在氨基酸存在下的离子交换层析的制作方法

在氨基酸存在下的离子交换层析的制作方法
【专利摘要】本发明公开了减少使用离子交换(IEX)层析纯化的含有蛋白质的样品中的高分子量物质(HMW)形成的方法，也公开了许多相关方法，例如，减少使用离子交换(IEX)柱或树脂纯化的蛋白质样品中蛋白质的柱上变性的方法。所述方法的共同特征是在离子交换(IEX)层析期间使用的缓冲液中引入精氨酸、甘氨酸和/或组氨酸。
【专利说明】在氨基酸存在下的离子交换层析
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2010年12月8日提交的美国临时申请第61/421，158号的权益，该美国临时申请据此以引用的方式并入。
发明领域
[0003]本发明涉及可用于治疗性生物分子的生产的IEX层析的改进。
[0004]发明背景
[0005]治疗性蛋白质或生物制品，例如单克隆抗体(mAb)和Fe融合蛋白，在目前的蛋白质治疗剂市场中占据相当大的份额，还有许多潜在生物制品，例如mAb，正在研发中(Walsh, G.(2004)，Biopharm.1ntnl.17，18)。将候选生物制品快速地转移至临床，并最终转移至市场的能力是生物制药公司成功的关键。为了实现这些目标，生物技术工业已采用用于制造诸如单克隆抗体的生物制品的平台方法(Shukla, A.A.等，(2007), Journal ofChromatography B848, 28-39.)。由于高容量、对杂质的选择性、可扩展性和鲁棒性，离子交换层析(IEX)，特别是阳离子交换层析(CEX)作为精制(polishing)步骤广泛应用于平台 mAb 纯化工艺中(Shukla 等，(2007)同上；Zeid, J.等，(2008)，Biotechnology andBioengineeringl02,971-976).CEX是除去蛋白质高分子量(HMW)物质，以及宿主细胞蛋白、DNA和残留蛋白A的有效步骤(Zeid等,(2008)同上；Yigzaw, Y.等，(2009), CurrentPharmaceutical BiotechnologylO,421-426 ；Gagnon, P., Purification tools formonoclonal antibodies.1996 !Validated Biosystems,Inc.;Stein, A.,和 Kiesewetter,A.(2007), Journal of Chromatography B848,151-158 ；Staby, A.等，(2006), Journal ofChromatographyl118,168-179)。一般来说，以结合-和-洗脱模式(BEM)操作CEX，在该模式中，使蛋白质在低电导率条件下在低于目标分子的Pl的PH下结合至树脂。然后通常通过增大电导率和/或诱 导PH改变来实现结合蛋白质的洗脱。这可利用达到预定条件的线性梯度或分步洗脱来执行。杂质，特别是HMW物质，经常比mAb产品更紧密地结合，可通过调整洗脱条件和汇集物收集标准来使其与主要所需级分分离(Yigzaw，Y.等，(2009)同上；Gagnon, P.等，(1996)同上；Pabst, T.M.等，(2009) Journal of Chromatography 1216,7950-7956)。
[0006]随着基于重要历史经验限定的单克隆抗体纯化平台技术的采用，人们普遍预料，大多数分子少有或没有困难地符合预定义的操作空间。然而，尽管三级结构相似，但不同的mAb基于其一级序列的差异可以有不同的表现，并且可以具有不同程度的物理和化学稳定性(Wang, W.等，(2006)，Journal of Pharmaceutical Sciences96,1-26.)。下游平台工艺应当被设计成适应mAb之间的差异；然而，在一些情况下，此类流线型平台工艺被证明不足以获得目标产品的质量属性。
[0007]在mAb下游工艺中使用的各种模式的层析当中，就对蛋白质稳定性和/或完整性的潜在影响而言，离子交换层析通常被视为温和操作。然而，即使是这种常见的单元操作，也会出现挑战。Voitl和Morbidelli已报道CEX层析出现意外的峰形，其中高纯度人血清白蛋白作为两个明显的峰从Fractogel EMD SE Hicap上洗脱(Voitl, A., Butte, A.,和Morbidelli, Μ.(2010), Journal of Chromatography1217,5484-5291 ；Voitl, A., Butte,A.,和 Morbidelli,M.(2010), Journal of Chromatography 1217, 5492-5500)。这种情况下的两个峰归结于人血清白蛋白在CEX树脂上的两种不同的结合构象。第一峰对应于瞬时结合取向，该瞬时结合取向然后可基于CEX操作条件转变为第二取向。在第二峰中，HMW物质没有增加。
[0008]就与层析表面上的变性相关联的反相(RP)和疏水相互作用层析(HIC)而言，也有意外的洗脱曲线被报道。当结合至反相表面时构象发生变化，这已得到充分证实(McNay，J.L.,和 Fernandez,Ε.J.(1999), Journal of Chromatography849,135-148) ? Lu 等指出在从RP柱上洗脱核糖核酸酶A期间出现两个峰，其中第一峰被鉴定为正确折叠的天然状态，而第二峰是未折叠蛋白质(Lu, X.M.等，(1986), Journal of Chromatography359,19-29)。虽然HIC—般被认为与RP相比较对蛋白质结构的损害较小，但是峰分裂和蛋白质解折叠的情况已被报道。例如，Jungbauer等指出，模型蛋白质以两个峰从HIC树脂上洗脱，并假设第一峰为天然蛋白质，第二峰为含有具有部分未折叠构象的蛋白质。这种假设是基于未折叠蛋白质将较大的疏水表面面积暴露于树脂中，并且因此将具有比天然蛋白质长的保留时间这一理论基础作出的。还有人指出解折叠程度是与结合盐浓度和树脂疏水性相关的(Jungbauer, A.等，(2OO5),· Journal of Chromatographyl079,221-228)? Fernandez 和同事使用氢氘交换来证明结合至HIC介质上之后的构象变化并对纯物质产生两个峰进行解释(Tibbs Jones, T.,和 Fernandez, E.J.(2003), Journal of Colloid and InterfaceScience259, 27-35)。在这些研究过程中，已证明保留时间较短的峰具有与不存在树脂的情况下的天然蛋白质类似的氘吸收，而保留时间较长的峰具有较高的氘吸收并且因而具有较高程度的溶剂暴露。他们还继续开发了随着盐浓度和温度变化解折叠的模型(Xiao，Y.等，(2007), Journal of Chromatographyl 157,197-206)并证明较高的质量负载量可减少在 HIC 树脂上解折叠的程度(Fogle, J.L.等，(2006), Journal of Chromatography 1121,209-218)。
[0009]很少有研究利用离子交换介质论证表面诱导的变性。Gagnon和Fernandez都暗示了在IEX期间结构扰动的可能性，但没有提供细节(Gagnon,P.，(1996)同上；Fogle,J.L.，和 Fernandez, E.J.(2006)，LCGC North America24,158-168)。Lewis 和 Nail 指出在阴离子交换(AEX)层析后的低pH处理期间IgG聚集增加。这与IEX柱收集标准及在低pH下不同IgG亚类对HMW生成的敏感性相关联(Lewis, J.D.,和Nail, S.L.(1997)，ProcessBiochemistry32, 279-283)。Hunter和Carta描述了当从AEX柱上洗脱牛血清白蛋白(BSA)时出现两个峰，然而，这是由于进料中存在BSA 二聚体而不是由于蛋白质解折叠造成的(Hunter, A.K.,和 Carta, G.(2001), Journal of Chromatography937,13-19)。
[0010]发明概述
