6S)-4，N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸的羧酸部分和用甲硅烷基-保护的L-Glu- Y -D-Glu物质处理。
23.根据权利要求22的方法，其中活化包括通过用1-羟基苯并三唑水合物和偶联剂处理将(65)-4，^((2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3!1-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸转化成活化的HOBT酯。
24.根据权利要求23的方法，其中偶联剂为二酰亚胺偶联剂。
25.根据权利要求21至24任一项的方法，其中甲硅烷基保护的L-Glu-y -D-Glu物质是由L-谷氨酰基-Y -D-谷氨酸二肽的甲硅烷基化产生的。
26.根据权利要求25的方法，其中甲硅烷基-保护的L-Glu-y -D-Glu物质是从根据权利要求I至19任一项的方法产生的L-Glu- Y -D-Glu 二肽制备的。
27.根据权利要求26的方法，其中甲硅烷基化包括用甲硅烷基化剂处理。
28.根据权利要求27的方法，其中甲硅烷基化剂为0，N-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
29.根据权利要求21至28任一项的方法，其中偶联反应是在乙腈中进行的。
30.根据权利要求21至29任一项的方法，其中任何涉及存在甲硅烷基化剂的操作都是在温度范围-10°C至+10°C进行的。
31.根据权利要求21至30任一项的方法，其还包括纯化步骤，包括过滤、稀释和沉淀，其通过加入谨慎限定量的碱水溶液，优选饱和碳酸氢钠溶液，或酸水溶液，优选甲酸。
32.制备(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三钠盐(0NX-0801)的方法，其包括以下步骤: (i)提供(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐在水性钠碱中的溶液； (ii)如有必要，调节pH; (iii)柱色谱分离； (iv)任选地，浓缩从步骤(iii)洗脱的产物；和 (V)冻干。
33.根据权利要求32的方法，其中用于步骤⑴的(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，^(((65)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3!1-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐是根据权利要求1至30任一项的方法制备的。
34.根据权利要求32或33的方法，其中在步骤(i)中，水性钠碱溶液是碳酸氢钠或碳酸钠溶液。
35.根据权利要求32至34任一项的方法，其中在步骤(ii)中，将pH调节到范围pH7.5-9.0ο
36.根据权利要求32至35任一项的方法，其中在步骤(iii)中，色谱分离包括在改良的聚苯乙烯树脂柱上通过柱色谱纯化，用水或含1-10%的水混溶性溶剂的水洗脱。
37.根据权利要求32至36任一项的方法，其中步骤(iv)包括浓缩收集的色谱级分，该级分包含(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羟基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐的稀水溶液，所述浓缩使用连续蒸发技术如刮膜式蒸发；基于膜的浓缩方法如超滤；或柱装载和洗脱。
38.根据权利要求37的方法，其包括在0°C至10°C使用超滤将柱洗脱液浓缩4倍至16倍。
39.根据权利要求38的方法，其还包括在0°C至10°C将超滤仪器中的保留物透滤，以减少水溶性低分子量杂质的量。
40.根据权利要求32至39任一项的方法，其中步骤(v)产生的冻干饼状物含有不超过10%重量的水。
41.化合物，其用于合成(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，N-(U6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸及其三钠盐，其选自:(R) - 二(0-三甲基甲硅烷基)2- ((S) -5-(苄氧基)-4-(苄氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸酯；(R) -2- ((S) -5-(苄氧基)-4-(苄氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸；(S)-O-1H-苯并[d][l，2，3]三唑-1-基 4-((2-(羟基甲基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯；(R)- 二(0-三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-4，6，7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5_氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯；(S)-O-1H-苯并[d][l，2，3]三唑-1-基4-((2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4，6，7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酷；(R) - 二(0-三甲基甲硅烷基)2-(⑶-4- (4-((⑶-2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5_氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯。
42.制备(2，R)- ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羟基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐2的方法，包括: 根据权利要求1至19任一项的方法合成L-GlU- Y -D-GlU 二肽； 根据权利要求25至30任一项的方法从所述的L-Glu- Y -D-Glu 二肽合成(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羟基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸；和根据权利要求31至39任一项的方法，从所述的(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，^(((65)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氢-3!1-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸制备和纯化(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羟基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三钠盐(0NX-0801) 。
【文档编号】C07D239/80GK103748106SQ201180066993
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2011年12月19日 优先权日:2010年12月22日
【发明者】J.A.克申, A.J.布里奇斯, M.D.乔巴尔, S.M.达尔齐尔, T.E.杰克斯, A.S.汤普森, J.R.泽勒 申请人:奥尼克斯医药品股份有限公司