靶向间皮素的重组免疫毒素的制作方法
【专利摘要】间皮素是一种存在于卵巢癌、间皮瘤和几种其它类型的人癌症的表面上的分化抗原。由于在正常组织间，间皮素仅存在于间皮细胞上，它代表一种用于抗体介导的细胞毒剂投递的良好靶物。本发明涉及改善的重组免疫毒素，其包含抗间皮素抗体(包括对间皮素具有特别高的亲和力的Fv分子)和假单胞菌外毒素模块，该假单胞菌外毒素模块已经修饰为降低其免疫原性和蛋白酶敏感性，并且对表达间皮素的细胞提供较好的细胞毒性。RIT非常适合于治疗表达间皮素的卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、间皮瘤和其它恶性细胞。
【专利说明】靶向间皮素的重组免疫毒素
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年5月6日提交的美国临时专利申请系列号61/483531的优先权权益，并且其通过全文提述并入本文。
[0003]关于在联邦资助的研究和开发下得到的发明的权利的声明不适用。
[0004]参考光盘上提交的“序列表”、表或计算机程序表附录不适用。
[0005]发明背景
[0006]重组免疫毒素(RIT)是组合抗体片段与源自细菌或植物来源的细胞毒性蛋白的工程化治疗性蛋白质。RIT设计成选择剂，用于在没有多种与化学治疗策略有关的继发毒性的情况下靶向消除细胞。用于治疗癌症的RIT可以通过融合针对肿瘤关联细胞表面抗原的抗体的可变片段(Fv)与假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A(PE)的片段来构建。使用假单胞菌外毒素A的38-kDa截短(PE38)得到的RIT已经在临床试验中获得值得注意的成功，但是具有限制，其包括较差的实体瘤穿透、高免疫原性、和非特异性毒性(Kreitman RJ 等，Clin Cancer Res.，15(16): 5274-9 (2009; Hassan R等,Clin Cancer Res.，13(17):5144-9(2007);Wayne AS 等,Clin Cancer Res., 16 (6):1894-903(2010);Kreitman RJ 等，J Clin Oncol., 27(18):2983-90(2009);Sampson JH 等，Neuro Oncol., 10(3):320-9(2008) ; Powell DJ Jr 等，J Immunol., 179 (7): 4919-28(2007);Kreitman RJ, J Clin Oncol.,23(27):6719-29(2005);Pal LH 等，NatMed.,2(3):350-3(1996))。
[0007]为了改善用RIT治疗的结果，PE中毒途径的知识对于了解这些蛋白质的设计是重要的。RIT经由受体介导的胞吞及通过内溶酶体系统运输到高尔基(Golgi)(在那里，它们经历逆向转运至内质网(ER))被内在化。在此运输阶段期间，毒素经由二硫键的还原及PE38中某个位点处蛋白酶弗林蛋白酶的切割(其分开Fv与PE片段)而活化。随后，活化的PE必须移位到胞质溶胶中，在那里，它进行ADP核糖基化并且使延长因子2 ( —种翻译装置必需的组分)失活。这使蛋白质合成停止，并且最终导致细胞死亡(关于PE中毒途径的综述，参见9)。先前设计为改善基于PE的RIT的细胞毒性活性的策略包括用规范的ER 保留信号 KDEL (SEQ ID NO: 16)取代 PE 的 C 端残基 REDLK (SEQ ID NO: 15)(见 tharamS 等，J Biol Chem.，266(26):17376-81(1991);Du X, Ho M, and Pastan I, J lmmunother.,30(6):607-13(2007) ; Rozemuller H.等，Int J Cancer., 92 (6): 861-70 (2001) ; Kreitman RJ and Pastan 1., Biochem J.，307 (Ptl): 29-37 (1995))。已知此变化增强 PE 的细胞毒性，据推测其通过改善从高尔基逆向转运到ER的效率实现。此策略是有效的，但是通常也增强RIT的非特异性毒性。另一种策略是通过改善Fv与其靶物之间的亲和力来增强RIT受体复合物的有效的内在化，并且由此增加细胞中的毒素量(Salvatore G等，Chn CancerRes.，8 (4):995-1002 (2002);Decker T 等，Blood.，103 (7):2718-26(2004))。
[0008]新近，蛋白酶抗性RIT已经设计为经受住内溶酶体系统中的降解，所述系统为有效免疫毒素治疗的潜在障碍(Johannes L 和 Decaudin D, Gene Ther.，12 (18): 1360-8 (2005) ; Fitzgerald D.Why toxins Semin Cancer Biol.，7 (2): 87-95 (1996))。此“溶酶体降解抗性”(LR)变体RIT通过除去PE38的蛋白酶敏感性区域，并用源自RIT HA22的高亲和力抗 CD22Fv 将其靶向至 B 细胞 CD22 受体来产生(Weldon JE, Blood.，113(16):3792-800(2009)) IR突变没有严重影响对细胞系的体外活性，但是在小鼠中极大地降低非特异性毒素，而且在体外显著增强对患者衍生的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的活性。另外，LR变体消除两种主要的小鼠B细胞表位组(Onda M等，J Immunol.，177 (12): 8822-34 (2006))和来自PE38的抗原加工位点，这有助于降低其在小鼠中的免疫原性(Hansen JK等，J Immunother.，33 (3): 297-304 (2010))。由于RIT的模块性质，可以通过用一种Fv交换另一种将PE的LR变体靶向至其它肿瘤相关抗原。因而，公开PE的II和Ib域的减少的技术一般教导从分子除去蛋白酶敏感性和抗原性位点的优点。此技术一般还教导源自这些变化的较小RIT的药动学优点。