[0011]在一方面，本发明包括减少使用离子交换(IEX)层析纯化的含有蛋白质的样品中的高分子量物质(HMW)形成的方法。所述方法包括将在含有至少lmM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或IOOmM的一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的加样缓冲液中的蛋白质加载到IEX树脂上，并使用含有至少ImM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM 或 IOOmM 的一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的洗脱缓冲液将蛋白质从IEX树脂上洗脱下来。在这种方法中，与使用IEX层析利用不含上述浓度的上述氨基酸的加样和洗脱缓冲液纯化的蛋白质样品相比较，加样缓冲液和洗脱缓冲液中存在的一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸减少样品中的HMW形成。
[0012]在另一方面，本发明包括减少使用离子交换(IEX)柱或树脂纯化的蛋白质样品中蛋白质的柱上或树脂上变性的方法。所述方法包括将在含有至少lmM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或IOOmM的一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的加样缓冲液中的蛋白质加载到IEX柱或树脂上，并使用含有至少lmM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM 或 IOOmM 的一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的洗脱缓冲液将蛋白质从IEX柱或树脂上洗脱下来。在这种方法中，与使用不含上述浓度的一种或多种上述氨基酸的加样和洗脱缓冲液在IEX柱或树脂上纯化的蛋白质相比较，加样缓冲液和洗脱缓冲液中存在的一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸减少IEX柱或树脂上蛋白质的变性。
[0013]在某些实施方案中，以上方法可进一步包括在加样与洗脱步骤之间用洗涤或平衡缓冲液洗涤或平衡柱或树脂或介质，其中洗涤或平衡缓冲液含有至少lmM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或IOOmM的一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸。
[0014]在某些实施方案中，上面提及的缓冲液中的每一种均含有至少10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或IOOmM的精氨酸和/或甘氨酸。在其它实施方案中，所述缓冲液中的每一种均含有至少100mM、200mM、300mM、400mM或500mM甘氨酸。在其它实施方案中，上面提及的缓冲液中的每一种均含有至少10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、50mM、70mM、80mM、90mM 或 IOOmM 精氨酸。
[0015]在某些实施方案中，IEX柱或树脂为阴离子交换(AEX)柱或树脂，例如，快流速Q琼脂糖凝胶、快流速DEAE琼脂糖凝胶、快流速ANX琼脂糖凝胶4、Q琼脂糖凝胶XL、Q琼脂糖凝胶大珠、DEAE葡聚糖凝胶 A-25、DEAE葡聚糖凝胶A_50、QAE葡聚糖凝胶A_25、QAE葡聚糖凝胶A-50、高效Q琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶XL、Soursel5Q> Sourse30Q> ResourseQ、Capto Q、Capto DEAE、Mono Q、Toyopearl Super Q、Toyopearl DEAE、Toyopearl QAE、Toyopearl Q、Toyopearl GigaCap Q、TSKgel SuperQ、TSKgel DEAE、Fractogel EMD TMAEΛFractogel EMD TMAE HiCap、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD DMAEΛMacroprep HighQ、Macro-prep-DEAE、Unosphere Q、Nuvia Q、POROS HQ、POROS P1、DEAE Ceramic HyperD,或 Q Ceramic HyperD0
[0016]在某些实施方案中，IEX柱或树脂为阳离子交换(CEX)柱或树脂，例如，SP琼脂糖凝胶、CM琼脂糖凝胶、Toyopearl SP650M，及Fractogel SO3^Fractogel S03—SE HiCap(M)、Fractogel COO—(M)、YMC-BioPro S75、Capto S、SP 琼脂糖凝胶 XL/FF、CM Sepahrose FF、SP/CM Toyopearl650m、Toyopearl SP550c、Toyopearl GigaCap、UNOsphere S、Eshmuno S、Macroprep High S，或 POROS HS50。
[0017]在某些实施方案中，所述缓冲液中的每一种均具有介于4.0与6.5之间的pH。在其它实施方案中，所述缓冲液中的每一种均具有介于6.5与9.0之间的pH。示例性缓冲液包括例如乙酸盐缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和bis tris缓冲液。在某些实施方案中，所述方法在介于l°c与10°C之间或介于2°C与8°C之间的温度下，例如，在约4°C下进行。在其它实施方案中，所述方法在介于8°C与15°C之间的温度下进行。在其它实施方案中，所述方法在介于15°C与25°C之间，或介于约18°C与22°C之间的温度下进行。在某些实施方案中，柱或树脂停留时间介于I分钟与24小时之间、介于I分钟与12小时之间、介于I分钟与8小时之间或介于I分钟与4小时之间。
[0018]在某些实施方案中，蛋白质为重组产生的蛋白质或多肽，例如，肽体(P印tibody)、基于结构域的蛋白(domain-based protein),或抗体,例如,和单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，蛋白质为治疗性单克隆抗体(mAb)，例如，IgGlmAb、IgG2mAb或IgG4mAb。在更具体的实施方案中，mAb为无糖基化的mAb,例如,无糖基化的IgGlmAb。
[0019]在另一方面，本发明包括纯化蛋白质或多肽的方法。所述方法包括使用离子交换(“IEX”)层析，例如，阴离子交换(“AEX”)或阳离子交换(“CEX”)层析纯化蛋白质，其中IEX层析采用加样和洗脱缓冲液，并且加样和洗脱缓冲液被调配成包括或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸。
[0020]在另一方面，本发明包括纯化蛋白质或多肽的方法。所述方法包括将蛋白质或多肽(悬浮在加样缓冲液中)加载到离子交换(例如，阳离子交换或阴离子交换)柱或树脂上，任选地用洗涤缓冲液洗涤或平衡柱或树脂，并使用洗脱缓冲液洗脱多肽的蛋白质，其中加样、洗脱和洗涤(如果包括洗涤步骤)缓冲液被调配成包括或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸。
[0021]在另一方面，本发明包括减少含有所需蛋白质或多肽的样品中的HMW形成的方法。所述方法包括将蛋白质或多肽(悬浮在加样缓冲液中)加载到离子交换(例如，阳离子交换或阴离子交换)柱或树脂上，任选地用洗涤缓冲液洗涤或平衡柱或树脂，并使用洗脱缓冲液洗脱多肽的蛋白质，其中加样、洗脱和洗涤(如果包括洗涤步骤)缓冲液被调配成包括或包含一种或多种选自由精氨酸、`甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸，并且其中洗脱的蛋白质或多肽相对于加载的蛋白质或多肽而言显示出显著减少的HMW形成。
[0022]在另一方面，本发明包括减少样品中所需蛋白质或多肽的“峰B百分比”的方法。所述方法包括将蛋白质或多肽(悬浮在加样缓冲液中)加载到离子交换(例如，阳离子交换或阴离子交换)柱或树脂上，任选地用洗涤缓冲液洗涤或平衡柱或树脂，并使用洗脱缓冲液洗脱多肽的蛋白质，其中加样、洗脱和洗涤(如果包括洗涤步骤)缓冲液被调配成包括或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸，并且其中洗脱的蛋白质或多肽相对于加载的蛋白质或多肽而言显示出显著减少的峰B百分比。
