一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法
【专利摘要】本发明提供了一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，包含粗纯工艺和精纯工艺，粗纯工艺为：将由重组DNA技术所得的rhTRAIL工程菌经扩大培养发酵所收集的菌体进行高压匀浆破碎、高速离心分离、微滤处理；精纯工艺为：将上一步粗纯工艺所得的粗纯样进行离子层析、疏水层析、凝胶过滤层析、浓缩，最终得到符合质量要求的样品。本发明工作周期短，回收率高，生产成本较低，适合大规模工业生产。
【专利说明】—种rhTRAIL菌体的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制品的分离纯化领域，具体涉及一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-1nducing ligand,TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo2 ligand, Apo2L)，是1995年发现的TNF家族新成员。无论在体内还是体外，可溶形式TRAIL均可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。人全长的TRAIL分子由281个氨基酸组成，属II型跨膜蛋白，包括胞浆区、跨膜区和胞膜外区，分子量为32.5kD，等电点为7.63。TRAIL分子在第114位~281位氨基酸为可溶性肽段，可通过一个锌离子形成活性最强的同源三聚体结构。TRAIL是通过与其细胞膜受体结合发挥其诱导凋亡作用的。目前已经发现的 TRAIL 受体有 5 种:TRAIL-R1 (DR4)、TRAIL_R2 (DR5)、TRAIL_R3 (DcRl)、TRAIL-R4 (DcR2)和护骨素(osteoprotegerin，0PG)。TRAIL与死亡受体结合可以激活线粒体依赖和非线粒体依赖两条细胞凋亡信号途径，介导死亡信号转导入细胞内，启动效应酶胱天蛋白酶3 (caspase-3)，最终引起肿瘤细胞凋亡。与TNF家族其它成员相比，TRAIL具有可选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞毒副作用小的优点，被认为是一种具有广阔发展前景的抗肿瘤药物，从2000年以来，一直受到国内许多研究者的广泛关注。利用DNA重组技术和大肠杆菌表达体系经下游纯化得到的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)成功的用于临床研究，但为给后期的大量用药和工业生产中提供保障，还需开发出一种适合rhTRAIL大规模生产的高纯化效率的工艺。
[0003]原有的纯化工艺虽然最后能得到的符合质量要求的样品，但是工作周期长，回收率低,生产成本过大的的原因,不太适合大规模工业生产的需求。`
【发明内容】
[0004]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种工作周期短，回收率高，生产成本较低，适合大规模工业生产的rhTRAIL菌体的分离纯化方法。
[0005]本发明的一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，包含粗纯工艺和精纯工艺:
[0006]所述粗纯工艺为:将由重组DNA技术所得的rhTRAIL工程菌经扩大培养发酵所收集的菌体进行高压匀浆破碎、高速离心分离、微滤处理；
[0007]所述精纯工艺为:将上一步所述粗纯工艺所得的粗纯样进行离子层析、疏水层析、凝胶过滤层析、浓缩得样品。
[0008]进一步地，
[0009]在所述粗纯工艺中，
[0010]所述高压匀浆破碎为:称取一定量冷冻保藏的rhTRAIL菌体加入适量的BI液后用组织捣碎机捣碎均匀至没有块状菌体，再一次加入适量的BI液使最终菌体浓度为10%，将捣碎均匀的菌体混悬液进行1500bar的压力破碎一次，收集匀浆破碎液并置于4_8°C冷藏备用;
[0011]所述高速离心分离为:将上述高压匀浆破碎所得的匀浆破碎液进行13000r离心30min，收集上清液并置于4-8°C冷藏备用；
[0012]所述微滤为:将上述高速离心分离所得的上清液进行微滤处理，收集透膜微滤液并置于4-8°C冷藏备用，所收集的微滤液即为粗纯样；