[0009]一种临床相关靶候选物是肿瘤相关抗原间皮素，其经常在癌症中高度表达，所述癌症包括间皮瘤和肺、卵巢和胰腺癌。因而，需要改善的RIT，其特异性靶向在其表面上表达间皮素的癌细胞。本发明通过提供治疗表达或过表达间皮素的癌症的RIT、药物组合物、和方法为这些和其它需要做准备。
[0010]发明概述
[0011]本发明提供了具有降低的免疫原性、改善的对溶酶体蛋白酶的抗性、和改善的针对表达间皮素的细胞的细胞毒性的改善的假单胞菌外毒素A( “PE”)。在结构上，本发明的改善的PE将PE的I域除去，将PE的II域的大部分除去，并且具有功能性PE III域，任选地，其具有a)用甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸对PE III域氨基酸残基位置D406，R432，R467，R490，R513，E548，K590和/或Q592的取代和/或b)用甘氨酸、丝氨酸、或丙氨酸对PE III域氨基酸残基位置 D403, R412, R427, E431, R458, D461, R505, E522, R538, R551, R576 和 /或L597的取代。改善在于插入 短的且柔性的肽接头(“FL”)，其长度为3至8个氨基酸且由改善的PE的弗林蛋白酶切割位点和功能性PE III域之间的序列中的甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。因而，短接头由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。在一些实施方案中，接头是下式的肽:(Xaal)n，其中每个Xaal独立选自甘氨酸和丝氨酸，且η是3至8。本发明的改善的PE分子在除去B细胞表位的情况下保留高细胞毒性活性。令人惊讶地，短的柔性接头的纳入在不实质性改变弗林蛋白酶对分子切割的情况下改善分子的细胞毒性。改善的PE分子以本文称为(LR/FL/8X, SEQ ID NO:4)和LR/FL/8M(SEQ ID NO:5)的本发明具体实施方案例示。另外，有如下的实施方案，其中与SEQ ID NO:1的PE的功能域相比，PE分子在其功能域III中具有一处或多处突变，如SEQ ID Ν0:4或5中找到的。在别的实施方案中，在与SEQ ID NO:1的609-613对应的一个或多个残基中有额外的取代，涵盖的是其也具有天然序列的内质网保留功能。在又一些实施方案中，将PE II域弗林蛋白酶切割位点修饰或用另一种弗林蛋白酶切割位点取代。
[0012]在一些实施方案中，进一步与上述任何内容一致，PE包含功能域III，其具有一处或多处对SEQ ID NO: 2的PE毒素的功能域(位置12至230)或选自下表的突变，其除去PEIII域的一个或多个表位:
[0013]表2
[0014]
【权利要求】
1.一种嵌合分子，其包含具有式M-Ll-FCS-FL-功能性PE域III的融合多肽，其中 M是特异性结合间皮素的抗体，或其特异性结合间皮素的片段； LI由I至10个连续的氨基酸残基组成； FCS是弗林蛋白酶切割位点，其由能够被弗林蛋白酶切割的连续氨基酸残基组成； FL由3至8个连续的氨基 酸残基组成，所述氨基酸残基独立选自甘氨酸和丝氨酸； 功能性PE域III由在序列上与SEQ ID NO:1从位置395至613相同的连续氨基酸残基组成，任选地，所述连续氨基酸残基包含(i)与SEQ ID NO:1的609-613对应的一个或多个残基的取代，(ii)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸对与SEQ ID NO:1的位置490对应的位置处的精氨酸的取代，(iii)与SEQ ID NO:1的残基对应的一个或多个残基的取代，所述SEQ ID NO:1的残基维持PE域III的表位或亚表位的免疫原性，或(iv)(i)-(iii)中任一项的组合。
2.权利要求1的分子，其中所述抗体是微型抗体(minibody)、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)、或二硫化物稳定化的Fv蛋白(“dsFv”)片段。
3.权利要求1的分子，其中所述抗体片段包含经由重链与LI的连接与所述分子的剩余部分融合的二硫化物稳定化的轻链和重链免疫球蛋白可变区。