[0023]在另一方面，本发明包括使所需蛋白质或多肽与液体溶液中的其它组分分离的方法。所述方法包括使包含所需蛋白质或多肽和其它组分的液体溶液与离子交换层析介质在一种或多种所引入的选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的存在下接触，允许离子交换层析介质被该溶液平衡一段介于约I分钟与约24小时之间的时间，并在被调配成含有一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的洗脱溶液中获得蛋白质或多肽。在一个实施方案中，所述的一段时间介于约I分钟与约4小时之间。在另一个实施方案中，所述的一段时间介于约5分钟与约2小时之间。
[0024]在另一方面，本发明包括从包含蛋白质或多肽和至少一种污染物的液体溶液中分离出所述蛋白质或多肽的方法。所述方法包括将该液体溶液在一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的存在下加载到离子交换层析介质上；任选地用含有或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的洗涤缓冲液洗涤离子交换层析介质；并在一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的存在下将蛋白质或多肽从离子交换层析介质上洗脱下来，其中包含洗脱的蛋白质或多肽的溶液相对于加载在离子交换层析介质上的溶液而言具有显著较低的水平的污染物。
[0025]在另一方面，本发明包括从包含蛋白质或多肽和至少一种污染物的液体溶液中分离出蛋白质或多肽的方法。所述方法包括将液体溶液加载到离子交换层析介质上，其中该溶液含有或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸；任选地用含有或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的洗涤缓冲液洗涤离子交换层析介质；并用含有或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的洗脱缓冲液将蛋白质或多肽从离子交换层析介质上洗脱下来。
[0026]在另一方面，本发明包括从包含蛋白质或多肽和至少一种污染物的液体溶液中纯化出蛋白质或多肽的方法。该方法包括使用含有或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的加样缓冲液使蛋白质或多肽结合至离子交换层析材料；任选地用含有或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的洗涤缓冲液洗涤离子交换层析介质；并用含有或包含一种或多种选自由精氨酸、甘氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸的洗脱缓冲液将蛋白质或多肽从离子交换层析介质上洗脱下来。
[0027]在另一方面，本发明包括减少柱诱导的层析柱或树脂上蛋白质或多肽的变性的方法。所述方法包括使用IEX层析纯化蛋白质，其中IEX层析采用加样和洗脱缓冲液(及任选的洗涤缓冲液)，并且加样、洗脱和洗涤(如果采用)缓冲液包括甘氨酸，精氨酸或组氨酸。
[0028]在另一方面，本发明包括减少纯化蛋白质或多肽的聚集的方法。所述方法包括使用IEX层析纯化蛋白质，其中IEX采用加样和洗脱缓冲液(及任选的洗涤缓冲液)，并且加样、洗脱和洗涤(如果采用)缓冲液包括甘氨酸，精氨酸或组氨酸。
[0029]在另一方面，本发明包括在采用具有加样和洗脱阶段的IEX层析纯化重组产生的蛋白质或多肽的方法中的改进，所述改进包含在IEX层析的加样和洗脱阶段中所使用的缓冲液中包括甘氨酸、精氨酸或组氨酸。
[0030]在另一方面，本发明包括由以上任一种方法产生的纯化蛋白质或多肽。
[0031]在另一方面，本发明包括使用IEX层析至少部分地纯化的纯化蛋白质或多肽，其中IEX层析包括加样和洗脱阶段，并且采用加样和洗脱缓冲液，并且其中加样和洗脱缓冲液都含有甘氨酸、精氨酸或组氨酸。
[0032]以下是所考虑的与本发明的任何一个上述方面有关的某些具体实施方案的实例。
[0033]在一个实施方案中，氨基酸选自由甘氨酸和精氨酸组成的组。
[0034]在一个实施方案中，氨基酸为甘氨酸。在加样和洗脱缓冲液包括甘氨酸的一个实施方案中，甘氨酸浓度大于约lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。在加样和洗脱缓冲液包括甘氨酸的另一个实施方案中，洗脱缓冲液中的甘氨酸浓度等于或大于约 15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、75mM、100mM、150mM> 200mM> 250mM> 300mM>350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM 或 700mM。在加样和洗脱缓冲液包括甘氨酸的另一个实施方案中，加样和洗脱缓冲液中的甘氨酸浓度介于约IOmM与约500mM之间。在加样和洗脱缓冲液包括甘氨酸的另一个实施方案中，加样和洗脱缓冲液中的甘氨酸浓度介于约50mM与约500mM之间。在加样和洗脱缓冲液包括甘氨酸的相关实施方案中，加样和洗脱缓冲液中的甘氨酸浓度介于约IOOmM与约500mM之间。
[0035]在一个实施方案中，氨基酸为甘氨酸。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括甘氨酸的一个实施方案中，甘氨酸浓度大于约lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括甘氨酸的另一个实施方案中，洗脱缓冲液中的甘氨酸浓度等于或大于约 15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM*700mM。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括甘氨酸的另一个实施方案中，加样、洗涤和洗脱缓冲液中的甘氨酸浓度介于约IOmM与约500mM之间。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括甘氨酸的另一个实施方案中，加样、洗涤和洗脱缓冲液中的甘氨酸浓度介于约50mM与约500mM之间。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括甘氨酸的相关实施方案中，加样、洗涤和洗脱缓冲液中的甘氨酸浓度介于约IOOmM与约500mM之间。
[0036]在另一个实施方案中，氨基酸为精氨酸。在加样和洗脱缓冲液包括精氨酸的一个实施方案中，精氨酸浓度大于约lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。在加样和洗脱缓冲液包括精氨酸的另一个实施方案中，洗脱缓冲液中的精氨酸浓度等于或大于约 15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、75mM、100mM、150mM> 200mM> 250mM> 300mM>350mM、400mM、450mM或500mM。在加样和洗脱缓冲液包括精氨酸的另一个实施方案中，加样和洗脱缓冲液中的精氨酸浓度介于约ImM与约IOOmM之间。在加样和洗脱缓冲液包括精氨酸的另一个实施方案中，加样和洗脱缓冲液中的精氨酸浓度介于约50mM与约300mM之间。在加样和洗脱缓冲液包括精氨酸的相关实施方案中，加样和洗脱缓冲液中的精氨酸浓度介于约50mM与约200mM之间。
[0037]在另一个实施方案中，氨基酸为精氨酸。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括精氨酸的一个实施方案中，精氨酸浓度大于约lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括精氨酸的另一个实施方案中，洗脱缓冲液中的精氨酸浓度等于或大于约 15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM*500mM。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括精氨酸的另一个实施方案中，加样、洗涤和洗脱缓冲液中的精氨酸浓度介于约ImM与约IOOmM之间。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括精氨酸的另一个实施方案中，加样、洗涤和洗脱缓冲液中的精氨酸浓度介于约50mM与约300mM之间。在加样、洗涤和洗脱缓冲液包括精氨酸的相关实施方案中，加样和洗脱缓冲液中的精氨酸浓度介于约50mM与约200mM之间。