[0013]在所述精纯工艺中， [0014]所述离子层析为:UNOQ阴离子层析,先用0.5M/L NaOH以15ml/min处理UNOQ阴离子层析柱120min,再用B液以40ml/min处理柱子2个柱体积,然后用D液以40ml/min再生柱子I个柱体积，接着再用B液以40ml/min平衡柱子2个柱体积；柱子平衡完后，将上述微滤所得的粗纯样以40ml/min上样UNOQ阴离子层析柱,再用B液以40ml/min淋洗柱子2.5个柱体积，最后用C液以40ml/min进行洗脱，收集电导为8mS/cm的洗脱峰样；
[0015]所述疏水层析为:Phenyl疏水层析，即先用0.5M/L NaOH以15ml/min处理Phenyl疏水层析柱120min，再用F液以40ml/min平衡疏水柱2个柱体积；柱子平衡完后，将上述离子层析收集的洗脱峰样加入比例体积的G液后以40ml/min上样疏水柱；用E液以40ml/min淋洗柱子2个柱体积,最后用E液以40ml/min —步洗脱,收集电导为150ms/cm的洗脱峰样；
[0016]所述凝胶过滤层析为:Sepacryl S200层析，即先用0.5M/L NaOH以15ml/min处理S200层析柱120min，再用H液以40ml/min平衡柱子3个2.5个柱体积；柱子平衡完后，将上述疏水层析收集的洗脱峰样以40ml/min上样，最后用H液一步洗脱收集洗脱峰样；
[0017]所述浓缩为:将上述凝胶过滤层析中收集的洗脱峰样进行超滤浓缩，浓缩10倍，收集浓缩样置于4-8°C冷藏备用。
[0018]优选地，
[0019]所述BI液为50mM/L Tris-HCl,pH8.5的缓冲液，使用前按菌体量加入0.1% DTT ；
[0020]所述B 液为 20mM/L Tris-HCl, pH8.5 的缓冲液；
[0021]所述C 液为 20mM/L Tris-HCl,80M NaCl，pH8.5 的缓冲液；
[0022]所述D 液为 20mM/L Tris-HCl, 2M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液；
[0023]所述E 液为 20mM/L Tris-HCl, 1.5M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液；
[0024]所述F 液为 20mM/L Tris-HCl, 3M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液；
[0025]所述G 液为 20mM/L Tris-HCl, 4M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液；
[0026]所述H 液为 10mM/L Na2HPO4、IOmM/L NaH2PO4、50mM/L NaCl、pH7.0 的缓冲液。
[0027]所述BI液、C液、D液、E液、F液、G液与H液用注射用水配制，配制完成用0.22um的滤膜进行除菌过滤。
[0028]进一步地，
[0029]在所述微滤中，
[0030]所述微滤处理为微滤膜系统处理，所述微滤膜系统在使用前经0.5M/L NaOH以15ml/min 处理 2L, B 液以 300ml/min 平衡 2L ；
[0031]所述微滤膜系统中的微滤膜规格为0.45um，膜面积为0.1m2 ；
[0032]在所述离子层析中，
[0033]所述层析柱的规格为BPG100/500，柱体积为1.5L ；[0034]在所述疏水层析中，
[0035]所述层析柱的规格为BPG100/500，柱体积为2L ；
[0036]在所述浓缩中，
[0037]所述超滤浓缩为超滤膜系统浓缩，所述超滤膜系统在使用前经0.5M/L NaOH以15ml/min 处理 120min, H 液以 200ml/min 平衡 2L ；
[0038]所述超滤膜系统中的超滤膜的规格为10KD，0.lm2。
[0039]进一步地，
[0040]在所述微滤中，
[0041]所述微滤处理的进样流速为300ml/min ；
[0042]在所述浓缩中，
[0043]所述超滤浓缩的进样速度为200ml/min。
[0044]进一步地，
[0045]在精纯工艺中，
[0046]所述离子层析在GMP要求的C级洁净区完成；
[0047]所述疏水层析在GMP要·求的C级洁净区完成；
[0048]所述凝胶过滤层析在GMP要求的C级洁净区完成；
[0049]所述浓缩在GMP要求的B级洁净区完成。
[0050]本发明的优点有:
[0051]1.本发明工艺缩短了工艺流程，每生产批次工作时间在原工艺基础上缩短一半。
[0052]2.本发明工艺每批次生产量约为原工艺的1.5倍。
