白蛋白制剂和用途
【专利摘要】本发明涉及一种新的白蛋白制剂、制备该白蛋白制剂的方法以及该白蛋白制剂在例如细胞培养例如哺乳动物细胞培养尤其是干细胞培养中的用途。
【专利说明】白蛋白制剂和用途
[0001]对序列表的引用
[0002]本申请包含电脑可读形式的序列表，其通过引用并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及一种新的白蛋白制剂以及该白蛋白制剂的用途。
【背景技术】
[0004]白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质。白蛋白已经从大量哺乳动物和鸟类中得到描述和表征。白蛋白被认为在保持正确的渗透压方面发挥作用，也在血流中各种化合物的运输方面发挥作用。白蛋白是用于治疗患有严重烧伤、休克或失血的患者的蛋白质。其也用作药物学活性化合物的赋形剂，其中很多需要稳定，从而例如减少白蛋白的可溶聚集物和/或不可溶聚集物的形成。而且，白蛋白用来补充使包括干细胞的高等真核細胞生长的介质。白蛋白融合蛋白是蛋白与白蛋白或其变体或片段的融合体，并且可以增加或降低蛋白质的半衰期，例如增加体内半衰期。缀合配偶体，例如，蛋白质或化学品，可以与白蛋白缀合以增加或降低缀合配偶体的半衰期，例如，增加体内半衰期。目前，白蛋白从血液制品诸如血清`中获得，或在微生物诸如酵母中以重组方式生产(例如，W096/37515、W02000/044772)或从转基因植物或动物中生产。通常，白蛋白从生产源纯化而来，以提供足够纯以满足使用者的需求和/或达到产品的高收率的产品。在一些【技术领域】中，比如细胞培养或制药中，期望产品基本不含或完全不含动物来源的成分。
[0005]最终液体形式的纯化白蛋白相对不稳定(与固体形式的白蛋白比)，因此为使其保存期限最大化，或将其冻干和/或将稳定剂加入到最终液体制剂中。但是，冻干法会显著增加制备的总成本且对于最终使用者不方便，即，如果他们需要液体产品，需要将冻干的产品进行再混悬。对于优选的液体产品，通常加入到白蛋白中的稳定剂是N-乙酰-色氨酸、辛酸(辛酸酯、辛酸盐)和/或聚山梨醇酯SO (例如吐温Wi)。WO2OOOA)44772的白蛋白通过辛酸而稳定。Arakawa&Kita (2000)已公开辛酸盐(酯)和乙酰基色氨酸酯对于牛血清白蛋白的热引发聚集的稳定效果(Biochimica et Biophysica Actal479:32-36)。Hosseini等(2002)已公开经由辛酸盐(酯)和乙酰基色氨酸酯的热处理人白蛋白的稳定的研究(Iranian Biomedical Journal6(4):135-140)。
[0006]本发明人已经意识出，辛酸对于哺乳动物细胞培养尤其是干细胞培养有害。而且，聚山梨醇酯80 (吐温? )对哺乳动物细胞培养有害。需要的是对于哺乳动物细胞培养无害的白蛋白的稳定液体制剂。
【发明内容】
[0007]本发明提供具有改善的稳定性的白蛋白液体制剂，其中稳定性被示为例如制剂中白蛋白的降低水平的可溶聚集物或不可溶聚集物。本发明也提供使用该制剂的方法，以及该制剂的用途，例如哺乳动物培养，特别是干细胞培养。【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1示出pH和N-乙酰基色氨酸浓度对于白蛋白组合物(10mg/mL)的稳定性的影响，通过对可见(不可溶)聚集物的测量，经吸光度(A350)增加0.1个吸光度单位(AU)所用的时间(秒)而确定。
[0009]图2示出pH和磷酸盐浓度对于白蛋白组合物(10mg/mL)的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0010]图3示出pH和钠浓度对于白蛋白组合物(10mg/mL)的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0011]图4示出pH和钠浓度(对于较大范围的钠浓度)对于白蛋白组合物(10mg/mL)的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0012]图5示出pH和钠浓度对于白蛋白组合物(50mg/mL)的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0013]图6示出pH6.5下钠浓度和白蛋白浓度对于白蛋白组合物的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0014]图7示出40°C孵育14天的白蛋白组合物中钠浓度与单体相对含量(％)之间的关系。
[0015]图8示出40° C孵育14天的白蛋白组合物中钠浓度与多聚体相对含量(％)之间的关系。
[0016]图9示出根据本发明的白蛋白制剂的脂肪酸分布。
[0017]图10示出根据本发明的白蛋白制剂的由ICP-OES测定的金属离子分布。
[0018]图11示出钠浓度和白蛋白浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由40°C孵育4周之后的剩余单体含量确定。
[0019]图12示出阳离子种类和阳离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.2个AU所用的时间(秒)而确定。