[0038]在一个实施方案中，IEX层析或IEX柱或IEX树脂或IEX介质为AEX层析或AEX柱或树脂或介质。在一个实施方案中，AEX层析使用选自由以下组成的组的介质进行(或者AEX介质或材料为选自由以下组成的组的介质):快流速Q琼脂糖凝胶?、快流速DEAE琼脂糖凝胶?、快流速ANX琼脂糖凝胶?4 (高分辨率)、Q琼脂糖凝胶? XL、Q琼脂糖凝胶大珠、DEAE葡聚糖凝胶A-25、DEAE葡聚糖凝胶A_50、QAE葡聚糖凝胶A_25、QAE葡聚糖凝胶A-50、高效Q琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶XL、Soursel5Q> Sourse30Q> Resourse Q、Capto Q、Capto DEAEΛ Mono Q、Toyopearl Super Q、Toyopearl DEAEΛ Toyopearl QAE、Toyopearl Q、Toyopearl GigaCap Q、TSKgel SuperQ、T SKgel DEAE、Fractogel EMD TMAEΛFractogel EMD TMAE HiCap、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD DMAEΛMacroprep HighQ、Macro-prep-DEAE、Unosphere Q、Nuvia Q、POROS HQ、POROS P1、DEAE Ceramic HyperD,和 Q Ceramic HyperD0
[0039]在另一个实施方案中，IEX层析为CEX层析或CEX柱或树脂或介质。在一个实施方案中，CEX层析使用选自由以下组成的组的介质进行(或者CEX介质或材料为选自由以下组成的组的介质):SP琼脂糖凝胶?、CM琼脂糖凝胶?、Toyopearl? SP650M，和Fractogel?S03-。在相关实施方案中，CEX层析使用以下介质进行(或者CEX介质或材料为以下介质):Fractogel S03-SE HiCap (M)、Fractogel COO-(M)、YMC-BioPro S75、Capto S、SP 琼脂糖凝胶 XL/FF、CM Sepahrose FF> SP/CM Toyopearl650m> Toyopearl SP550c> ToyopearlGigaCap、UNOsphere S> Eshmuno S> Macroprep High S,和 POROS HS50。
[0040]在一个实施方案中，在洗脱蛋白质或多肽之前，对层析介质、材料或柱或树脂进行洗涤。在一个实施方案中，加样、洗涤和洗脱缓冲液中的一者或多者具有介于约4与约6.5之间的pH。在相关实施方案中，加样、洗涤和/或洗脱缓冲液的pH介于约4.5与约6之间。在一个实施方案中，加样缓冲液的PH介于约4与约6.5之间。在一个实施方案中，洗涤缓冲液的pH介于约4与约6.5之间。在一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH介于约4与约6.5之间。在一个实施方案中，加样、洗涤和/或洗脱缓冲液选自由以下组成的组:乙酸盐缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和bis tris缓冲液。
[0041]在一个实施方案中，在洗脱蛋白质或多肽之前，对层析介质、材料或柱或树脂进行洗涤。在一个实施方案中，加样、洗涤和洗脱缓冲液中的一者或多者具有介于约6与约9之间的pH。在相关实施方案中，加样、洗涤和/或洗脱缓冲液的pH介于约6.5与约8.5之间。在一个实施方案中，加样缓冲液的PH介于约6与约9之间。在一个实施方案中，洗涤缓冲液的PH介于约6与约9之间。在一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH介于约6与约9之间。在一个实施方案中，加样、洗涤和/或洗脱缓冲液选自由以下组成的组:磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和tris缓冲液。
[0042]在一个实施方案中， IEX层析(或与层析柱或树脂或介质的接触或结合)在介于约2°C与约30°C之间的温度下进行。在相关实施方案中，IEX层析(或与层析柱或树脂或介质的接触或结合)在介于约2°C与约8°C之间的温度下进行。在相关实施方案中，IEX层析(或与层析柱或树脂或介质的接触或结合)在介于约15°C与约25°C之间的温度下进行。在一个实施方案中，柱或树脂停留时间介于约I分钟与约24小时之间。在另一个实施方案中，柱或树脂停留时间介于约I分钟与约4小时之间。
[0043]在一个实施方案中，经受分离或纯化方法的蛋白质或多肽在使用IEX(例如，AEX或CEX)层析获得的层析图中显示出“峰分裂”。在相关实施方案中，在经受以上纯化或分离方法之后，纯化或分离的蛋白质或多肽显示出显著减少的“峰分裂”。
[0044]在一个实施方案中，蛋白质或多肽为重组产生的蛋白质或多肽。在一个实施方案中，蛋白质为蛋白质治疗分子。在一个实施方案中，治疗分子为肽。在一个实施方案中，治疗分子为肽体。在一个实施方案中，治疗分子为基于结构域的蛋白。在一个实施方案中，治疗分子为抗体或其抗原结合片段。在相关实施方案中，抗体为单克隆抗体(“mAb”)或其抗原结合片段。在相关实施方案中，单克隆抗体选自由以下组成的组:IgGlmAb、IgG2mAb和IgG4mAb。在相关实施方案中，单克隆抗体为糖基化的抗体。在另一个实施方案中，单克隆抗体为无糖基化的抗体。
[0045]附图简述
[0046]图1A是绘制为洗脱钠浓度的函数的来自HiAbl的阳离子交换(“CEX”)Fractogel?S03_层析柱的洗脱液的层析图(A300吸光度)，及洗脱液中高分子量(“HMW”)物质的百分比的图形，其中所述层析图示出在300nm处的吸光度，并具有两个明显的峰(标记为“A”和“B，，)。
[0047]图1B是如使用分析型尺寸排阻层析测定的峰A、B及用于加载到CEX柱中的进料溶液中的HMW物质与单体的相对量的图示。
[0048]图2A和2B示出来自作为峰A(图2A)或峰B(图2B)洗脱的mAb I材料的分析型CEX HPLC实验的数据。
[0049]图3A示出来自在Fractogel? S03_上对mAbl峰A进行的再层析实验的数据。该图示出从来自初始CEX运行的数据，以及从来自初始运行的峰A的再层析获得的数据，以及从来自第一次再层析运行的峰A的再层析获得的数据(如所指示的)。
[0050]图3B示出来自在Fractogel? S03_上对mAbl峰B进行的再层析实验的数据，其包括来自初始CEX运行的数据及从来自初始运行的峰B的再层析获得的数据(如所指示的)。
[0051]图3C示出来自图3B中所示的经再层析的峰B的材料的单体和HMW浓度。
[0052]图4示出来自利用梯度洗脱对mAbl的SP琼脂糖凝胶?( “SP FF”)、CM琼脂糖凝胶 ?( “CM FF” ) 'Toyopearl? SP650M( “SP650M” )，和 Fractogel? S0f( “S03-” ) CEX 进行的评价的数据。
[0053]图5示出绘制为乙酸盐 缓冲液浓度的函数的HMW质量平衡率和洗脱期间相对于加样/洗涤PH的pH变化。
[0054]图6A示出阴离子(所指示的)类型不同的洗脱缓冲液对％峰B (来自mAbl的CEX层析图)的影响。
[0055]图6B示出作为洗脱体积的函数的在存在具有不同阴离子(所指示的)的缓冲液的情况下的洗脱曲线。
[0056]图7A示出在对mAbl的CEX层析实验中加样和洗脱流速(表示为柱停留时间)对％峰B的影响。
[0057]图7B示出质量负载量(表示为克mAbl/升树脂)对％峰B和HMW质量平衡率的影响。
[0058]图7C示出柱停留时间(表示为柱洗涤体积-“0Τ，)对mAb3和17的％峰B的影响。
[0059]图8A示出作为洗脱盐浓度的函数的在存在具有不同pH值的加样、洗涤和洗脱缓冲液的情况下的mAblCEX层析洗脱曲线。
[0060]图8B示出在存在具有不同pH值(所指示的)的加样、洗涤和洗脱缓冲液的情况下的％峰8和HMW的生成。
[0061]图9A示出在不同温度(所指示的)下的mAblCEX层析运行的结果。
[0062]图9B示出作为缓冲液/柱温的函数的来自图9A中所示实验的％ HMW质量平衡率。