[0053]3.本发明工艺的回收率约为原工艺的2倍。
[0054]4.经本工艺分离纯化后，最终所得样品经PAGE-SDS(即十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和HPLC (即高效液相色谱)分析出的纯度>99.9%，生物学活性≤2.0X 104IU/mg,热源检验合格。
[0055]5.本发明简单的工艺流程，相对节约的生产成本，也方便工作人员的操作和维护，可进行有效的质量控制，并且生产效率高，适于大规模的工艺生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]图1为本发明工艺流程图。
【具体实施方式】
[0057]在本发明中，为了缩短工作周期，提高回收率，降低生产成本，将粗纯后的分离纯化技术进一步改进，缩短层析操作的步骤，如图1所示，粗纯之后是离子层析、疏水层析、凝胶过滤层析、浓缩，缩短为四步骤。
[0058]下面对此图1所示的各个步骤通过本发明的具体实施例来进一步阐述。
[0059]实施例
[0060]参见图1，按下述步骤，将样品rhTRAIL菌体进行分离纯化:
[0061]步骤1:粗纯:
[0062]1.1高压匀浆破碎:[0063]称取一定量冷冻保藏的rhTRAIL菌体加入适量的BI液后用组织捣碎机捣碎均匀至没有块状菌体，再一次加入适量的BI液使最终菌体浓度为10%，将捣碎均匀的菌体混悬液进行1500bar的压力破碎一次，收集匀浆破碎液并置于4_8°C冷藏备用。
[0064]所述BI液为50mM/L Tris-HCl,pH8.5的缓冲液，使用前已按菌体量加入了 0.1%DTT ;并用注射用水配制，配制完成用0.22um的滤膜进行除菌过滤。
[0065]1.2高速离心分离
[0066]将步骤1.1中所得的匀浆破碎液进行13000r离心30min，收集上清液并置于4-8 °C冷藏备用。
[0067]1.3 微滤
[0068]将步骤1.2中所得的上清液进行微滤处理，收集透膜微滤液并置于4_8°C冷藏备用，所收集的微滤液即为粗纯样。
[0069]微滤处理中微滤膜系统在使用前经0.5M/L NaOH以15ml/min处理2L，B液以300ml/min 平衡 2L ;所述 B 液为 20mM/L Tris-HCl, ρΗ8.5 的缓冲液。0.5M/L NaOH, B 液用注射用水配制。
[0070]微滤膜系统中用到的微滤膜规格为0.45um，膜面积为0.1m2 ;微滤处理进样流速为 300ml/min。
[0071]步骤2:离子层析
[0072]即UNOQ阴离子层析。先用0.5M/L NaOH以15ml/min处理UNOQ阴离子层析柱120min,再用B液以40ml/min处理柱子2个柱体积,然后用D液以40ml/min再生柱子I个柱体积，接着再用B液以40 ml/min平衡柱子2个柱体积。柱子平衡完后，将1.3中所得的粗纯样以40ml/mim上样UNOQ阴离子层析柱,再用B液以40ml/min淋洗柱子2.5个柱体积，最后用C液以40ml/min进行洗脱，收集电导为8mS/cm的洗脱峰样。
[0073]所述B 液为 20mM/L Tris-HCl, ρΗ8.5 的缓冲液。
[0074]所述D 液为 20mM/L Tris-HCl, 2M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液。
[0075]所述C 液为 20mM/L:Tris-HCl,80M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液。
[0076]所述0.5M/L NaOH、B、C、D液用注射用水配制。其中B、C、D液配制完成用0.22um的滤膜进行除菌过滤。
[0077]所述层析柱的规格为BPG100/500，柱体积为1.5L。
[0078]此离子层析工艺在GMP要求的C级洁净区完成。
[0079]步骤3:疏水层析
[0080]即Phenyl疏水层析。先用0.5M/L NaOH以15ml/min处理Phenyl疏水层析柱120min,再用F液以40ml/min平衡疏水柱2个柱体积。柱子平衡完后，将步骤2中收集的洗脱峰样液加入G液稀释，使样液最后所舍NaCl浓度与F液中NaCl浓度一致，然后以40ml/min上样疏水柱。用E液以40ml/min淋洗柱子2个柱体积,最后用E液以40ml/min —步洗脱，收集电导为150ms/cm的洗脱峰样。
[0081]所述F 液为 20mM/L Tris-HCl, 3M NaCl，pH8.5 的缓冲液。