[0020]图13示出钠离子浓度和阴离子种类对于白蛋白的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0021]图14示出钠离子浓度和阴离子种类对于白蛋白的稳定性的影响，由65°C孵育2小时后的剩余单体含量确定。
[0022]图15示出在不同缓冲液阴离子的存在下，钠离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，其中包含来自NaCl和缓冲液两者的钠的作用，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0023]图16示出在不存在缓冲离子或存在50mM柠檬酸盐作为缓冲离子时钠离子浓度对白蛋白的稳定性的影响，其中忽略来自柠檬酸钠缓冲液的钠离子的作用，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0024]图17示出钠离子浓度对不同白蛋白以及白蛋白变体的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0025]图18示出钠离子浓度对小鼠血清白蛋白的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。[0026]图19示出pH和钠离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0027]图20示出pH5.0下钠离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由吸光度(A350)增加0.1个AU所用的时间(秒)而确定。
[0028]图21示出pH7.0、7.5和8.0下钠离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由65°C孵育2小时后的剩余单体含量而确定。
【具体实施方式】[0029]定义
[0030]术语“细胞培养介质”、“培养介质”和“介质制剂”是指培养细胞或使细胞生长的
营养液。
[0031] “无血清”介质是不含血清(例如，胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清、或任何其他本领域技术人员已知的动物来源血清)的介质。
[0032]术语“基础培养介质”是指任何能够支持细胞生长的介质。基础介质供应标准无机盐，例如锌、铁、镁、钙和钾，以及微量元素、维生素、能源、缓冲系统、和必需氨基酸。合适的基础介质包括但不限于a -最低必需培养基(.alpha.MEM) ；Eagle基础培养基(BME);含有Earle’s平衡盐溶液(BSS)的Eagle基础培养基；DME/F12 ;含有L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基；不含L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基；含有L-谷氨酰胺的DMEM:F121:1 ^ulbecco's改良Eagle’s培养基(DMEM);F-10 ;F_12 ;Glasgow’ s最小必需培养基(G-MEM);含有L-谷氨酰胺的G-MEM ;Grace’ s完全昆虫培养基；不含FBS的Grace’s昆虫培养基；含有L-谷氨酰胺的Ham’s F-1O ;含有L-谷氨酰胺的Ham’ sF-12 ;含有HEPES和L-谷氨酰胺的MDM ;含有HEPES且不含L-谷氨酰胺的MDM ;IPL_41昆虫培养基；Iscove’ s改良Dulbecco’s培养基；不含L-谷氨酰胺的L-15 (Leibovitz);不含L-谷氨酰胺或酹红的L_15 (Leibovitz) (2X)；McCoy’ s5A改良培养基；培养基199 ;不含L-谷氨酰胺或酚红的MEM Eagle(2X);含有L-谷氨酰胺的 MEMEagle-Earle’ s BSS ;不含 L-谷氨酰胺的 MEM Eagle-Earle’ BSS ;不含 L-谷氨酰胺的MEM Eagle-Hanks BSS ;最低必需培养基(MEM);最低必需培养基-a (MEM-a )；含有L-谷氨酰胺的NCTC-109 ;含有L-谷氨酰胺的Richter’s CM培养基；RPMI1640 ;含有L-谷氨酰胺的RPMI1640 ;不含L-谷氨酰胺的RPMI1640 ;含有HEPES、L_谷氨酰胺和/或青霉素-链霉素的RPMI1640 ;Schneider’ s昆虫培养基；或任何其他本领域技术人员已知的培养基。用于干细胞培养的优选基础介质包括MEF、DMEM、CTSjP DMEM/F-12。
[0033]术语“白蛋白”是指与人血清白蛋白(HSA)或HSA结构域具有相同和/或非常相似的三级结构并具有HSA或相关结构域的相似特性的蛋白质。相似的三级结构是例如在亲本白蛋白下提到的物种的白蛋白的结构。白蛋白的一些主要特性是i)其调节血浆容量的能力，ii)约19天±5天的较长血浆半衰期，iii)配体结合，例如，内源分子诸如包括胆红素脂肪酸、氯化血红素和甲状腺素的酸性亲脂性化合物的结合(另参见Kragh-Hansen等人，2002，Biol.Pharm.Bull.25，695的表1，通过引用的方式并入)，iv)具有酸性或带负电特性的有机小化合物的结合，例如药物，如华法林、安定、布洛芬和紫杉醇(另参见Kragh-Hansen等人，2002，Biol.Pharm.Bull.25,695的表1，通过引用的方式并入)。不是所有这些特性都需要满足以将蛋白质或片段表征为白蛋白。例如，如果片段不包含负责特定配体或有机化合物的结合的结构域，则该片段的变体也不预期具有这些特性。术语白蛋白包括变体、和/或衍生物诸如白蛋白或白蛋白变体的融合体和/或缀合物。