[0063]图1OA示出在存在500mM甘氨酸的情况下的mAbl的Fractogel? SO3^层析图(标记为“500mM甘氨酸”)及在存在乙酸盐/NaCl的情况下的对照Fractogel? S03_层析图(标记为“对照”)。与无甘氨酸运行相比较，在CEX工艺中加入甘氨酸减少了峰B的形成。
[0064]图1OB示出在存在50mM精氨酸的情况下的mAbl的Fractogel? SO, 折图(标记为“50mM精氨酸”)、在存在IOOmM精氨酸的情况下的mAbl的Fractogel? SO,层析图(标记为“ IOOmM精氨酸”)，及在存在乙酸盐/NaCl的情况下的mAh I的Fractogel? SOf层析图(标记为“对照”)。
[0065]图1lA示出在mAblCEX层析实验的过程中各种赋形剂(蔗糖、脯氨酸、甘氨酸和精氨酸)对％峰B和HMW质量平衡率的影响。
[0066]图1lB示出在加样/洗涤步骤、洗脱步骤，及加样/洗涤和洗脱步骤二者(“全过程”)中引入精氨酸对％峰B和HMW质量平衡率的影响。
[0067]图12A和12B是示出在小试规模的mAbl纯化运行过程中引入125mM精氨酸的影响的层析图。该运行在除了在加样、洗涤和洗脱缓冲液中引入125mM精氨酸(图12B)或不存在125mM精氨酸(图12A)之外相同的条件(pH5的乙酸盐缓冲液，40g mAbl/mL树脂的质量负载量，Fractogel S03-,氯化钠梯度洗脱)下执行。
[0068]图13示出在存在和不存在精氨酸的情况下的CEX层析曲线。每次运行均在30mM乙酸钠，pH5.0中加样至20g/L树脂，并且用20CV的达到30mM乙酸钠/1.0M氯化钠，pH5.0的线性梯度洗脱。进料物为经过酸处理、中和和深度过滤的蛋白A汇集物。精氨酸运行掺有精氨酸储备溶液至IOOmM ;向无精氨酸对照中加入相同体积的平衡缓冲液。
[0069]图14示出初始％ HMW和利用18种不同的mAb执行的实验的平均峰B面积。χ-轴指示测试的mAb。y_轴指示带有三次运行的3SD误差棒的洗脱期间的％峰B，及初始样品中的％_。具有升高水平的峰B的那些用圆圈标出。在这个实验中，将mAb在pH5下在乙酸盐缓冲液中加载到Fractogel S03-中，洗涤，并然后用氯化钠梯度洗脱进行洗脱。显示出高于起始HMW的峰B百分比的mAb被`视为具有升高水平的峰B。
【具体实施方式】
[0070]
[0071]术语“多肽”或“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，而且还适用于天然存在的氨基酸聚合物。该术语还可包括已例如通过加入碳水化合物残基从而形成糖蛋白来进行修饰，或已经受磷酸化的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可由天然存在的非重组细胞产生；或者它由遗传工程或重组细胞产生，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或由天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或置换得到的分子。术语“多肽”或“蛋白质”具体地包括肽体、基于结构域的蛋白和抗原结合蛋白，例如，抗体及其片段，以及由前述任一种的一个或多个氨基酸的缺失、添加，和/或置换得到的序列。
[0072]术语“多肽片段”是指与全长蛋白质相比较具有氨基末端缺失、羧基末端缺失，和/或内部缺失的多肽。此类片段与全长蛋白质相比较还可含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段长度为约5至500个氨基酸。例如，片段长度可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400，或450个氨基酸。有用的肽片段包括抗体的具有免疫学功能的片段，包括结合结构域。
[0073]术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，或其可与完整抗体竞争特异性地结合靶抗原的抗原结合片段，并且包括，例如，嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体，和双特异性抗体。因此“抗体”是抗原结合蛋白物质。完整抗体一般将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可包括较少的链，例如可仅包含重链的在骆驼科动物中天然存在的抗体。抗体可仅源自单一来源，或者可为“嵌合”抗体，即，抗体的不同部分可源自两种不同的抗体。可通过重组DNA技术，或通过酶法或化学裂解完整抗体，在杂交瘤中生产抗原结合蛋白、抗体，或结合片段。除非另外指出，否则术语“抗体”除了包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体之外，还包括它们的衍生物、变体、片段和突变形式。
[0074]如本文所使用的关于抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)的术语“抗原结合片段”(或简单地“片段”)包含抗体的一部分(不论该部分是如何获得或合成的)，其缺少全长链中存在的至少一些氨基酸但能够特异性地结合至抗原。此类片段具有生物活性，因为它们特异性地结合至靶抗原并且可与包括完整抗体在内的其它抗原结合蛋白竞争特异性地结合给定表位。在 一方面，此种片段将保留存在于全长轻链或重链中的至少一个CDR，并且在一些实施方案中将包含单一重链和/或轻链或其部分。这些具有生物活性的片段可通过重组DNA技术生产，或可通过酶法裂解或化学裂解包括完整抗体在内的抗原结合蛋白来生产。具有免疫学功能的免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可源自包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或家兔的任何哺乳动物来源。
[0075]术语“阳离子交换材料”或“阳离子交换介质”或“阳离子交换树脂”是指带有负电荷的固相，其具有用于与穿过或通过固相的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子。所述电荷可通过使一种或多种带电荷配体例如通过共价连接附连至固相来提供。替代地或另外地，所述电荷可以是固相的固有特性(例如二氧化硅就属于这种情况，其具有总体负电荷)。可将阳离子交换材料、介质或树脂安放或装填到可用于纯化蛋白质的柱中。
[0076]术语“阴离子交换材料”或阴离子交换介质”或“阴离子交换树脂”是指带有正电荷的固相，其具有用于与穿过或通过固相的水溶液中的阴离子交换的游离阴离子。所述电荷可通过使一种或多种带电荷配体(例如通过共价连接)附连至固相来提供。替代地或另外地，所述电荷可以是固相的固有特性。可将阴离子交换材料、介质或树脂安放或装填到可用于纯化蛋白质的柱中。
[0077]术语“缓冲液”或“缓冲溶液”是指通过其共轭酸-碱成分的作用来抵抗pH变化的溶液。控制pH在约pH4至约pH6.5范围内的缓冲液的实例包括乙酸盐、MES、柠檬酸盐、bistris，和其它无机酸或有机酸缓冲液；磷酸盐是缓冲液的另一个实例。盐阳离子包括钠、铵和钾。
[0078]术语“加样缓冲液”或“平衡缓冲液”是指含有一种或多种盐的缓冲液，其与蛋白质制备品混合，用于将蛋白质制备品加载到IEX柱上。这种缓冲液也用于在加样前平衡柱并且用于在加载蛋白质后洗涤柱。
[0079]本文所使用的术语“洗涤缓冲液”是指在加载组合物或溶液之后且在洗脱感兴趣蛋白质之前穿过离子交换材料或介质的缓冲液。洗涤缓冲液可起到在基本不洗脱所需蛋白质的情况下将一种或多种污染物从离子交换材料中除去的作用。[0080]术语“洗脱缓冲液”是指用于从柱中洗脱所需蛋白质的缓冲液。如本文所使用的术语“溶液”是指缓冲或非缓冲溶液，包括水。
[0081]术语“洗涤”离子交换材料或介质意指使合适的缓冲液通过或穿过离子交换材料。
[0082]术语从离子交换材料中“洗脱”分子(例如所需蛋白质或污染物)意指通常通过使洗脱缓冲液穿过离子交换材料来将所述分子从此种材料中除去。
[0083]术语“污染物”或“杂质”是指任何外来或不合需要的分子，特别是存在于待纯化蛋白质的样品中的不同于待纯化蛋白质的生物大分子，例如DNA、RNA，或蛋白质。污染物包括，例如，来自分泌待纯化蛋白质和蛋白质的细胞的其它蛋白质。
[0084]如结合蛋白质纯化使用的术语“分离”或“隔离”是指使所需蛋白质与包含所需蛋白质和第二蛋白质或其它污染物或杂质的混合物中的第二蛋白质或其它污染物或杂质分离，使得所需蛋白质的至少大部分分子从包含第二蛋白质或其它污染物或杂质的至少大部分分子的混合物的部分中被移出。