[0082]所述G 液为 20mM/L Tris-HCl, 4M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液。
[0083]所述E 液为 20mM/L Tris-HCl, 1.5M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液。
[0084]所述0.5M/L NaOH、F、G、E液用注射用水配制。其中F、G、E液配制完成用0.22um的滤膜进行除菌过滤。
[0085]所述层析柱的规格为BPG100/500，柱体积为2L。
[0086]此疏水层析工艺在GMP要求的C级洁净区完成。
[0087]步骤4:凝胶过滤层析
[0088]即S印acryl S200 层析。先用 0.5M/L NaOH 以 15ml/min 处理 S200 层析柱 120min，再用H液以40ml/min平衡柱子3个2.5个柱体积。柱子平衡完后，将步骤3中收集的洗脱峰样以40ml/min上样，最后用H液一步洗脱收集洗脱峰样。
[0089]所述H 液为 10mM/L Na2HP04、10mM/L NaH2P04、50mM/L NaCl、pH7.0 的缓冲液。
[0090]所述0.5M/L NaOH、H液用注射用水配制。其中H液配制完成用0.22um的滤膜进行除菌过滤。
[0091]所述层析柱的规格为BPG100/500，柱体积为4L。
[0092]此凝胶过滤层析工艺在GMP要求的C级洁净区完成。
[0093]步骤5:浓缩
[0094]将步骤4中收集的洗脱峰样进行超滤浓缩，浓缩10倍，收集浓缩样置于4_8°C冷藏备用。
[0095]所述超滤浓缩为超滤膜系统浓缩，超滤膜系统在使用前经0.5M/L NaOH以15ml/min 处理 120min，H 液以 200ml/min 平衡 2L ;所述 H 液为 10mM/L Na2HP04、10mM/L NaH2P04、50mM/L NaCl、pH7.0的缓冲液，0`.5M/L NaOH、H液用注射用水配制。其中H液配制完成用
0.22um的滤膜进行除菌过滤。
[0096]超滤膜系统中的超滤膜的规格为10KD，0.1m2.[0097]超滤浓缩的进样速度为200ml/min.[0098]此浓缩工艺在GMP要求的B级洁净区完成。
[0099]最后，将经步骤5得到的样品经PAGE-SDS (即十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和HPLC (即高效液相色谱)测试:
[0100]分析出的生物活性为2.5X104IU/mg
[0101]分析出的纯度为99.95%。
[0102]上述所述的是本发明优选的实施例，但不是对本发明的限定，对于本领域的普通技术人员根据本
【发明内容】
所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，其特征在于，包含粗纯工艺和精纯工艺: 所述粗纯工艺为:将由重组DNA技术所得的rhTRAIL工程菌经扩大培养发酵所收集的菌体进行高压匀浆破碎、高速离心分离、微滤处理； 所述精纯工艺为:将上一步所述粗纯工艺所得的粗纯样进行离子层析、疏水层析、凝胶过滤层析、浓缩得样品。
2.如权利要求1所述的一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，其特征在于， 在所述粗纯工艺中，所述高压匀浆破碎为:称取一定量冷冻保藏的rhTRAIL菌体加入适量的BI液后用组织捣碎机捣碎均匀至没有块状菌体，再一次加入适量的BI液使最终菌体浓度为10%，将捣碎均匀的菌体混悬液进行1500bar的压力破碎一次，收集匀浆破碎液并置于4_8°C冷藏备用；所述高速离心分离为:将上述高压匀浆破碎所得的匀浆破碎液进行13000r离心30min，收集上清液并置于4-8°C冷藏备用； 所述微滤为:将上述高速离心分离所得的上清液进行微滤处理，收集透膜微滤液并置于4-8°C冷藏备用，所收集的微滤液即为粗纯样； 在所述精纯工艺中， 所述离子层析为=UNOQ阴离子层析，先用0.5M/L NaOH以15ml/min处理UNOQ阴离子层析柱120min,再用B液以40ml/min处理柱子2个柱体积,然后用D液以40ml/min再生柱子I个柱体积，接着再用B液以40ml/min平衡柱子2个柱体积；柱子平衡完后，将上述微滤所得的粗纯样以40ml/min 上样UNOQ阴离子层析柱,再用B液以40ml/min淋洗柱子2.5个柱体积，最后用C液以40ml/min进行洗脱,收集电导为8mS/cm的洗脱峰样； 