[0034]术语“变体”是指得自亲本白蛋白的在一个或多个(数个)位置处包含改变(即取代、插入、和/或缺失)的多肽。取代是指用不同的氨基酸来取代占据位置的氨基酸；缺失是指去除占据位置的氨基酸；而插入是指增加与占据位置的氨基酸相邻的I~3个氨基酸。改变的多肽(变体)可以经人工干预通过修改编码亲本白蛋白的多核苷酸序列而获得。变体白蛋白优选与SEQ ID NO: 2至少70%，优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同，并保持至少一个亲本白蛋白的主要特性或如HSA的相似三级结构。出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件包)，Rice等人，2000，Trends Genet.16:276-277)(优选5.0.0或更新版本)的 Needle 程序中执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman and Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)，来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是，空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)替换矩`阵。Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项得到的)被用作百分比同一性并计算如下:(相同残基X 100) / (比对长度-比对中的空位总数)。
[0035]当与亲本白蛋白相比时，变体可以拥有改变的对FcRn的结合亲和性和/或改变的跨内皮、上皮细胞和/或间皮单细胞层的胞转速率。变体多肽序列优选为在自然界没有发现的一个多肽序列。变体包括，例如，包含白蛋白的至少100、150、200、250、300、350、450、500,550个相邻氨基酸或由其组成的片段。
[0036]术语“野生型”(WT)白蛋白是指与天然发现于动物或人中的白蛋白具有相同的氨基酸序列的白蛋白。SEQ ID NO:2是得自智人的野生型白蛋白的实例。
[0037]术语“亲本”或“亲本白蛋白”是指对其做出改变以产生可以用在本发明中的白蛋白变体的白蛋白。亲本可以为天然发现的(野生型)多肽或其等位基因或其变体，例如PCT/EP2010/066572中描述的变体或PCT/EP2011/055577中描述的变体或衍生物。
[0038]术语“融合体”是指白蛋白(或其变体或其片段)与非白蛋白蛋白的基因融合体。非白蛋白蛋白可以是治疗性的、预防性的、或诊断性的蛋白。白蛋白融合体的实例提供在 EP624195、W02001/07927U W02003/059934, W02003/06007U W02011/051489、PCT/EP11/055577和EP11164955中(其全部内容通过引用的方式合并入本文)。
[0039]术语“缀合物”是指化学缀合有非白蛋白部分的白蛋白(或其变体或片段或融合体)。非白蛋白部分可以是治疗性的、预防性的、或诊断性的蛋白。白蛋白缀合物的实例提供在PCT/EP11/055577和EPl1164955中(其全部内容通过引用的方式合并入本文)。
[0040]术语“悬浮培养”是指培养中的细胞，其中多数或所有培养中的细胞以悬浮存在，且培养容器中少数或没有细胞附着到容器表面或容器内的另一表面(贴壁细胞)。“悬浮培养”可以有多于约50%、60%、65%、75%、85%、或95%的没有附着到在培养容器上或中的表面。[0041 ] 术语“贴壁培养”是指培养中的细胞，其中存在多数或所有培养中的细胞附着到容器表面或容器内的另一表面，且培养容器中少数细胞或没有细胞处于悬浮。“贴壁培养”可以有多于50%、60%、65%、75%、85%、或95%的贴壁细胞。
[0042]如本文所用到的，术语“哺乳动物”包括任何人类或非人类哺乳动物，非人类哺乳动物包括但不限于猪科、绵羊、牛科、啮齿目、有蹄类、猪、羊、羔羊、山羊、牛、鹿、骡子、马、灵长类(例如猴子)、狗、猫、大鼠和小鼠。
[0043]术语“细胞”包括任何细胞，例如但不限于，本文所述的任何人类或非人类哺乳动物细胞。细胞可以是常规细胞或非常规细胞(例如转化的细胞、确立细胞、或得自病变组织样本的细胞)。细胞可以是体细胞，比如成纤维细胞或角化细胞。优选的细胞为干细胞，例如但不限于胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞和多能干细胞诸如诱导的多能干细胞。特别优选的细胞为人胚胎干细胞、人胎儿干细胞、人成体干细胞和人多能干细胞诸如诱导的人多能干细胞。