[0085]术语从包含所需蛋白质和一种或多种污染物的组合物或溶液中“纯化”所需蛋白质意指通过除去(完全或部分除去)组合物或溶液中的至少一种污染物来增加组合物或溶液中所需蛋白质的纯度。
[0086]术语使分子“结合”至离子交换材料意指使分子在合适的条件(例如，pH和所选择的盐/缓冲液组成)下暴露于离子交换材料或介质，使得所述分子借助于介于所述分子与离子交换材料或介质的一个或多个带电基团之间的离子相互作用可逆地固定在离子交换材料或介质中或上。
[0087]术语“治疗性生物产品”意指适用于预防、治疗或治愈人的疾病或病状的蛋白质。治疗性生物产品的实例包括单克隆抗体、 重组形式的天然蛋白质，例如受体、配体、酶或细胞因子、肽体，和/或基于选自以下的结构域的单体结构域结合蛋白=LDL受体A-结构域、血小板反应蛋白结构域、甲状腺球蛋白结构域、三叶草/PD结构域、EGF结构域、Anato结构域、Notch/LNR结构域、DSL结构域、Anato结构域、整联蛋白β结构域，和Ca-EGF结构域。
[0088]术语“肽体”是指包含不包括抗体CHl、CL、VH和VL结构域以及Fab和F (ab) 2的抗体Fe结构域(即，CH2和CH3抗体结构域)的分子，其中Fe结构域附连至一种或多种肽，优选具有药理学活性的肽，特别优选随机生成的具有药理学活性的肽。肽体的生产一般地描述于2000年5月4日公布的PCT公布W000/24782中。
[0089]IEX中的HMW物质
[0090]在开发用于纯化无糖基化的IgGl(mAbl)的阳离子交换步骤的过程中，观察到意外的洗脱曲线和显著的HMW生成。异常的峰形和HMW生成往往归结于在与层析介质结合后产物的变性。为了支持本发明和本文所描述的方法而执行的实验尤其解决了由层析表面诱导的变性引起的开发挑战、典型IEX操作参数对峰分裂和HMW生成的影响，以及允许在不牺牲产品完整性或分离选择性的情况下使用IEX的缓和策略。
[0091]特别地，为了支持本发明而执行的实验揭示“峰分裂”，在CEX柱上运行的单克隆抗体的某些层析图中具有意外的第二峰(称为“峰B”)。在为观察峰B测试许多不同的假设之后，确定峰B可能是由于也称为“柱上”变性的层析表面诱导的蛋白质变性造成的。这是一个令人惊讶的发现，因为IEX已被广泛地使用，很少有关于可疑产品变性的报道。
[0092]为了支持本发明而执行的实验进一步表明，操作pH、温度、CEX树脂、盐类型，和柱停留时间都在一定程度上影响mAbl的峰分裂和HMW生成。相比之下，缓冲能力和质量负载量没有对峰B形成产生显著影响。意外地发现，在IEX层析的加样和洗脱阶段中，甘氨酸或精氨酸，特别是精氨酸的使用显著减少峰B形成和HMW生成。
[0093]在某些生物治疗剂，例如，单克隆抗体的纯化和制造中，层析表面诱导的蛋白质变性可能会成为问题。例如，表面诱导的层析树脂上变性可能会在满足典型质量属性方面带来挑战并且可能对药品稳定性产生影响。为了支持本发明而执行的实验已确认赋形剂-例如，甘氨酸和精氨酸-可用于减少或消除此种变性。特别地，发现与市售蛋白质治疗剂生产过程相容的浓度的精氨酸的加入显著消除CEX层析中层析表面诱导的蛋白质变性，例如峰B形成的显著消除证明了这一点。发现，精氨酸限制变性程度并且在不给分离选择性带来负面影响的情况下提高总步骤产率。
[0094]探究峰分裂的可能原因
[0095]在研发mAbl (无糖基化的IgGl)期间，在阳离子交换(CEX)层析过程中观察到显著的峰分裂(图1A)。除了非典型的峰形之外，数据还显示显著的聚集物形成(图1A和1B)，预计其将表现为在制造环境中的产率损失。对这两个峰的再层析显示，峰分裂发生在树脂上并且不是不同物质的分离(图3A、3B和3C)。这个结果在包括Fractogel? SO3'SP琼脂糖凝胶?，和Toyopearl? SP650M在内的数种广泛使用的层析介质中都被观察到(图4)。
[0096]峰分裂和聚集物形成对下游工艺的开展产生显著影响。聚集物是与主要产品有关的杂质，其可具有免疫原性，并且因此在治疗性蛋白质中是不合需要的并且应当在下游工艺开展期间予以控制。在常见精制层析步骤期间聚集物的生成可能影响药品质量(无能力将聚集物除去)、步骤产率(除去聚集物)，或产品稳定性(在层析期间的分子扰动可能对长期稳定性产生不利影响)。
[0097]为了解决这些问题，对在存在数种盐系统和稳定赋形剂的情况下执行CEX层析进行评价。改变盐系统没有对峰B形成产生显著影响(图6A、6B)。此外，其它有用的工艺研发参数令人惊讶地没有减少足够 稳健的工艺步骤的峰B形成。
[0098]然后进行实验来评价稳定剂。如下所详述，蔗糖和脯氨酸没有影响。然而，发现精氨酸和甘氨酸减少峰B的形成和HMW的生成。在mAbl的情况下，例如，峰B降低50%需要500mM甘氨酸(图10A)。利用其它mAb进行的实验显示，在一些情况下，显著较低的浓度的甘氨酸能有效地使峰B显著降低。对于mAbl而言，浓度大于约IOOmM的精氨酸显著地减少峰B的形成并消除HMW的生成/聚集物的形成(图10BU1A)。
[0099]进一步地，意外地发现，为了最佳地控制峰B的水平和HMW的生成，在CEX操作的所有阶段(加样、洗涤和洗脱)都需要精氨酸(图11B)。虽然不希望受任何特定理论或机制约束，但精氨酸似乎是通过减少可用结合位点和抑制洗脱后的HMW形成来抑制HMW形成。
[0100]利用其它mAb的后续实验揭示，这种现象不是mAbl或无糖基化的分子所特有的。在Fractogel? so3_上显示出峰分裂的分子还包括许多糖基化的lgG2分子(参见例如图14)。
[0101]离子交换层析
[0102]本文详述的方法适合于与包括阴离子交换(AEX)层析和阳离子交换(CEX)层析的离子交换层析结合使用。IEX 一般使用离子交换树脂进行，通常可根据标准方法将离子交换树脂装填到可用于蛋白质纯化的柱中。[0103]阴离子交换(“AEX”)层析可基本上如P.Gagnon，1996，Purification toolsfor Monoclonal Antibodies，Validated Biosystems, Tucson，Arizona 中所描述的那样执行。可与AEX —起使用的合适的树脂、柱或介质包括但不限于快流速Q琼脂糖凝胶?、快流速DEAE琼脂糖凝胶?、快流速ANX琼脂糖凝胶?4 (高分辨率)、Q琼脂糖凝胶? XL、Q琼脂糖凝胶大珠、DEAE葡聚糖凝胶A-25、DEAE葡聚糖凝胶A_50、QAE葡聚糖凝胶A_25、QAE葡聚糖凝胶A-50、高效Q琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶XL、Soursel5Q、Sourse30Q、ResourseQ、Capto Q、Capto DEAE、Mono Q、Toyopearl Super Q、Toyopearl DEAE、Toyopearl QAE、Toyopearl Q、Toyopearl GigaCap Q、TSKgel SuperQ、TSKgel DEAE、Fractogel EMD TMAEΛFractogel EMD TMAE HiCap、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD DMAEΛMacroprep HighQ、Macro-prep-DEAE、Unosphere Q、Nuvia Q、POROS HQ、POROS P1、DEAE Ceramic HyperD,和 Q Ceramic HyperD0
[0104]阳离子交换(“CEX”)层析可使用基本上如P.Gagnon，(1996)同上，和Yigzaw，Y 等，(2009)，Curr Pharm Biotechnol.，10 (4)，421-6)中所描述的标准方法执行。可与CEX 一起使用的合适的树脂、柱或介质包括但不限于SP琼脂糖凝胶?、CM琼脂糖凝胶?、Toyopearl? SP650M，和Fractogel? S03—。另外的合适的CEX树脂、柱或介质包括FractogelS03-SE HiCap (M)^Fractogel COO-(M)、YMC-BioPro S75、Capto 3、3卩琼脂糖凝胶乂17^卩、01Sepahrose FFΛ SP/CM Toyopearl650m、Toyopearl SP550c、Toyopearl GigaCap、UNOsphereSλ Eshmuno Ξλ Macroprep High S，和 POROS HS50。
[0105]优化甘氨酸，精氨酸和/或组氨酸浓度