所述疏水层析为=Phenyl疏水层析，即先用0.5M/L NaOH以15ml/min处理Phenyl疏水层析柱120min，再用F液以40ml/min平衡疏水柱2个柱体积；柱子平衡完后,将上述离子层析收集的洗脱峰样加入比例体积的G液后以40ml/min上样疏水柱；用E液以40ml/min淋洗柱子2个柱体积,最后用E液以40ml/min —步洗脱,收集电导为150ms/cm的洗脱峰样；所述凝胶过滤层析为:S^acryl S200层析，即先用0.5M/L NaOH以15ml/min处理S200层析柱120min，再用H液以40ml/min平衡柱子3个柱体积；柱子平衡完后，将上述疏水层析收集的洗脱峰样以40ml/min上样，最后用H液一步洗脱收集洗脱峰样； 所述浓缩为:将上述凝胶过滤层析中收集的洗脱峰样进行超滤浓缩，浓缩10倍，收集浓缩样置于4-8°C冷藏备用。
3.如权利要求2所述的一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，其特征在于， 所述BI液为50mM/L Tris-HCl, pH8.5的缓冲液，使用前按菌体量加入0.1 % DTT ； 所述B液为20mM/L Tris-HCl，ρΗ8.5的缓冲液； 所述 C 液为 20mM/L Tris-HCl,80M NaCl, ρΗ8.5 的缓冲液； 所述 D 液为 20mM/L Tris-HCl, 2M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液； 所述 E 液为 20mM/L Tris-HCl, 1.5M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液； 所述 F 液为 20mM/L Tris-HCl, 3M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液； 所述 G 液为 20mM/L Tris-HCl,4M NaCl，ρΗ8.5 的缓冲液； 所述 H 液为 10mM/L Na2HPO4UOmM/L NaH2PO4、50mM/L NaCl、pH7.0 的缓冲液。
4.如权利要求3所述的一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，其特征在于，所述BI液、C液、D液、E液、F液、G液与H液用注射用水配制，配制完成用0.22um的滤膜进行除菌过滤。
5.如权利要求4所述的一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，其特征在于， 在所述微滤中， 所述微滤处理为微滤膜系统处理，所述微滤膜系统在使用前经0.5M/L NaOH以15ml/min 处理 2L, B 液以 300ml/min 平衡 2L ； 所述微滤膜系统中的微滤膜规格为0.45um，膜面积为0.1m2 ； 在所述离子层析中，
所述层析柱的规格为BPG100/500，柱体积为1.5L ； 在所述疏水层析中， 所述层析柱的规格为BPG100/500，柱体积为2L ； 在所述凝胶过滤层析中， 所述层析柱的规格为BPG100/500，柱体积为4L ； 在所述浓缩中， 所述超滤浓缩为超滤膜系统浓缩，所述超滤膜系统在使用前经0.5M/L NaOH以15ml/min 处理 120min, H 液以 200ml/min 平衡 2L ； 所述超滤膜系统中的超滤膜的规格为10KD，0.lm2。
6.如权利要求5所述的一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法,其特征在于， 在所述微滤中， 所述微滤处理的进样流速为300ml/min ； 在所述浓缩中， 所述超滤浓缩的进样速度为200ml/min。
7.如权利要求6所述的一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法,其特征在于， 在精纯工艺中， 所述离子层析在GMP要求的C级洁净区完成； 所述疏水层析在GMP要求的C级洁净区完成； 所述凝胶过滤层析在GMP要求的C级洁净区完成； 所述浓缩在GMP要求的B级洁净区完成。
【文档编号】C07K1/34GK103588871SQ201210291064
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月16日 优先权日:2012年8月16日
【发明者】王军, 张静, 李靖文 申请人:深圳新鹏生物工程有限公司