[0044]本发明的第一个方面提供组合物，包含白蛋白、溶剂、至少175mM的阳离子，具有约5.0~约9.0的pH，其中，组合物包含等于或少于30mM的辛酸盐(酯)。该组合物的优点是，制剂提供的白蛋白为足够稳定以具有有利的保存期限并在用于哺乳动物细胞培养时对哺乳动物细胞的健康无害(例如，无毒)。
[0045]优选组合物包含阴离子，以平衡阳离子。
[0046]溶剂可以是无机溶剂例如水或无机缓冲液例如磷酸盐缓冲液如磷酸钠、磷酸钾，或有机缓冲液例如醋酸钠或柠檬酸钠。缓冲液可以稳定pH。磷酸钠(例如NaH2PO4)是优选的 pH 缓冲液，诸如 pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0。
[0047]当前的发明人已经观察到，辛酸盐(酯)对细胞培养中的哺乳动物细胞有害。因此，组合物包含低水平的辛酸盐(酯)。例如，优选组合物包含少于30mM的辛酸盐(酯)，更优选少于约28、26、24、22、20、18、16、15、14、12、10、8mM的辛酸盐(酯)，甚至更优选少于约6、5、4、3mM的辛酸盐(酯)，更优选少于约2、1、0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.01、或0.0OlmM的辛酸盐(酯)。优选组合物基本不含辛酸盐(酯)。换言之，优选组合物中辛酸盐(酯)的水平不足以引起培养过程中对细胞的有害影响，例如对细胞培养诸如体外细胞培养中的哺乳动物细胞(尤其干细胞诸如人干细胞)的有害影响。最优选地，组合物不含辛酸盐(酯)(OmM的辛酸盐(酯))。
[0048]脂肪酸的优选参数提供如下。脂肪酸的含量优选为多个样本例如2、3、4或5个样本的平均值:
[0049]
【权利要求】
1.一种组合物，包含白蛋白、溶剂、至少200mM阳离子，且具有约5.0~约8.0的pH，其中，所述组合物包含少于或等于5mM的辛酸盐(酯)。
2.根据权利要求1所述的组合物，包含少于或等于ImM的辛酸盐(酯)。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述阳离子以200~1000mM存在。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述阳离子以200~350mM存在。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的组合物，其中，所述pH为约6.0~约7.0。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的组合物，其中，所述pH为约6.5。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子选自钠、钾、钙、镁、和铵。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子是钠离子。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的组合物，其包含: (a)少于5mM的氨基酸(例如N-乙酰基色氨酸)，优选少于ImM的氨基酸；和/或(b)少于20mg? L—1的洗涤剂(例如聚山梨醇酯80)，优选少于5mg.L—1的洗涤剂。
10.根据权利要求8所述的组合物，其基本不含氨基酸(例如N-乙酰基色氨酸)和/或基本不含洗涤剂(例如聚山梨醇酯80)。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的组合物，其中，所述白蛋白、变体或衍生物是白蛋白或白蛋白变体的融合体或缀合物。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的组合物，其中，所述白蛋白处于Ig? L—1~400g ? L-1的浓度。
13.根据权利要求1~12中任一项所述的组合物，其中，所述白蛋白是重组白蛋白。
14.根据权利要求1~13中任一项所述的组合物，其包含: (a)50~250g ? I/1的白蛋白；
(b)225 ~275mM 的 Na+ ； (c)20~30mM的磷酸盐； 且具有约6.5的pH，其中，所述组合物包含少于2mM的辛酸盐(酯)。
15.根据权利要求1~14中任一项所述的组合物，其基本不含辛酸盐(酯)。
16.一种细胞培养介质，包含任一前述权利要求所述的组合物以及基础培养基。
17.根据权利要求16所述的细胞培养介质，其中，所述细胞培养介质是干细胞培养介质。
18.根据权利要求16或17所述的细胞培养介质，其中，所述细胞培养介质基本不含动物来源的成分。
19.权利要求1~15中任一项所述的组合物或权利要求16~18中任一项所述的细胞培养介质在培养细胞中的的用途。
20.一种培养细胞的方法，包括在权利要求16~18中任一项所述的细胞培养介质中孵育细胞。
21.根据权利要求19或20所述的用途或方法，其中，所述细胞包括干细胞。
【文档编号】C07K14/435GK103649111SQ201280033592
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年7月5日 优先权日:2011年7月5日
【发明者】S·M·默克尔, L·迪马西, C·A·希尔汉, P·H·莫顿 申请人:诺维信生物制药丹麦公司