[0106]在任何生产工艺中，可对精确的甘氨酸，精氨酸和/或组氨酸使用浓度进行优化以在HMW生成的抑制与其它性能参数之间取得平衡，所述其它性能参数例如，杂质选择性、动态结合容量和病毒清除率。特别地，预计在工艺中使用例如甘氨酸或精氨酸时结合容量可能会降低-例如，在涉及mAbl的一组实验中，发现IOOmM精氨酸的加入导致结合容量为70g/L树脂，而对照柱(没有加入精氨酸)显示出110g/L树脂的结合容量。使用本文所提供的指南，本领域技术人员可容易地执行优化实验以在HMW生成的抑制与结合容量之间达到期望的平衡。类似地，病毒清 除率也可能受影响。例如，据信XmuLV结合至CEX树脂；如果精氨酸减弱与树脂的相互作用，那么它也可能影响病毒清除率。进一步地，降低蛋白质存留率的条件也可能影响病毒相对于产品的洗脱。如本文所详述的，本领域技术人员可容易地利用少数简单的实验，例如，如下面列举的实验优化这些参数。
[0107]杂质诜择件
[0108]在研发期间，可使用许多不同的方法评估杂质选择性。与这些方法有关地，可使不纯的原料结合至IEX树脂，然后通过改变pH、盐强度、pH和盐强度，或任何其它将破坏导致结合的离子相互作用的方法来洗脱所述原料。这可通过分步或梯度洗脱来实现。在这两种情况下，从柱中洗脱的级分都可与进料物中的杂质进行比较从而评估不需要的物质的除去。另外，可对跨越单一梯度洗脱的各个级分进行分析以确定与杂质相比较目标产品是在哪一梯度洗脱的。可在多种条件(pH、缓冲液类型、盐类型、质量负载量、停留时间等)下进行这些实验以确定产生伴有可接受步骤产率的最佳分辨率的条件。替代地，可在其中目标产品在结合阶段期间流过柱而杂质与树脂结合的条件下，评价选择性。
[0109]动态结合容量[0110]动态结合容量一般通过在目标结合条件下执行前沿实验(frontal experiment)来确定。在这些实验中，可将目标产品以预期将超过动态结合容量的质量负载量(g产品/L树脂)加载到平衡化的树脂上。在加载期间，监测柱流出物以检测产品穿透。当检测到穿透时，计算已结合至树脂的蛋白质的量并将其表示为每体积树脂的结合产品质量。
[0111]病毒清除率
[0112]层析单元操作的病毒清除率评估通常在层析步骤的合格缩减模型上执行。在这些研究期间，执行如对于单元操作来说典型的柱操作(缓冲液、pH、床层高度、质量负载量等)。在加样之前，在进料物中掺入模型病毒(例如XmuLV是用于模拟表达于哺乳动物细胞中的内源性逆转录病毒样颗粒(RVLP)的常见病毒)。然后在后续的层析运行期间，取出样品并针对病毒的存在进行测定。然后将含有产品的汇集物中的病毒量与加载到柱上的量(和同步对照)进行比较以确定在该步骤期间除去的病毒量。这通常表示为log减少值，或LRV。
[0113]实施例
[0114]提供包括进行的实验和获得的结果在内的以下实施例仅为了说明，而不应解读为限制所附权利要求的范围。
[0115]材料和方法
[0116]蛋白质制 备品
[0117]无糖基化的单克隆IgGl抗体mAbl表达于CHO细胞中。CH2结构域中的N-糖基化位点通过使天门冬酰胺297突变为谷氨酰胺(N297Q)来除去。根据cIEF，mAbl的实验Pl为7.6。除非另外指出，否则利用多个层析步骤纯化mAbl进料物以获得高纯度储备溶液(HMW < 2%,HCP < 50ppm,DNA < L0D，根据 rCE-SDS，被修剪的物质< 1% ) ? 在 MabSelect蛋白A树脂(GE Healthcar e, Piscataway, NJ, USA)上捕获所收获的细胞培养液(HCCF)中的mAbl。蛋白A洗脱汇集物经受低pH酸处理步骤，接着将其中和至pH5.0并进行硅藻土深度过滤从而形成经过滤的病毒灭活汇集物(FVIP)。精制步骤是以流过(flow through)模式操作，使用 Fractogel S03-(EMD Biosciences,Gibbstown,NJ,USA)进行的阳离子交换层析，及随后使用高分辨率苯基琼脂糖凝胶(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)进行的疏水相互作用层析(HIC)。然后将HIC汇集物浓缩至70g/L，并通过切向流过滤(TFF)对该汇集物进行缓冲液交换，使其进入用PH5.2的IOmM乙酸盐进行缓冲的9%蔗糖溶液中。对于这些研究,使用Millipore Pellicon3 30kD再生的纤维素膜(Billerica, MA, USA)通过TFF对经纯化的蛋白质储备溶液进行缓冲液交换，使其达到所需的CEX负载条件。
[0118]阳离子交换层析
[0119]CEX 层析使用基本上如 P.Gagnon, (1996)同上，和 Yigzaw, Y 等,(2009), CurrPharm Biotechnol., 10 (4),421-6)中所描述的标准方法执行。一般来说，在此前已穿过蛋白A柱、经受低pH病毒灭活步骤(pH?3.6下60min)并然后被调回至中性pH的材料(“中和的酸处理的汇集物”)上进行CEX。在典型的实验中，对于每升中和的酸处理的汇集物，力口入IOOmL含有50mM乙酸钠、1.0M精氨酸的pH为5.0的溶液。将经调整的中和的酸处理的汇集物加载到CEX柱上至最高达30g/L树脂。产品通常作为单一级分洗脱。将每种CEX洗脱汇集物通过0.2 μ m过滤器过滤，并相继汇集到储罐中。
[0120]固定相Fractogel EMD S03_(M)和 Fractogel EMD S03_(S)获自 EMDBiosciences (Gibbstown, NJ, USA) ；Toyopearl SP-650M 获自 Tosohaas (Montgomery, PA,USA);快流速SP琼脂糖凝胶4和CM琼脂糖凝胶获自GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)。除非另外指出，所有层析运行都使用Fractogel S03_(M)执行。除非另外规定，否则条件和参数如下。柱直径:根据需要，以所用材料的体积为基础。床层高度:20+/-2cm;线性流速:以150cm/hr加样、以100cm/hr洗脱和脱荷载(strip);加样:彡30mg/mL树脂;UV监测器波长:300nm ;产品收集:起始-OD = 0.05，结束-10% max OD0
[0121]该柱通常用0.5M乙酸钠，pH5.0预平衡，然后用75mM乙酸钠，0.1M精氨酸，pH5.0平衡。加载物通常为如上所描述的中和的酸处理的汇集物；洗涤缓冲液:75mM乙酸钠，0.1M精氨酸，PH5.0 ;洗脱缓冲液:75mM乙酸钠，0.1M精氨酸，0.125M硫酸钠，pH5.0 ;脱荷载缓冲液:0.2M氢氧化钠；再生缓冲液:0.5M氢氧化钠；以及柱储存缓冲液:0.2M氢氧化钠。
[0122]所有小试规模层析运行都在AKTA Explorer上使用Unicorn软件5.01版(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)进行。将 CEX 树脂装填到 1.1cm ID Vantage 柱(MiIlipore, Billirica, MA, USA)中至床层高度为大约20cm，并以140cm/hr的线性速度进行操作。CEX柱用3倍柱体积(CV)的50mM乙酸钠/1.0M氯化钠，pH5.0预平衡，接着用3CV50mM乙酸钠，pH5.0预平衡。监测柱流出物的pH和电导率以确保树脂被适当地平衡。加载在50mM乙酸钠，pH5.0中的高度纯化的mAbl至20g/L树脂。加样后，通常用3CV50mM乙酸钠，PH5.0洗涤柱。用20CV的从50mM乙酸钠，pH5.0至50mM乙酸钠/1.0M氯化钠，pH5.0的线性梯度洗脱mAbl。使用Frac-950级分收集器对洗脱峰分懼。监测蛋白质在280nm和300nm处的吸光度。在整个运行期间，在线测量pH和电导率。文中指出相对于上述方法的任何变化。
[0123]使用与上述操作条件相同的操作条件，利用0.4cm IDX IOcm高度的PEEK柱(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)和配备有 Waters2996Photodiode ArrayDetector 的 Waters Alliance2695Separations Module (Milford,MA)执行分析规模实验。使用Waters Empower2软件(6.2版)执行方法控制和积分。
`[0124]所有研究都在环境温度下执行，除非另外指出。在步入式温度控制室(Environmental Growth Chamber,Chagrin Falls,OH,USA)中执行温度控制的研究。在层析运行之前，使所有溶液和柱平衡至温度设定点。
[0125]HMW III Ct?
