专利名称：一种棱角丝瓜甙a的提纯方法
技术领域：
本发明属于天然植物技术领域，涉及一种棱角丝瓜甙A的提纯方法。
背景技术：
棱角丝瓜甙A(Acutoside A),又名齐墩果酸3_槐糖甙，分子式为C42H68O13,分子量为 780. 99。棱角丝瓜式 A 是葫芦科(Cucurbitaceae)棱角丝瓜 Luffa acutangula Roxb.的全草中分离得到的一种三萜苷类化合物。现代研究表明，棱角丝瓜甙A具有免疫促进作用。体外对人淋巴细胞有增生作用。在100 Ing/mL浓度时，对人体T淋巴细胞有增生作用。经检索，尚未发现适宜于大量制备棱角丝瓜甙A的工业化方法的专利或文献报 道。
发明内容
本发明的目的是提供一种棱角丝瓜甙A的提纯方法，成品棱角丝瓜甙A含量高、生产成本低，可适用于工业化生产。本发明是通过如下技术方案实现的
(1)以棱角丝瓜全草为原料，加生物酶酶解3-5天，酶解原料加6-10倍量50-65%甲醇，采用连续逆流超声提取，在超声装置的超声波作用下，提取时间30-60min，提取2_3次，提取温度50-60°C，过滤，得提取液；
(2)将提取液加入超滤膜系统，得透过液；
(3)将透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV体积百分比为65-85%的乙醇水溶液洗脱，收集目标成分，减压浓缩，得粗提物；
(4)将上述粗提物采用高速逆流色谱法进行分离纯化，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-0. 04%TFA为溶剂系统，以上相为固定相，下相为流动相，即得到高纯度的棱角丝瓜甙A。所述生物酶可选果胶酶、纤维素酶和淀粉酶中的任一种，用量为原料重量的
0.08-0. 1%。所述超声频率为40-50KHZ。所述超滤膜为中空超滤膜，材质为聚醚砜，截留分子量为2000-6000道尔顿。所述溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-0. 04%TFA的体积比为(5_8) : (11-13)(2-4):(20-24)。本发明的有益效果是采用连续逆流超声提取，提取率高，耗时短，且避免目标产品的损失，是一种低耗能环保的提取方法；聚酰胺树脂吸附洗脱，提高了产品的纯度；采用高速逆流色谱法进行棱角丝瓜甙A的分离纯化，分离能力强、分离时间短、样品损失小、产品质量闻等优点。
具体实施例方式 下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步说明。
实施例I :
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过20目筛，加16g的纤维素酶混合均匀，酶解5天，酶解原料加140L65%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为50°C，提取时间为60min，超声频率为40KHz，提取3次，过滤，合并提取液，再用5000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV85%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0.04%TFA按比例5 :11 2 :20混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为850rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25°C，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为98. 2%。实施例2:
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过40目筛,加20g的果胶酶混合均勻，酶解4天,酶解原料加120L50%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为60°C，提取时间为40min，超声频率为45KHz，提取2次，过滤，合并提取液，再用6000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV65%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0. 04%TFA按比例8 13:4:24混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机,调节分离柱转速为850rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25°C，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为98. 6%。实施例3
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过20目筛，加18g的淀粉酶混合均匀，酶解3天，酶解原料加200L55%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为55°C，提取时间为60min，超声频率为50KHz，提取3次，过滤，合并提取液，再用3000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV70%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0. 04%TFA按比例7 12:3:22混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机,调节分离柱转速为820rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25°C，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为99. 0 %。
实施例4:
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过60目筛，加17g的纤维素酶混合均匀，酶解4天，酶解原料加150L60%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为55°C，提取时间为50min，超声频率为45KHz，提取3次，过滤，合并提取液，再用6000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV70%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0.04%TFA按比例6 :11 3 :23混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为820rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25°C，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为98. 4%。
实施例5:
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过40目筛，加18g的纤维素酶混合均匀，酶解4天，酶解原料加150L60%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为55°C，提取时间为30min，超声频率为45KHz，提取3次，过滤，合并提取液，再用2000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV80%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0.04%TFA按比例6 13 2 22混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为850rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25°C，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为98. 2%。
权利要求
1.一种棱角丝瓜甙A的提纯方法，其特征在于包括以下步骤 (1)以棱角丝瓜全草为原料，加生物酶酶解3-5天，酶解原料加6-10倍量50-65%甲醇，采用连续逆流超声提取，在超声装置的超声波作用下，提取时间30-60min，提取2_3次，提取温度50-60°C，过滤，得提取液； (2)将提取液加入超滤膜系统，得透过液； (3)将透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV体积百分比为65-85%的乙醇水溶液洗脱，收集目标成分，减压浓缩，得粗提物； (4)将上述粗提物采用高速逆流色谱法进行分离纯化，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-O. 04%TFA为溶剂系统，以上相为固定相，下相为流动相，即得到高纯度的棱角丝瓜甙A。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述生物酶可选果胶酶、纤维素酶和淀粉酶中的任一种，用量为原料重量的O. 08-0. 1%。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述超声频率为40-50KHZ。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述超滤膜为中空超滤膜，材质为聚醚砜，截留分子量为2000-6000道尔顿。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-O. 04%TFA 的体积比为(5-8) :(11-13) : (2-4) : (20-24)。
全文摘要
本方法提供一种棱角丝瓜甙A的提纯方法，其特征在于包含以下步骤(1)以棱角丝瓜全草为原料，加生物酶酶解3-5天，酶解原料加甲醇，采用连续逆流超声提取，得提取液；(2)将提取液加入超滤膜系统，得透过液；(3)将透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，乙醇水溶液洗脱，收集目标成分，减压浓缩，离心，将清液干燥，得粗提物；(4)将上述粗提物采用高速逆流色谱法进行分离纯化，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-0.04%TFA为溶剂系统，以上相为固定相，下相为流动相，即得到高纯度的棱角丝瓜甙A。本发明方法成本低、制备量大，易于放大生产。
文档编号C07H15/256GK102827242SQ20121037148
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者刘东锋, 万冬梅 申请人:南京泽朗医药科技有限公司