4.权利要求1的分子，其中所述抗体包含: VH链，该VH链包含CDRl氨基酸序列GYTMN(SEQ ID NO: 51)、CDR2氨基酸序列LITPYNGASSYNQKFRG(SEQ ID NO:52)、和 CDR3 氨基酸序列 GGYDGRGFDY(SEQ ID NO:53)，和 Vl链，该VL链包含CDRl氨基酸序列SASSSVSYMH(SEQ ID NO:54)、CDR2氨基酸序列DTSKLAS (SEQ ID N0:55)、和选自下组的 CDR3 氨基酸序列:QQWSGYPLT(SEQ ID NO:56),QQffSKHPLT(SEQ ID NO:57), QQffSGHPLT(SEQ ID NO:58), QQffSAHPLT(SEQ ID NO:59)，QQffSQIPLT(SEQ ID NO:60), QQffGFNPLT(SEQ ID NO:61), QQffGTNPLT(SEQ ID NO:62)，QQffGSHPLT(SEQ ID NO:63), QQffGDFPLT(SEQ ID NO:64), QQffGDHPLT(SEQ ID NO:65)，QQffSAHPLT(SEQ ID NO:66)，和 QQWSGYPTT(SEQ ID NO:67)。
5.权利要求4的分子，其中所述ICDR3氨基酸序列是QQWSKHPLT(SEQ ID NO: 57)。
6.权利要求1的分子，其中LI的长度是3至5个氨基酸。
7.权利要求1的分子，其中LI是ASGG(SEQ ID NO: 19)。
8.权利要求1的分子，其中所述PE域III具有丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸对至少一个与SEQ ID NO:1中选自下组的氨基酸残基对应的氨基酸残基的取代:D403，R412，R427，E431，R458, D461, R505, E522, R538, R551, R576 和 L597。
9.权利要求1的分子，其中所述PE域III具有丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸对至少一个与SEQ ID NO:1中选自下组的氨基酸残基对应的氨基酸残基的取代:D406，R432，R467，R490，R513, E548, K590 和 Q592。
10.权利要求1 的分子，其中所述 FL 是 GGS，(GGS) 2 (SEQ ID NO: 18)，GSGG (SEQ IDNO:71)，GGSGG(SEQ ID NO:72)，GGSG(SEQ ID NO:73)，GSG，或 GGG。
11.权利要求1的分子，其中FL是GGS。
12.权利要求1的分子，其中所述弗林蛋白酶切割序列是RHRQPRGWEQL(SEQ IDNO:17)。
13.权利要求1的分子，其中所述PE功能域III是LR中具有SEQID N0:4中从位置20至237或SEQ ID NO:5中从位置20至237的氨基酸序列的PE功能域III域。
14.权利要求1的分子，其中靶向模块包含二硫化物稳定化的SSl可变轻链SEQIDNO:6和SSl可变重链序列SEQ ID NO:7。
15.权利要求1的分子，其中所述分子包含所述SSl可变轻链SEQID NO:6和所述SSl可变重链-PE融合多肽SEQ ID NO:8，其中所述可变轻链和重链形成二硫化物稳定化的抗体。
16.前述权利要求中任一项的分子，其中所述FCS在序列上与SEQID NO:1从位置274至284是相同的或者是氨基酸序列RHRSKRGWEQL(SEQ ID NO:29)。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1至16中任一项的分子和药学可接受赋形剂。
18.—种核酸,其编码权利要求1至16中任一项的分子。
19.一种载体,其包含权利要求18的核酸。
20.宿主细胞，其包含权利要求18的核酸。
21.一种在有需要的受试者中治疗过表达间皮素的癌症的方法，其包括对所述受试者施用权利要求1至16中任一项的嵌合分子。
22.权利要求21的方法，其中所述癌症是肺腺癌瘤、卵巢癌瘤、间皮瘤或和表皮样癌瘤。
23.一种具有式FCS-FL-PE功能域III的融合多肽，其中: FCS由在序列上与SEQ ID NO:1从位置274至284相同的连续氨基酸残基组成或者由氨基酸序列 RHRSKRGWEQL(SEQ ID NO: 17)组成； FL由3至8个连续的氨基酸残基组成，所述连续的氨基酸残基独立选自甘氨酸和丝氨酸； PE功能域III由在序列上与SEQ ID NO:1从位置395至613相同的连续氨基酸残基组成，任选地，所述连续氨基酸残基包含(i)与SEQ ID NO:1的609-613对应的一个或多个残基的取代，(ii)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸对与SEQ ID NO:1的位置490对应的位置处的精氨酸的取代，(iii)与SEQ ID NO:1的残基对应的一个或多个残基的取代，所述SEQ ID NO:1的残基维持PE域III的表位或亚表位的免疫原性，或(iv) (i)-(iii)中任一项的组合。
24.一种核酸，其编码权利要求19的多肽。
【文档编号】C07K14/21GK103648525SQ201280033583
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年5月4日 优先权日:2011年5月6日
【发明者】I.H.帕斯坦, J.维尔顿, R.比尔斯 申请人:由卫生与公共服务部部长代表的美国政府