[0126]% HMW 的计算
[0127]通过分析型尺寸排阻层析(参见下面的SEC分析)测定样品中的HMW水平。HMW被表示为占总蛋白含量的百分比(例如，％ HWW+%单体+% LMW = 100% )
[0128]HMW质量平衡率的计算
[0129]HMW质量平衡率由洗脱汇集物(在合适的情况下和脱荷载汇集物)中的HMW的量除以加载到柱上的HMW的量而得，并且表示为百分比。加载物和洗脱物中的HMW的量由样品体积乘以产品浓度，并然后乘以该材料的分数而得，该材料的分数为由SEC测定测量的HMW值。
[0130]A280
[0131]使用A280方法测定纯化样品中的蛋白质浓度。基于理论氨基酸组成计算产品特定消光系数并通过实验证实。稀释测试样品的体积并测量在280nm波长处的UV吸光值。使用Beer Lambert Law A= ε be (A =吸光度，ε =消光系数，b =路经长度，c =浓度)计算蛋白质浓度。结果报告为mg/mL。
[0132]SEC 分析
[0133]尺寸排阻HPLC基于溶液中蛋白质的多聚体形式的流体力学体积及聚集物峰比单体形式峰先洗脱来分离该蛋白质。在环境温度下将测试样品和参考标准注入到分离柱中。运行缓冲液为IOOmM磷酸钠/250mM氯化钠，pH6.8。流速为0.5mL/min。将样品以纯的形式注入直到300 μ g负载量。使用Tosoh TSK-GEL G3000SWXL，5 μ m颗粒大小，7.8 X 300mm尺寸排阻柱，使高分子量组分与主要组分(单体)分离。在磷酸钠和氯化钠流动相中等度洗脱组分。在280nm处检测洗脱峰并经由HPLC软件积分。分析参考标准作为测定对照以鉴定任何出乎预料的峰以及以确保该测定的有效性。测试样品结果报告为高分子量组分、主要组分(单体)，和如果有的话，低分子量组分的相对峰面积百分比。HMW增加倍数通过对跨越整个洗脱峰的HMW质量求和并除以起始HMW质量计算出来。
[0134]CEX HPLC 分析
[0135]离子交换HPL C基于变异体的表面电荷差异来分离变异体。在适当的pH下，在离子交换柱上用盐梯度洗脱分离带电荷蛋白质。通过UV吸光度监测洗脱液。使用DionexProPac WCX-1O柱通过阳离子交换层析(CEX)分离电荷变异体。以0.8mL/min的流速将蛋白质在PH6.3的20mM磷酸钠流动相中施加到柱中。使用0_150mM NaCl的线性梯度经50分钟洗脱电荷变异体，总运行时间为70分钟。在280nm处检测洗脱峰并使用层析软件积分。
[0136]实施例1-CEX层析
[0137]使用MabSelect蛋白A树脂对mAb I进行初步纯化，接着进行低pH病毒灭活和深度过滤。经深度过滤的病毒灭活汇集物(FVIP)具有3.9%_物质和大约3000--111 HCP。使用用30mM乙酸盐，pH5进行缓冲的OmM NaCl至500mM NaCl的NaCl梯度对样品(20gmAbl/L树脂)进行CEX Fractogel? SCV层析。示例性数据在图1A中示出。一条迹线是在300nm处的吸光度，其显示出具有两个明显的峰的非典型曲线，这两个峰在图表上标记为“A”和“B”。图1A中还示出洗脱液中高分子量(“HMW”)物质的百分比(误差棒)的图形，其显示峰B具有如上面所描述的那样测定的显著较高的百分比的高分子量(HMW)组分。
[0138]下表I示出对来自两个实验的％产率、％ HMW和HMW质量平衡率数据的汇总。％产率由洗脱汇集物中的总质量除以加载在柱上的总质量来计算(表示为百分比)。%HMW和HMW质量平衡率按照如上所述进行计算。
[0139]表I
【权利要求】
1.一种减少使用离子交换(IEX)层析纯化的含有蛋白质的样品中的高分子量物质(HMW)形成的方法，其包括 将在含有至少ImM的一种或多种选自由精氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸的加样缓冲液中的蛋白质加载到IEX树脂上，和 使用含有至少ImM的一种或多种选自由精氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸的洗脱缓冲液将所述蛋白质从所述IEX树脂上洗脱下来， 其中与使用IEX层析利用不含至少ImM的一种或多种选自由精氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸的加样和洗脱缓冲液纯化的蛋白质样品相比较，所述加样缓冲液和洗脱缓冲液中存在的所述一种或多种氨基酸减少所述样品中的HMW形成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述IEX树脂在IEX柱中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在所述加样与所述洗脱之间用洗涤缓冲液洗涤所述柱或树脂，其中所述洗涤缓冲液含有至少ImM的一种或多种选自由精氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸。
4.根据权 利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述缓冲液中的每一种均含有至少IOmM的一种或多种选自由精氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种氨基酸为甘氨酸，并且所述缓冲液中的每一种均含有至少IOmM甘氨酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种氨基酸为精氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述缓冲液中的每一种均含有至少20mM精氨酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述IEX柱或树脂为阴离子交换(AEX)柱或树脂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述AEX柱或树脂选自由以下组成的组:快流速Q琼脂糖凝胶、快流速DEAE琼脂糖凝胶、快流速ANX琼脂糖凝胶4、Q琼脂糖凝胶XL、Q琼脂糖凝胶大珠、DEAE Sephadex A_25、DEAE葡聚糖凝胶A_50、QAE葡聚糖凝胶A_25、QAE葡聚糖凝胶A-50、高效Q琼脂糖凝胶、Q琼脂糖凝胶XL、Soursel5Q> Sourse30Q> ResourseQ、Capto Q、Capto DEAEΛ Mono Q、Toyopearl Super Q、Toyopearl DEAEΛ Toyopearl QAE、Toyopearl Q、Toyopearl GigaCap Q、T SKgel SuperQ、T SKgel DEAE、Fractogel EMD TMAEΛFractogel EMD TMAE HiCap、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD DMAEΛMacroprep HighQ、Macro-prep-DEAE、Unosphere Q、Nuvia Q、POROS HQ、POROS P1、DEAE Ceramic HyperD,及 Q Ceramic HyperD0
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述IEX柱或树脂为阳离子交换(CEX)柱或树脂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述CEX柱或树脂选自由以下组成的组:SP琼脂糖凝胶、CM 琼脂糖凝胶、Toyopearl SP650M,及 Fractogel SO3'
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述CEX柱或树脂选自由以下组成的组:Fractogel S03-SE HiCap (M)、Fractogel COO-(M)、YMC-BioPro S75、Capto S、SP 琼脂糖凝胶 XL/FF、CM Sepahrose FF> SP/CM Toyopearl650m> Toyopearl SP550c> ToyopearlGigaCap、UNOsphere S> Eshmuno S> Macroprep High S,及 POROS HS50。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述缓冲液中的每一种均具有介于.4.0与6.5之间的pH。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述缓冲液中的每一种均选自由以下组成的组:乙酸盐缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和bis tris缓冲液。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法在介于2°C与8°C之间的温度下进行。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述方法在介于15°C与25°C之间的温度下进行。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述柱停留时间介于I分钟与4小时之间。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为重组产生的蛋白质或多肽。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述蛋白质选自由以下组成的组:肽体、基于结构域的蛋白，及单克隆抗体或其抗原结合片段。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质为选自由以下组成的组的治疗性单克隆抗体(mAb):1gGlmAb、IgG2mAb 和 IgG4mAb。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述mAb为无糖基化的mAb。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述mAb为无糖基化的IgGlmAb。
23.根据权利要求1- 22中任一项所述的方法，其用于治疗性生物产品的下游工艺纯化中。
【文档编号】C07K1/18GK103429609SQ201180066996
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年11月23日 优先权日:2010年12月8日
【发明者】R.吉勒斯皮, S.瓦努姆, T.阮, S.麦克奈尔 申请人:安姆根有限公司